Name: a model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium
Uploaded: 2021-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos è una dottoranda presso il Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, ed è stata sostenuta da Conacyt (CVU: 1002502).

1. Preparazione del mezzo standard e condizionato
<ol><li>Per preparare rpmI 1640 standard, integrare il terreno di coltura RPMI 1640 con il 10% (v/v) di siero bovino fetale (FBS, precedentemente inattivato dal calore) e l'1% (v/v) di soluzione di penicillina-streptomicina. Conservare il mezzo a 4 °C.Sterilizzare utilizzando filtri da 0,22 μm.</li>
	<li>Per preparare la soluzione stock di palmitato, preparare una soluzione di palmitato da 50 mM nello standard RPMI 1640 precedentemente integrato con l'1% di albumina s...

<ol>
	<li>Younossi, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease+-+a+global+public+health+perspective.">Non-alcoholic fatty liver disease - a global public health perspective.</a> Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).</li><li>Younossi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+perspectives+on+nonalcoholic+fatty+liver+disease+and+nonalcoholic+steatohepatitis.">Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 69 (6), 2672-2682 (2019).</li><li>Eslam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+definition+for+metabolic+dysfunction-associated+fatty+liver+disease:+An+international+expert+consensus+statement.">A new definition for metabolic dysfunction-associated fatty liver disease: An international expert consensus statement.</a> Journal of Hepatology. 73 (1), 202-209 (2020).</li><li>Eslam, M., Sanyal, A. 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Questo protocollo ha lo scopo di fornire una strategia per studiare la steatosi in vitro. La coltura cellulare è un potente strumento per studiare gli aspetti cellulari, molecolari, biochimici e tossicologici delle cellule esposte a diverse condizioni. Con questo approccio, la steatosi può essere visualizzata non solo come uno stadio della malattia complessa che è MAFLD, ma anche come la sovraesposizione degli epatociti ai lipidi e i possibili esiti derivanti da tale esposizione. Pertanto, la sua applicazione...

Il fegato grasso associato alla disfunzione metabolica è altamente prevalente in tutto il mondo1,2; si stima che fino al 25% della popolazione sia colpita3. Questa malattia precedentemente nota come steatosi epatica non alcolica (NAFLD), ha aggiornato la sua nomenclatura alla steatosi epatica associata alla disfunzione metabolica (MAFLD) per riflettere accuratamente la patogenesi correlata all'obesità, all'insulino-resistenza, al diabete di tipo 2 e alla dislipidemia, nonché le possibili gestione della malattia3,4.
Indipendentemente dal nome, la malattia comprende un ampio spettro di cambiamenti istopatologici caratterizzati da un accumulo anormalmente elevato di lipidi nel fegato (>5% di grasso negli epatociti5) e potrebbe progredire attraverso l'accumulo lipidico tipicamente riscontrato nella steatosi semplice alla steatoepatite, che a sua volta potrebbe portare allo sviluppo di fibrosi, cirrosi, carcinoma epatocellulare e insufficienzaepatica 5,6,7,8. A causa della sua crescente prevalenza, MAFLD dovrebbe diventare la prima indicazione del trapianto di fegato e la principale causa di carcinoma epatocellulare9.
Sebbene sia stata considerata una forma benigna o lieve di malattia del fegato grasso, la steatosi epatica è in realtà la chiave metabolica in MAFLD10. Diverse vie metaboliche sono influenzate dall'accumulo di lipidi nel fegato, inclusi ma non limitati alla sintesi lipidica, all'esportazione e al metabolismo10. La resistenza all'insulina, lo stress ossidativo, lo stress reticolare e la disfunzione cellulare sono fortemente associati alla linotossicitàepatica 11,12. D'altra parte, gli epatociti grassi sono il bersaglio delle specie reattive dell'ossigeno, rendendo metaboliti come perossidi lipidici, carbonili proteici e addotti di acidi nucleici13. A livello cellulare, gli epatociti grassi potrebbero subire danni mitocondriali14, senescenza cellulare15, apoptosi16, piroptosi12e autofagia17, tra gli altri eventi.
Gli epatociti sono altamente responsabili del metabolismo, della disintossicazione e della sintesi di una vasta gamma di molecole. Molte di queste funzioni potrebbero essere compromesse dall'accumulo lipidico osservato nella steatosi. Pertanto, è di grande importanza disporre di strumenti riproducibili che consentano una valutazione accurata della steatosi. In questo senso, i modelli in vitro sono facilmente applicabili e altamente riproducibili. La steatosi in vitro è stata utilizzata con diversi obiettivi16,18,19. Le cellule HepG2 sono ampiamente utilizzate come linea cellulare di epatociti. Ha vantaggi come essere facile da cultura e ben caratterizzato. Forse, l'unico svantaggio delle cellule HepG2 è il fatto che si tratta di una linea cellulare cancerogena, quindi questo deve essere considerato quando si analizzano i risultati. Qui, viene mostrata l'applicazione di una miscela di acidi grassi ampiamente utilizzati nella coltura cellulare: acido palmitico (PA) e acido oleico (OA). Sia PA che OA offrono risultati diversi nella cultura20. PA (C 16:0) è l'acido grasso saturo più comune ottenuto dalla dieta16. La PA è considerata un biomarcatore della lipogenesi de-novo,un passo cruciale nello sviluppo della NAFLD21. Il PA si è dimostrato altamente tossico22; pertanto, potrebbe non essere raccomandato indurre la steatosi in vitro. OA (C 18:1) è un acido grasso monoinsaturo. In contrasto con la PA, l'OA è stato suggerito per possedere proprietà antinfiammatorie e antiossidanti, essendo in grado di contrastare PA12. Sia PA che OA sono i principali acidi grassi presenti nei trigliceridi, indipendentemente dalle condizioni di salute o dalla malattia16. La Tabella 1 fornisce esempi della coltura di epatociti con PA, OA e la loro miscela, nonché i risultati riportati12,23,24,25,26,27. Altri acidi grassi sono stati utilizzati anche nella coltura degli epatociti, tra cui l'acido stearico (C 18:0)28,29,30,l'acido linoleico (C 18:1)28,30,31 e i suoi coniugati (CLA)28,32,l'acido palmitoleico (C 16:1)29. Tuttavia, il loro uso è meno frequentemente riportato in letteratura, forse perché la loro abbondanza epatica è inferiore a PA e OA16.
In combinazione, entrambi gli acidi grassi assomigliano alla steatosi in vitro, fornendo cellule proliferanti, con aumento della morte cellulare e minore vitalità rispetto alle condizioni di controllo. Vale la pena ricordare che i rispettivi sali di questi acidi grassi sono disponibili e possono essere utilizzati pure. Uno dei problemi principali nella valutazione del sovraccarico lipidico nella coltura cellulare degli epatociti è dato nella differenziazione tra modelli tossicologici e un modello che rappresenta al meglio la steatosi. Molti modelli possono essere contabilizzati nel primo caso. In effetti, l'uso della PA da solo potrebbe essere considerato tra questi, e l'alta mortalità è l'esito più evidente12,16,23,24,25,26,27. L'uso di dosi elevate anche nel caso di OA può anche essere considerato come un modello tossicologico. Il protocollo qui mostrato è in maggiore conformità con lo sviluppo della steatosi poiché mostra una bassa mortalità rispetto a quella osservata in altri modelli e consente di seguirlo per diversi giorni con accumulo lipidico progressivo come si verifica nella NAFLD. La possibilità di valutare la steatosi lieve e grave attraverso condizioni sperimentali è considerata un altro vantaggio.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Acidi</td>
			<td colspan="2">Condizioni</td>
			<td colspan="2">Risultati</td>
			<td>Riferimento</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">BABBO</td>
			<td colspan="2">Concentrazione: 200 μM</td>
			<td colspan="2">Accumulo di lipidi</td>
			<td rowspan="3">Yan et al, 201925.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tempo di esposizione: 24 h</td>
			<td colspan="2">Danno agli epatociti</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">Elevazione delle transaminasi</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">BABBO</td>
			<td colspan="2">Concentrazione: 50, 100 e 200 μM</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Accumulo di lipidi</td>
			<td rowspan="2">Xing et al, 201924.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tempo di esposizione: 24 h</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">BABBO</td>
			<td colspan="2">Concentrazione: 250 μM, 500 μM, 750 μM e 1.000 μM</td>
			<td colspan="2">Accumulo di lipidi</td>
			<td rowspan="2">Wang et al, 202026.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tempo di esposizione: 24 h</td>
			<td colspan="2">Riduzione progressiva della vitalità cellulare</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Mix di OA/PA</td>
			<td colspan="2">Concentrazione: 1 mM</td>
			<td colspan="2">Accumulo di lipidi</td>
			<td rowspan="3">Xiao et al, 202027.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tempo di esposizione: 24 h</td>
			<td colspan="2">Non segnala linotossicità</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tariffa: 2OA: 1PA</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Mix di OA/PA</td>
			<td colspan="2">Prima stimolazione con 200 μM e 400 μM di PA e poi seconda stimolazione con 200 μM di OA</td>
			<td colspan="2">Accumulo di lipidi.</td>
			<td rowspan="4">Zeng et al, 202012.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Concentrazione:400 μM PA: 200 μM OA</td>
			<td colspan="2">L'evidenza di licotossicità indotta dalla PA è stata ridotta dalla stimolazione dell'OA.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tariffa: 2PA: 1OA</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tempo di esposizione: 24 h</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Mix di OA/PA</td>
			<td colspan="2">Concentrazione: 400 μM PA: 200 μM OA</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Accumulo di lipidi</td>
			<td rowspan="3">Chen et al, 201823.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tariffa: 2PA: 1OA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tempo di esposizione: 24 h</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Mix di OA/PA</td>
			<td colspan="2">Concentrazione: 50 e 500 μM</td>
			<td colspan="2">Generazione di due tipi di steatosi: steatosi lieve e steatosi grave.</td>
			<td rowspan="3">Campos e Guzmán 2021</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tariffa: 2PA: 1OA</td>
			<td colspan="2">Simula l'esposizione cronica del sovraccarico lipidico</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tempo di esposizione: 24 h, 2 giorni, 3 giorni e 4 giorni.</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Coltura di epatociti in condizioni steatogene. La tabella presenta il tipo di acido grasso utilizzato, le condizioni mantenute e i risultati osservati nella coltura degli epatociti. PA: Acido palmitico. OA: Acido oleico.
Infine, questo modello è applicabile non solo allo studio della steatosi e del fegato grasso, ma anche alle vie epatiche metaboliche, sintetiche e di disintossicazione nel contesto della steatosi. Inoltre, la steatosi indotta in vitro potrebbe fornire prove per l'identificazione di potenziali marcatori della malattia e bersagli terapeutici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>ESCO Airstream</td>
			<td>AC2-452+C2:C26</td>
			<td>Class II&#160;Type A2&#160;Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>430513</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 &#956;m, 500 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albimun (BSA)</td>
			<td>Gold Biotechnology, US</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td>BSA Fatty Acid Free for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>31800-022</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>A4766801</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marienfeld, DE</td>
			<td>640010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cell line</td>
			<td>ATCC, US</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Hepatocellular carcinoma human cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Thermo Electronic Corporation,US</td>
			<td>Model: 3110</td>
			<td>Temperature (37 &#176;C &#177; 1 &#176;C), humidity (90% &#177; 5%) , CO2 (5% &#177; 1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope Eclipse</td>
			<td>NIKON, JPN</td>
			<td>Model: TE2000-S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>I9030-4L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O Kit</td>
			<td>Abcam, US</td>
			<td>ab150678</td>
			<td>Kit for histological visualization of neutral fat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 &#956;g/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Beckman, US</td>
			<td>Model: 360 PH/Temp/MV Meter</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Sarstedt, AUS</td>
			<td>86.1253.001</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Sarstedt, AUS</td>
			<td>&#160;86.1254.001</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td>Preparation of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium oleate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, US</td>
			<td>sc-215879A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium palmitate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, US</td>
			<td>sc-215881</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring filter</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>431219</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>T6146-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>25-052-Cl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>3524</td>
			<td>Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>3599</td>
			<td>Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium

La steatosi epatica associata alla disfunzione metabolica (MAFLD), precedentemente nota come steatosi epatica non alcolica (NAFLD), è la malattia epatica più diffusa in tutto il mondo a causa della sua relazione con obesità, diabete di tipo 2 e dislipidemia. La steatosi epatica, l'accumulo di goccioline lipidiche nel parenchima epatico, è una caratteristica chiave della malattia che precede l'infiammazione osservata nella steatoepatite, nella fibrosi e nella malattia epatica allo stadio terminale. L'accumulo di lipidi negli epatociti potrebbe interferire con il corretto metabolismo degli xenobiotici e delle molecole endogene, nonché indurre processi cellulari che portano all'avanzamento della malattia. Sebbene lo studio sperimentale della steatosi possa essere eseguito in vivo, gli approcci in vitro allo studio della steatosi sono strumenti complementari con diversi vantaggi. La coltura di epatociti in un mezzo condizionato da sovraccarico lipidico è un'eccellente opzione riproducibile per lo studio della steatosi epatica che consente l'identificazione dei processi cellulari legati all'accumulo lipidico, come stress ossidativo e reticolare, autofagia, proliferazione, morte cellulare, eccetera, nonché altri test tra cui l'efficacia dei farmaci e test tossicologici, tra molte altre possibili applicazioni. Qui, aveva lo scopo di descrivere la metodologia della coltura cellulare degli epatociti in mezzo condizionato da sovraccarico lipidico. Le cellule HepG2 sono state coltivate in terreno RMPI 1640 condizionato con palmitato di sodio e oleato di sodio. È importante sottolineare che il rapporto di questi due lipidi è fondamentale per favorire l'accumulo di goccioline lipidiche, pur mantenendo la proliferazione cellulare e un tasso di mortalità moderato, come accade nel fegato durante la malattia. Viene mostrata la metodologia, dalla preparazione delle scorte di soluzioni lipidiche, dalla miscela, dall'aggiunta al mezzo e dalla coltura degli epatociti. Con questo approccio, è possibile identificare goccioline lipidiche negli epatociti che sono facilmente osservabili dalla colorazione O rosso olio, nonché curve dei tassi di proliferazione / mortalità.

Gli epatociti coltivati nel mezzo steatogeno mostrano una crescita su tutta la superficie del pozzo; tuttavia, gli epatociti grassi mostrano un tasso di crescita inferiore rispetto alle cellule coltivate in mezzo di controllo. Il rapporto proposto e la concentrazione di OA e PA, garantiscono la sopravvivenza cellulare durante la coltura. La semina 1 x 105 cellule per pozzetti in piastre a 24 pozzetti fornisce una confluenza ottimale come mostrato nella Figura 1.
<p class="jove...

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A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Questo protocollo vuole essere uno strumento per studiare la steatosi e i cambiamenti molecolari, biochimici, cellulari prodotti dalla sovraeposizione degli epatociti ai lipidi in vitro.

Un modello di steatosi sperimentale in vitro:coltura cellulare di epatociti in mezzo condizionato da sovraccarico lipidico

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

Questo protocollo è applicabile allo studio della steatosi epatica e alle vie epatiche, metaboliche, sintetiche e di tossificazione nel contesto della steatosi. I principali vantaggi di questo metodo sono la sua riproducibilità e il breve tempo necessario per ottenere risultati. Aggiungi il fatto che offre due livelli di steatosi, lieve e grave.La steatosi indotta in vitro potrebbe fornire prove per l'identificazione di potenziali marcatori per la diagnosi della malattia, nonché di bersagli terapeutici. Questo metodo è destinato ad essere applicato nel risultato della steatosi. Tuttavia, può essere adattato a una vasta gamma di cellule diverse colpite da sovra-esposizioni lipidiche, come durante l'obesità e la lipidemia.Preparare lo standard RPMI 1640. Integrare il terreno di coltura RPMI 1640 con il 10% di FBS attivato dal calore e l'1% di soluzione di streptomicina di penicillina. Sterilizzarlo utilizzando filtri da 0,22 micrometri e conservare il supplemento a quattro gradi Celsius.Per preparare una soluzione stock di palmitato preparare una soluzione da 50 millimolari di palmitato nello standard RPMI 1640 integrato con l'1% di BSA senza lipidi. Sterilizzare da cinque a dieci millilitri della soluzione stock utilizzando filtri da 0,22 micrometri e conservare a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce per un massimo di un mese. Per preparare la soluzione di brodo oleato preparare una soluzione di oleato da 50 millimolari nel RPMI 1640 integrato.E sterilizzare la soluzione stock utilizzando filtri da 0,22 micrometri. Conservalo a meno 20 gradi Celsius, al riparo dalla luce per un massimo di un mese. Per preparare il mezzo steatogeno dalle scorte precedentemente preparate, preparare 100 millimetri di una miscela di 50 micromolari di una parte di palmitato e due parti di oleato.Per livelli lievi, versare una miscela di 500 micromolari di una parte di palmitato e due parti di oleato per livelli severi in RPMI 1640 standard. E sterilizzare utilizzando filtri da 0,22 micrometri. Conservare a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana.In alternativa, per preparare soluzioni madre con i rispettivi acidi grassi utilizzando albumina lipidica libera, sciogliere palmitato o oleato in due millilitri di etanolo assoluto e quindi mescolare nel volume finale dello standard RPMI 1640. Sciogliere l'oleato direttamente conservandolo nel terreno di coltura standard RPMI 1640. Consentire l'evaporazione dell'etanolo incubando a bagnomaria a 70 gradi Celsius e mescolare accuratamente.Sterilizzare entrambe le soluzioni stock utilizzando filtri da 0,22 micrometri e conservare la soluzione stock di palmitato a quattro gradi Celsius. E soluzione stock di oleato a meno 20 gradi Celsius. Sedile 0,1 milioni di celle Hep G2 per pozzetti in una piastra a 24 pozzetti.Aggiungere un millilitro di RPMI 1640 standard. Pre-incubazione a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore, consentendo l'attaccamento cellulare. Dopo la precoltura, scartare il supporto RPMI 1640 standard.E aggiungi il mezzo steatogeno. Scartare il surnatante e aggiungere un mezzo steatogeno fresco ogni 24 ore. Per eseguire la valutazione della vitalità e della morfologia, scartare il surnatante e staccare le cellule dal pozzo aggiungendo 500 microlitri di 0,05% di tripsina EDTA.Incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Raccogliere le cellule riconsependite in un micro tubo. E centrifugare a 300 volte G.Quindi scartare il surnatante, aggiungere 200 microlitri di RPMI 1640 standard e sostituire le celle.Aggiungere 15 microlitri dello 0,4% di soluzione blu di tripano in un microtubo fresco. Aggiungere e mescolare 15 microlitri della sospensione cellulare precedente. Contare le cellule colorate e non macchiate in un emocitometro e calcolare i tassi di vitalità e mortalità.Metti una copertura di coltura cellulare in ogni pozzo in una piastra a 24 pozzetti e semina cellule Hep G2 come descritto nel manoscritto di testo. Dopo l'appropriata incubazione, lavare le cellule con un millilitro di PBS e scartare il surnatante. Mescolarli con un millilitro di paraformaldeide al 4% in PBS e incubare per un'ora a temperatura ambiente.Scartare l'eccesso di paraformaldeide e risciacquare le cellule con un millilitro di acqua distillata. Quindi aggiungere un millilitro di isopropanolo al 70% e incubare per cinque minuti. Scartare l'isopropanolo in eccesso e aggiungere un millilitro di soluzione di Oil-Red O e incubare per 30 minuti.Scartare la soluzione oil-red O in eccesso e quindi risciacquare con un millilitro di acqua distillata. Osservare le cellule al microscopio con un ingrandimento di 400x. Seleziona e cattura in modo casuale fotografie di 10 campi ottici dall'area completa del pozzo.Ripeti l'imaging per ogni pozzo. Per valutare la percentuale di area macchiata di rosso, aprire il software ImageJ e importare i file richiesti, quindi fare clic su Regola e utilizzando lo strumento soglia colore, definire il parametro tonalità per il rilevamento del colore rosso. Quindi regolare la saturazione e la luminosità per l'immagine.Confronta l'area macchiata con l'area completa del campo ottico, utilizzando lo strumento analizza particelle e calcola la percentuale media di ogni pozzo. 0,1 milioni di epatociti per pozzo in piastre a 24 pozzi forniscono una confluenza ottimale. La vitalità è progressivamente diminuita con l'aumentare del tempo della coltura, raggiungendo il minimo del 60% a quattro giorni nella steatosi grave.Di conseguenza, il tasso di mortalità era più alto negli epatociti coltivati in condizioni steatogene. E aumentava progressivamente con il tempo di esposizione ai lipidi. Il numero di cellule è aumentato progressivamente a causa della proliferazione.Tuttavia, il tasso di proliferazione era più basso nella steatosi lieve a tre e quattro giorni. Al contrario, la steatosi grave è stata associata a una minore proliferazione di 24 ore. La colorazione delle cellule con Oil-Red O ha dimostrato un aumento di almeno due volte delle goccioline lipidiche nelle cellule coltivate in condizioni steatogene.Il grasso intracellulare è aumentato in base al tempo di esposizione della coltura nel mezzo steatogeno. Nella steatosi lieve, il contenuto lipidico è aumentato dal secondo giorno, mentre nella steatosi grave è stato significativamente elevato a partire dalle 24 ore. La coltura cellulare richiede un'esperienza precedente.Coltivare cellule Hep G2 in una condizione standard prima di utilizzare questo protocollo potrebbe essere utile. Anche la preparazione dello stock di acidi grassi è un punto cruciale. L'acido palmitico è solido a temperatura ambiente e deve essere riscaldato prima della sua gestione.Questo metodo dovrebbe consentire l'analisi molecolare di diverse vie, tra cui, ma non solo, proliferazione, apoptosi, autofagia, stress ossidativo e analisi farmacologiche e tossicologiche.

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