Name: a model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium
Uploaded: 2021-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). אדריאנה קמפוס היא דוקטורנטת ב-Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, באוניברסיטת נאסיונאל אוטונומה דה מקסיקו, ונתמכה על ידי קונאסיאט (CVU: 1002502).

1. הכנה בינונית סטנדרטית ומותנית
<ol><li>כדי להכין RPMI 1640 סטנדרטי, תוספת RPMI 1640 תרבות בינוני עם 10% (v/ v) של סרום בקר עוברי (FBS, בעבר חום מומת) ו 1% (v/v) של פתרון פניצילין-סטרפטומיצין. לאחסן את המדיום ב 4 °C.עיקור באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>להכנת פתרון מלאי פלמיטט, להכין פתרון 50 mM של פלמיטט RPMI 1640 סטנדר...

<ol>
	<li>Younossi, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease+-+a+global+public+health+perspective.">Non-alcoholic fatty liver disease - a global public health perspective.</a> Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).</li><li>Younossi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+perspectives+on+nonalcoholic+fatty+liver+disease+and+nonalcoholic+steatohepatitis.">Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 69 (6), 2672-2682 (2019).</li><li>Eslam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+definition+for+metabolic+dysfunction-associated+fatty+liver+disease:+An+international+expert+consensus+statement.">A new definition for metabolic dysfunction-associated fatty liver disease: An international expert consensus statement.</a> Journal of Hepatology. 73 (1), 202-209 (2020).</li><li>Eslam, M., Sanyal, A. J., George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAFLD:+A+consensus-driven+proposed+nomenclature+for+metabolic+associated+fatty+liver+disease.">MAFLD: A consensus-driven proposed nomenclature for metabolic associated fatty liver disease.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1999-2014 (2020).</li><li>Chalasani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diagnosis+and+management+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease:+Practice+guidance+from+the+American+association+for+the+study+of+liver+diseases.">The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American association for the study of liver diseases.</a> Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).</li><li>Calzadilla Bertot, L., Adams, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+course+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">The natural course of non-alcoholic fatty liver disease.</a> International Journal of Molecular Science. 17 (5), 774 (2016).</li><li>Reccia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease:+A+sign+of+systemic+disease.">Non-alcoholic fatty liver disease: A sign of systemic disease.</a> Metabolism. 72, 94-108 (2017).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+cholesterol+accumulation+in+hepatic+stellate+cells:+Mechanism+of+liver+fibrosis+aggravation+in+nonalcoholic+steatohepatitis+in+mice.">Free cholesterol accumulation in hepatic stellate cells: Mechanism of liver fibrosis aggravation in nonalcoholic steatohepatitis in mice.</a> Hepatology. 59 (1), 154-169 (2014).</li><li>Byrne, C. D., Targher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nafld:+A+multisystem+disease.">Nafld: A multisystem disease.</a> Journal of Hepatology. 62, 47-64 (2015).</li><li>Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+hepatic+lipid+accumulation+in+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">Molecular mechanisms of hepatic lipid accumulation in non-alcoholic fatty liver disease.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (18), 3313-3327 (2018).</li><li>Diehl, A. M., Day, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause,+pathogenesis,+and+treatment+of+nonalcoholic+steatohepatitis.">Cause, pathogenesis, and treatment of nonalcoholic steatohepatitis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oleic+acid+ameliorates+palmitic+acid+induced+hepatocellular+lipotoxicity+by+inhibition+of+ER+stress+and+pyroptosis.">Oleic acid ameliorates palmitic acid induced hepatocellular lipotoxicity by inhibition of ER stress and pyroptosis.</a> Nutrition and Metabolism. 17, 11 (2020).</li><li>Ore, A., Akinloye, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+antioxidant+biomarkers+in+clinical+and+experimental+models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress and antioxidant biomarkers in clinical and experimental models of non-alcoholic fatty liver disease.</a> Medicina (Kaunas). 55 (2), 26 (2019).</li><li>Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+cardiolipin+and+mitochondrial+dysfunction+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Oxidative stress, cardiolipin and mitochondrial dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (39), 14205-14218 (2014).</li><li>Aravinthan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+senescence+predicts+progression+in+non-alcohol-related+fatty+liver+disease.">Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease.</a> Journal of Hepatology. 58 (3), 549-556 (2013).</li><li>Gomez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+hepatocellular+in+vitro+model+to+investigate+steatosis.">A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis.</a> Chemico Biological Interactions. 165 (2), 106-116 (2007).</li><li>Wu, W. K. K., Zhang, L., Chan, M. T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+NAFLD+and+NAFLD-related+HCC.">Autophagy, NAFLD and NAFLD-related HCC.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1061, 127-138 (2018).</li><li>Levy, G., Cohen, M., Nahmias, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+culture+models+of+hepatic+steatosis.">In vitro cell culture models of hepatic steatosis.</a> Methods in Molecular Biology. 1250, 377-390 (2015).</li><li>Kanuri, G., Bergheim, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+(NAFLD).">In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).</a> International Journal of Molecular Science. 14 (6), 11963-11980 (2013).</li><li>Ricchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+lipid+accumulation+and+apoptosis+in+cultured+hepatocytes.">Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+biomarkers+of+de+novo+lipogenesis+fatty+acids+and+incident+heart+failure+in+older+adults:+The+cardiovascular+health+study.">Serial biomarkers of de novo lipogenesis fatty acids and incident heart failure in older adults: The cardiovascular health study.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (4), 014119 (2020).</li><li>Alnahdi, A., John, A., Raza, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmentation+of+glucotoxicity,+oxidative+stress,+apoptosis+and+mitochondrial+dysfunction+in+Hepg2+cells+by+palmitic+acid.">Augmentation of glucotoxicity, oxidative stress, apoptosis and mitochondrial dysfunction in Hepg2 cells by palmitic acid.</a> Nutrients. 11 (9), 1979 (2019).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oleic+acid+protects+saturated+fatty+acid+mediated+lipotoxicity+in+hepatocytes+and+rat+of+non-alcoholic+steatohepatitis.">Oleic acid protects saturated fatty acid mediated lipotoxicity in hepatocytes and rat of non-alcoholic steatohepatitis.</a> Life Sciences. 203, 291-304 (2018).</li><li>Xing, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+inflammasome+mediate+palmitate-induced+endothelial+dysfunction.">NLRP3 inflammasome mediate palmitate-induced endothelial dysfunction.</a> Life Sciences. 239, 116882 (2019).</li><li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+Growth+Factor+Binding+Protein+7+accelerates+hepatic+steatosis+and+insulin+resistance+in+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">Insulin-like Growth Factor Binding Protein 7 accelerates hepatic steatosis and insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 46 (12), 1101-1110 (2019).</li><li>Wang, J., Hu, R., Yin, C., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tanshinone+IIA+reduces+palmitate-induced+apoptosis+via+inhibition+of+endoplasmic+reticulum+stress+in+Hepg2+liver+cells.">Tanshinone IIA reduces palmitate-induced apoptosis via inhibition of endoplasmic reticulum stress in Hepg2 liver cells.</a> Fundamental and Clinical Pharmacology. 34 (2), 249-262 (2020).</li><li>Xiao, Z., Chu, Y., Qin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGFBP5+modulates+lipid+metabolism+and+insulin+sensitivity+through+activating+ampk+pathway+in+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">IGFBP5 modulates lipid metabolism and insulin sensitivity through activating ampk pathway in non-alcoholic fatty liver disease.</a> Life Sciences. 256, 117997 (2020).</li><li>Avila, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+effects+of+conjugated+linoleic+acid+(CLA)+on+inflammatory+functions+of+bovine+monocytes.">In vitro effects of conjugated linoleic acid (CLA) on inflammatory functions of bovine monocytes.</a> Journal of Dairy Science. 103 (9), 8554-8563 (2020).</li><li>Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+fatty+acids+induce+JNK-dependent+hepatocyte+lipoapoptosis.">Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 12093-12101 (2006).</li><li>Oh, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+palmitic+acid+on+TNF-alpha-induced+cytotoxicity+in+SK-Hep-1+cells.">Effects of palmitic acid on TNF-alpha-induced cytotoxicity in SK-Hep-1 cells.</a> Toxicology In Vitro: An International Journal Published in Association with BIBRA. 26 (6), 783-790 (2012).</li><li>Stellavato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+nutraceutical+compounds+and+novel+nutraceutical+formulations+in+a+liver-steatosis-based+model.">In vitro assessment of nutraceutical compounds and novel nutraceutical formulations in a liver-steatosis-based model.</a> Lipids in Health and Disease. 17 (1), 24 (2018).</li><li>Pachikian, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+trans-11,+trans-13+conjugated+linoleic+acid+in+the+development+of+hepatic+steatosis.">Implication of trans-11, trans-13 conjugated linoleic acid in the development of hepatic steatosis.</a> PLoS One. 13 (2), 0192447 (2018).</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyze.">Analyze.</a> ImageJ User Guide. , 132-135 (2012).</li><li>Geng, Y., Wu, Z., Buist-Homan, M., Blokzijl, H., Moshage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hesperetin+protects+against+palmitate-induced+cellular+toxicity+via+induction+of+GRP78+in+hepatocytes.">Hesperetin protects against palmitate-induced cellular toxicity via induction of GRP78 in hepatocytes.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 404 (2020).</li><li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+metformin+against+palmitate-induced+hepatic+cell+death.">Protective effect of metformin against palmitate-induced hepatic cell death.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1866 (3), 165621 (2020).</li><li>Sarnyai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cis-+and+trans-monounsaturated+fatty+acids+on+palmitate+toxicity+and+on+palmitate-induced+accumulation+of+ceramides+and+diglycerides.">Effect of cis- and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (7), 2626 (2020).</li><li>Chen, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrahydrocurcumin+ameliorates+free+fatty+acid-induced+hepatic+steatosis+and+improves+insulin+resistance+in+HepG2+cells.">Tetrahydrocurcumin ameliorates free fatty acid-induced hepatic steatosis and improves insulin resistance in HepG2 cells.</a> Journal of Food and Drug Analysis. 26 (3), 1075-1085 (2018).</li><li>Burhans, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+oleate+regulates+adipose+tissue+lipogenesis+and+fatty+acid+oxidation.">Hepatic oleate regulates adipose tissue lipogenesis and fatty acid oxidation.</a> Journal of Lipid Research. 56 (2), 304-318 (2015).</li><li>Abenavoli, L., Milanovic, M., Milic, N., Luzza, F., Giuffre, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olive+oil+antioxidants+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease.">Olive oil antioxidants and non-alcoholic fatty liver disease.</a> Expert Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 13 (8), 739-749 (2019).</li><li>Nagarajan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+and+glucose+metabolism+in+hepatocyte+cell+lines+and+primary+mouse+hepatocytes:+A+comprehensive+resource+for+in+vitro+studies+of+hepatic+metabolism.">Lipid and glucose metabolism in hepatocyte cell lines and primary mouse hepatocytes: A comprehensive resource for in vitro studies of hepatic metabolism.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 316 (4), 578-589 (2019).</li><li>Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+adipose+tissue+and+blood+in+humans+and+its+use+as+a+biomarker+of+dietary+intake.">Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake.</a> Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).</li></ol>

פרוטוקול זה נועד לספק אסטרטגיה לחקר סטאטוזיס במבחנה. תרבית התאים היא כלי רב עוצמה לחקר היבטים תאיים, מולקולריים, ביוכימיים וטוקסיקולוגיים של התאים החשופים לתנאים שונים. עם גישה זו, ניתן לדמיין סטאטוזיס לא רק כשלב של המחלה המורכבת שהיא MAFLD, אלא גם כמו חשיפת יתר hepatocyte שומנים ואת התוצאות ...

כבד שומני הקשורים בתפקוד המטבולי נפוץ מאוד ברחבי העולם1,2; ההערכה היא כי עד 25% מהאוכלוסייה מושפע3. מחלה זו הידועה בעבר בשם מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD), עדכנה את המינוח שלה לתפקוד מטבולי הקשור למחלת כבד שומני (MAFLD) כדי לשקף במדויק את הפתוגנזה הקשורה להשמנת יתר, תנגודת לאינסולין, סוכרת מסוג 2, ודיסליפידמיה, כמו גם את ההנהלות האפשריות של המחלה3,4.
ללא קשר לשם, המחלה כוללת קשת רחבה של שינויים היסטופתולוגיים המאופיינת בהצטברות גבוהה באופן חריג של שומנים בכבד (>5% מהשומן בהפטוציטים5) ועשויה להתקדם דרך הצטברות השומנים שנמצאת בדרך כלל בסטאטוזיס פשוט לסטיאטוהפטיטיס, אשר בתורו עלולה להוביל להתפתחות של פיברוזיס, שחמת הכבד, קרצינומה hepatocellular, ואי ספיקת כבד5,6,7,8. בשל שכיחותו הגוברת, MAFLD צפוי להיות האינדיקציה הראשונה להשתלת כבד והגורם המוביל לקרצינומה hepatocellular9.
למרות שזה נחשב כצורה שפירה או קלה של מחלת כבד שומני, סטאטוזיס כבד הוא למעשה המפתח המטבולי ב- MAFLD10. מסלולים מטבוליים שונים מושפעים הצטברות שומנים בדם בכבד, כולל אך לא מוגבל סינתזה שומנים בדם, ייצוא, חילוף החומרים10. תנגודת לאינסולין, עקה חמצונית, מתח רשתית, תפקוד לקוי הסלולר קשורים מאוד ליפוטוקסיות בכבד11,12. מצד שני, הפטוסיטים שומניים הם המטרה של מינים חמצן תגובתי, עיבוד מטבוליטים כמו מי חמצן שומנים, קרבונילים חלבון, ותוספים של חומצות גרעין13. ברמה התאית, hepatocytes שומני עלול לעבור נזק מיטוכונדריאלי14, senescence הסלולר15, אפופטוזיס16, pyroptosis12, ו autophagia17, בין שאר האירועים.
Hepatocytes אחראים מאוד על חילוף החומרים, detoxification, וסינתזה של מגוון רחב של מולקולות. רבים של פונקציות אלה עלולים להיות בסכנה על ידי הצטברות השומנים שנצפו בסטאטוזיס. לכן, יש חשיבות רבה יש כלים לשחזור המאפשרים הערכה מדויקת של סטאטוזיס. במובן זה, מודלים במבחנה ישימים בקלות וניתן לשחזר מאוד. סטאטוזיס במבחנה שימש עם מטרות שונות16,18,19. תאי HepG2 נמצאים בשימוש נרחב כקו תאים hepatocyte. יש לו יתרונות כגון להיות קל לתרבות ומאופיין היטב. אולי, החיסרון היחיד של תאי HepG2 הוא העובדה שזה קו תאים מסרטן, ולכן זה חייב להילקח בחשבון בעת ניתוח התוצאות. כאן, היישום של תערובת של חומצות שומן בשימוש נרחב בתרבות התא: חומצה פלמיטית (PA) וחומצה אולאית (OA) מוצג. הן הרשות הפלסטינית והן OA מציעות תוצאות שונות בתרבות20. PA (C 16:0) היא חומצת השומן הרווי הנפוצה ביותר המתקבלת מהתזונה16. הרשות הפלסטינית נחשבת סמנים ביולוגיים של דה נובו ליפוגנזה, צעד מכריע בהתפתחות NAFLD21. הרשות הפלסטינית מוצגת כבעלת22רעילים ביותר ; לכן, זה לא יכול להיות מומלץ לגרום סטאטוזיס במבחנה. OA (C 18:1) היא חומצת שומן חד בלתי רוויה. בניגוד לרשות הפלסטינית, הוצע ל-OA להחזיק בתכונות אנטי דלקתיות ונוגדי חמצון, להיות מסוגל לנטרל את PA12. הן PA והן OA הן חומצות השומן העיקריות הקיימות בטריגליצרידים, ללא קשר למצב הבריאות אוהמחלה 16. טבלה 1 מספקת דוגמאות לתרבות ההפטוציטים עם הרשות הפלסטינית, OA והתערובת שלהם, כמו גם התוצאות שדווחו12,23,24,25,26,27. חומצות שומן אחרות שימשו גם בתרבות הפטוציט, כולל חומצה קאירית (C 18:0)28,29,30, חומצה לינולאית (C 18:1)28,30,31 וההצמדות שלה (CLA)28,32, חומצה פלמיטולאית (C 16:1)29. עם זאת, השימוש בהם מדווח לעתים קרובות ביותר בספרות, אולי בגלל שפע הכבד שלהם נמוך יותר מאשר הרשות הפלסטינית ו OA16.
בשילוב, שתי חומצות השומן דומות לסטיאטוזיס במבחנה, ומספקות תאים מתרבים, עם מוות מוגבר של תאים וכדאיות נמוכה יותר בהשוואה לתנאי בקרה. ראוי להזכיר כי המלחים המתאימים של חומצות שומן אלה זמינים וניתן להשתמש בהם גם כן. אחת הבעיות העיקריות בעת הערכת עומס יתר שומנים בתרבית התא hepatocyte ניתנת בהבחנה בין מודלים טוקסיקולוגיים מודל המייצגים הטוב ביותר סטאטוזיס. מודלים רבים ניתן להסביר במקרה הראשון. למעשה, השימוש ברשות הפלסטינית לבדה עשוי להיחשב ביניהם, והתמותה הגבוהה היא התוצאה הברורה ביותר12,16,23,24,25,26,27. השימוש במינונים גבוהים גם במקרה של OA יכול להיחשב גם כמודל toxicologic. הפרוטוקול המוצג כאן הוא גבוה יותר בהתאם להתפתחות סטאטוזיס שכן הוא מראה תמותה נמוכה לעומת זה שנצפה במודלים אחרים ומאפשר לו להיות אחריו במשך מספר ימים עם הצטברות שומנים מתקדמת כפי שהוא מתרחש ב NAFLD. האפשרות להעריך סטאטוזיס קל וחמורה באמצעות תנאי ניסוי נחשבת יתרון נוסף.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>חומצות שומן</td>
			<td colspan="2">תנאים</td>
			<td colspan="2">תוצאות</td>
			<td>הפניה</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">אבא</td>
			<td colspan="2">ריכוז: 200 מיקרומטר</td>
			<td colspan="2">הצטברות שומנים בדם</td>
			<td rowspan="3">יאן ואח', 201925.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">חשיפה לזמן: 24 שעות</td>
			<td colspan="2">נזקי הפטוצייט</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">גובה טרנסמינאס</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">אבא</td>
			<td colspan="2">ריכוז: 50, 100 ו 200 מיקרומטר</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">הצטברות שומנים בדם</td>
			<td rowspan="2">Xing et al, 201924.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">חשיפה לזמן: 24 שעות</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">אבא</td>
			<td colspan="2">ריכוז: 250 מיקרומטר , 500 מיקרומטר , 750 מיקרומטר ו 1,000 מיקרומטר</td>
			<td colspan="2">הצטברות שומנים בדם</td>
			<td rowspan="2">וואנג ואח', 202026.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">חשיפה לזמן: 24 שעות</td>
			<td colspan="2">הפחתה הדרגתית של הכדאיות בתא</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">תערובת של OA/PA</td>
			<td colspan="2">ריכוז: 1 מ"מ</td>
			<td colspan="2">הצטברות שומנים בדם</td>
			<td rowspan="3">שיאו ואח', 202027.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">חשיפה לזמן: 24 שעות</td>
			<td colspan="2">אינו מדווח על ליפוטוקסיות</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מחיר: 2OA:1PA</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">תערובת של OA/PA</td>
			<td colspan="2">גירוי ראשון עם 200 מיקרומטר ו 400 מיקרומטר של PA ולאחר מכן גירוי שני עם 200 מיקרומטר של OA</td>
			<td colspan="2">הצטברות שומנים בדם.</td>
			<td rowspan="4">זנג ואח', 202012.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ריכוז:400 מיקרומטר PA: 200 מיקרומטר OA</td>
			<td colspan="2">ראיות של ליפוטוקסיות הנגרמת על ידי הרשות הפלסטינית צומצמה על ידי גירוי של OA.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">תעריף: 2PA:1OA</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">חשיפה לזמן: 24 שעות</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">תערובת של OA/PA</td>
			<td colspan="2">ריכוז: 400 מיקרומטר PA: 200 מיקרומטר OA</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">הצטברות שומנים בדם</td>
			<td rowspan="3">חן ואח', 201823.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">תעריף: 2PA:1OA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">חשיפה לזמן: 24 שעות</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">תערובת של OA/PA</td>
			<td colspan="2">ריכוז :50 ו 500 מיקרומטר</td>
			<td colspan="2">דור של שני סוגים של סטאטוזיס: סטאטוזיס קל ו סטאטוזיס חמור.</td>
			<td rowspan="3">קמפוס וגוזמן 2021</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">תעריף: 2PA:1OA</td>
			<td colspan="2">מדמה תערוכה כרונית של עומס שומנים</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">חשיפה לזמן: 24 שעות, יומיים,3 ימים ו-4 ימים.</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. תרבות הפטוצייט בתנאים סטטוגניים. הטבלה מציגה את סוג חומצת השומן המשמשת, את התנאים נשמרים, ואת התוצאות שנצפו בתרבות hepatocyte. חומצה פלמיטית. חומצה אולאית.
לבסוף, מודל זה ישים לא רק על המחקר של סטאטוזיס וכבד שומני, אלא גם על מסלולי חילוף החומרים הכבד, סינתטי, ו detoxification בהקשר של סטאטוזיס. כמו כן, בסטאטוזיס המושרה במבחנה עשוי לספק ראיות לזיהוי סמנים פוטנציאליים של המחלה, כמו גם מטרות טיפוליות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>ESCO Airstream</td>
			<td>AC2-452+C2:C26</td>
			<td>Class II&#160;Type A2&#160;Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>430513</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 &#956;m, 500 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albimun (BSA)</td>
			<td>Gold Biotechnology, US</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td>BSA Fatty Acid Free for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>31800-022</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>A4766801</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marienfeld, DE</td>
			<td>640010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cell line</td>
			<td>ATCC, US</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Hepatocellular carcinoma human cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Thermo Electronic Corporation,US</td>
			<td>Model: 3110</td>
			<td>Temperature (37 &#176;C &#177; 1 &#176;C), humidity (90% &#177; 5%) , CO2 (5% &#177; 1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope Eclipse</td>
			<td>NIKON, JPN</td>
			<td>Model: TE2000-S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>I9030-4L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O Kit</td>
			<td>Abcam, US</td>
			<td>ab150678</td>
			<td>Kit for histological visualization of neutral fat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 &#956;g/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Beckman, US</td>
			<td>Model: 360 PH/Temp/MV Meter</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Sarstedt, AUS</td>
			<td>86.1253.001</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Sarstedt, AUS</td>
			<td>&#160;86.1254.001</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td>Preparation of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium oleate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, US</td>
			<td>sc-215879A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium palmitate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, US</td>
			<td>sc-215881</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring filter</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>431219</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>T6146-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>25-052-Cl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>3524</td>
			<td>Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>3599</td>
			<td>Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium

מחלת כבד שומני (MAFLD), הידועה בעבר כמחלת כבד שומני לא אלכוהולית (NAFLD), היא מחלת הכבד השכיחה ביותר בעולם בשל הקשר שלה עם השמנת יתר, סוכרת מסוג 2, ודיסליפידמיה. סטאטוזיס כבד, הצטברות של טיפות שומנים בדם בפרנצ'ימה בכבד, היא תכונה מרכזית של המחלה שקדמה לדלקת שנצפו בteatohepatitis, פיברוזיס, ומחלת כבד סופנית. הצטברות שומנים בדם בהפטוציטים עלולה להפריע לחילוף חומרים תקין של קסנוביוטיקה ומולקולות אנדוגניות, כמו גם לגרום לתהליכים תאיים המובילים להתקדמות המחלה. למרות המחקר הניסיוני של steatosis יכול להתבצע vivo, במבחנה גישות לחקר steatosis הם כלים משלימים עם יתרונות שונים. תרבות hepatocyte במדיום מותנה עומס יתר שומנים היא אפשרות רבייה מצוינת לחקר הסטאטוזיס הכבד המאפשר זיהוי של תהליכים תאיים הקשורים הצטברות שומנים, כגון לחצים חמצוניים ורשתית, autophagia, התפשטות, מוות תאים, וכו ', כמו גם בדיקות אחרות כולל יעילות סמים, ובדיקות טוקסיקולוגיות, בין יישומים אפשריים רבים אחרים. כאן, הוא נועד לתאר את המתודולוגיה של תרבית התא hepatocyte במדיום מותנה עומס יתר שומנים. תאי HepG2 היו בתרבית RMPI 1640 בינוני מותנה עם נתרן פלמיטט ונתרן oleate. חשוב לציין, היחס של שני שומנים אלה חיוני כדי להעדיף הצטברות טיפת שומנים בדם, תוך שמירה על התפשטות התאים ושיעור תמותה מתון, כפי שקורה בכבד במהלך המחלה. המתודולוגיה, מהכנת מלאי פתרון השומנים, תערובת, תוספת לתרבות הבינונית וההפטוציט מוצגת. עם גישה זו, ניתן לזהות טיפות שומנים בדם בהפטוציטים שניתן להבחין בהם בקלות על ידי כתמי O אדומים שמן, כמו גם עקומות של שיעורי התפשטות / תמותה.

Hepatocytes מתורבת בצמיחת התצוגה הבינונית steatogenic על פני השטח של הבאר; עם זאת, hepatocytes שומן להראות שיעור צמיחה נמוך יותר בהשוואה לתאים בתרבית בינונית שליטה. היחס והריכוז המוצעים של OA ו- PA, מבטיחים הישרדות תאים במהלך התרבות. זריעת 1 x 105 תאים לבאר בלוחות של 24 בארות מספקת מפגש אופטימלי כפי שמוצג <st...

Watch this Scientific Journal Video about A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium at JoVE.com

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

פרוטוקול זה נועד להיות כלי לחקר סטאטוזיס ואת השינויים המולקולריים, הביוכימיים, התאיים המיוצרים על ידי חשיפה יתר של hepatocytes שומנים במבחנה.

מודל של סטאטוזיס ניסיוני במבחנה: תרבית תאי הפטוציט במדיום מותנה בעומס יתר של שומנים

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

פרוטוקול זה חל על חקר סטאטוזיס הכבד, כמו גם על הכבד, חילוף החומרים, סינתטי, ואת מסלולי toxification בהקשר של סטאטוזיס. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם רבייה שלה ואת הזמן הקצר הדרוש כדי להשיג תוצאות. הוסף את העובדה כי הוא מציע שתי רמות של סטאטוזיס, מתון, וקשה.בסטטוזיס המושרה במבחנה עשוי לספק ראיות לזיהוי סמנים פוטנציאליים לאבחון המחלה, כמו גם מטרות טיפוליות. שיטה זו נועדה להיות מיושמת בתוצאת סטאטוזיס. עם זאת, זה יכול להיות מותאם למגוון רחב של תאים שונים מושפעים שומנים יתר חשיפות, כמו במהלך השמנת יתר ולפידמיה.הכן RPMI 1640 סטנדרטי. תוספת RPMI 1640 תרבות בינוני עם 10% של חום מופעל FBS, ו 1% של פתרון סטרפטומיצין פניצילין. לחטא אותו באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר ולאחסן את תוספת בארבע מעלות צלזיוס.כדי להכין פתרון מלאי פלמיטט להכין פתרון 50 מילימולר של פלמיטט RPMI 1640 סטנדרטי בתוספת 1% של BSA ללא שומנים. לחטא כחמישה עד עשרה מיליליטר של פתרון המלאי באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס מוגן מפני אור עד חודש אחד. כדי להכין פתרון מלאי oleate להכין פתרון 50 מילימולר של oleate בתוספת RPMI 1640.ולחטא את פתרון המלאי באמצעות מסנני מיקרומטר 0.22. לאחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור עד חודש אחד. כדי להכין מדיום סטטוגני מן המלאי שהוכן בעבר, להכין 100 מילימטרים של תערובת 50 מיקרומולר של חלק אחד palmitate ושני חלק oleate.עבור רמות קלות, לשפוך תערובת 500 micromolar של חלק אחד palmitate ושני oleate שני חלקים עבור רמות חמורות RPMI סטנדרטי 1640. ולחטא באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע.לחלופין, כדי להכין פתרונות מלאי עם חומצות שומן בהתאמה באמצעות אלבומין שומנים חינם, להמיס או palmitate או oleate בשני מיליליטר של אתנול מוחלט ולאחר מכן לערבב את הנפח הסופי של RPMI סטנדרטי 1640. להמיס oleate ישירות על ידי אחסון במדיום סטנדרטי RPMI 1640 תרבות. אפשר אידוי של אתנול על ידי דגירה באמבט מים ב 70 מעלות צלזיוס ומערבבים ביסודיות.עקר את שני פתרונות המלאי באמצעות מסנני מיקרומטר 0.22 ואחסן את תמיסת מלאי הפלמיטט בארבע מעלות צלזיוס. ופתרון מלאי oleate במינוס 20 מעלות צלזיוס. מושב 0.1 מיליון תאי הפ G2 לבאר בצלחת 24-well.הוסף מיליליטר אחד של RPMI 1640 סטנדרטי. לפני הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות, המאפשר חיבור לתא. לאחר טרום-תרבות, יש להשליך את המדיום הסטנדרטי RPMI 1640.ולהוסיף את המדיום הסטיטוגני. יש להשליך את הסופר-נט ולהוסיף מדיום סטטוגני טרי כל 24 שעות. כדי לבצע הערכת כדאיות ומורפולוגיה, להשליך את supernatant ולנתק תאים מן הבאר על ידי הוספת 500 microliters של 0.05%טריפסין EDTA.דגירה במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאסוף את התאים resuspended בצינור מיקרו. וצנטריפוגה ב 300 פעמים G.ואז להשליך את supernatant, להוסיף 200 microliters של RPMI סטנדרטי 1640, ו respend התאים.הוסף 15 מיקרוליטרים של 0.4% מהפתרון הכחול טריפן בצינור מיקרו טרי. הוסף וערבב 15 מיקרוליטרים של ההשעיה התא הקודם. לספור את התאים מוכתמים ולא מוכתמים בהמוציטומטר ולחשב את שיעורי הכדאיות והתמותה.שים פתק כיסוי תרבית תא בכל באר בצלחת 24-באר וזרע Hep G2 תאים כמתואר בכתב היד טקסט. לאחר הדגירה המתאימה, לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של PBS ולהשליך את supernatant. מערבבים אותם עם מיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde ב PBS ודגרה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.להשליך את paraformaldehyde עודף ולשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של מים מזוקקים. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של 70%איזופרופנול ודגרה במשך חמש דקות. להשליך את איזופרופנול עודף ולהוסיף מיליליטר אחד של פתרון O שמן אדום ודגורה במשך 30 דקות.יש להשליך את תמיסת עודף שמן אדום O, ולאחר מכן לשטוף עם מיליליטר אחד של מים מזוקקים. שים לב לתאים מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 400. בחר ולכוד באופן אקראי תצלומים של 10 שדות אופטיים מהאזור המלא של הבאר.חזור על ההדמיה לכל באר. כדי להעריך את אחוז השטח המוכתם באדום, פתח את תוכנת ImageJ וייבוא קבצים נדרשים, ולאחר מכן לחץ על התאם והשתמש בכלי סף הצבעים, הגדר את פרמטר הגוון לזיהוי צבע אדום. לאחר מכן כווננו את הרוויה והבהירות של התמונה.השווה את האזור המוכתם עם האזור המלא של השדה האופטי, באמצעות הכלי לנתח חלקיקים ולחשב את האחוז הממוצע של כל באר. ישיבה של 0.1 מיליון hepatocytes לבאר בצלחות של 24 בארות מספקת מפגש אופטימלי. הכדאיות פחתה בהדרגה ככל שזמן התרבות גדל, והגיע לנמוך ביותר של 60% בארבעה ימים בסטאטוזיס חמור.בהתאם, שיעור התמותה היה גבוה יותר בהפטוציטים בתרבית בתנאים הסטיטוגניים. וזה גדל בהדרגה עם הזמן של חשיפה שומנים. מספר התאים גדל בהדרגה כתוצאה מהתפשטות.עם זאת, שיעור ההתפשטות היה נמוך יותר בסטאטוזיס קל בשלושה וארבעה ימים. לעומת זאת, סטאטוזיס חמור היה קשור עם התפשטות נמוכה יותר על ידי 24 שעות. כתמי תאים עם שמן אדום O הפגינו לפחות עלייה כפולה של טיפות שומנים בדם בתאים בתרבית בתנאים סטטוגניים.שומן תאי גדל על פי זמן החשיפה של התרבות במדיום steatogenic. בסטאטוזיס קל, תכולת השומנים הוגדלה מהיום השני, ואילו בסטאטוזיס חמור הם היו גבוהים באופן משמעותי החל מ 24 שעות. תרבית התא דורשת ניסיון קודם.פולחן תאי Hep G2 במצב סטנדרטי לפני השימוש בפרוטוקול זה יכול להיות מועיל. הכנת מלאי חומצות השומן היא גם נקודה מכרעת. חומצה פלמיטית מוצקה בטמפרטורת החדר, ויש לחמם אותה לפני ניהולה.שיטה זו אמורה לאפשר ניתוח מולקולרי של מסלולים שונים, כולל, אך לא רק להתפשטות, אפופטוזיס, אוטופגיה, סטרס חמצוני וניתוח פרמקולוגי ו טוקסיקולוגי.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

גזע השתלת תאים ב במבחנה דגם סימולציה איסכמיה / reperfusion

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

הערכת שינויים teratogenic במודל דג הזברה של חשיפה אלכוהול עוברית

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

ב Assay עמילות חוץ גופית mesothelial כי מודלים השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

השתלת תאי גזע עצבית בדגם ניסיוני של Contusive פגיעה בחוט השדרה

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

ניתוח אופטימלי של<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדית steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

שימוש במבחנה לחיות תאים הדמיה כדי לחקור Chemotherapeutics מועברת על ידי חלקיקים המבוססת על שומנים בדם

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

מודל התרבות התא של התנגדות העורקים

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

דיסקציה והתרבות Explant של Allantois מאתר לניתוח במבחנה של קובץ מצורף Allantoic

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...