Name: a model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium
Uploaded: 2021-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos é doutoranda no Programa de Doutorado em Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, e foi apoiada pela Conacyt (CVU: 1002502).

1. Preparação média padrão e condicionada
<ol><li>Para preparar o RPMI padrão 1640, suplemente o meio de cultura RPMI 1640 com 10% (v/v) de soro bovino fetal (FBS, anteriormente inativado) e 1% (v/v) da solução penicilina-estreptomicina. Armazene o meio a 4 °C.Esterilizar usando filtros de 0,22 μm.</li>
	<li>Para preparar a solução de estoque palmitato, prepare uma solução de 50 mM de palmitato no RPMI padrão 1640 previamente suplementado com 1% de albumina de soro bovino (livre de lipídios). Um volume d...

<ol>
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Este protocolo destina-se a fornecer uma estratégia para estudar esteatose in vitro. A cultura celular é uma ferramenta poderosa para estudar aspectos celulares, moleculares, bioquímicos e toxicológicos das células expostas a diferentes condições. Com essa abordagem, a esteatose pode ser visualizada não apenas como um estágio da doença complexa que é a MAFLD, mas também como a superexposição hepatocita aos lipídios e os possíveis desfechos resultantes dessa exposição. Portanto, sua aplicação ...

Fígado gorduroso associado à disfunção metabólica é altamente prevalente em todo o mundo1,2; estima-se que até 25% da população seja afetada3. Esta doença anteriormente conhecida como doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), atualizou sua nomenclatura para disfunção metabólica associada à doença hepática gordurosa (MAFLD) para refletir com precisão a patogênese relacionada à obesidade, resistência à insulina, diabetes tipo 2 e dislipidemia, bem como os possíveis manejos da doença3,4.
Independentemente do nome, a doença inclui um amplo espectro de alterações histopatológicas caracterizadas pelo acúmulo anormalmente alto de lipídios no fígado (>5% de gordura nos hepatócitos5) e pode progredir através do acúmulo lipídudo tipicamente encontrado em esteatose simples à esteatohepatite, o que por sua vez pode levar ao desenvolvimento de fibrose, cirrose, carcinoma hepatocelular e insuficiência hepática5,6,7,8. Devido à sua crescente prevalência, espera-se que o MAFLD se torne a primeira indicação de transplante hepático e a principal causa do carcinoma hepatocelular9.
Embora tenha sido considerada como uma forma benigna ou leve de doença hepática gordurosa, a esteatose hepática é de fato a chave metabólica no MAFLD10. Diferentes vias metabólicas são afetadas pelo acúmulo de lipídios no fígado, incluindo, mas não se limitando à síntese lipídica, exportação e metabolismo10. Resistência à insulina, estresse oxidativo, estresse reticular e disfunção celular estão fortemente associados à lipotoxicidade hepática11,12. Por outro lado, hepatócitos gordurosos são alvo de espécies reativas de oxigênio, tornando metabólitos como peróxidos lipídicos, carbonilas proteicas e adutos de ácidos nucleicos13. No nível celular, hepatócitos gordurosos podem sofrer danos mitocondriais14, senescência celular15, apoptose16,pioptose12e autofagia17,entre outros eventos.
Hepatocitas são altamente responsáveis pelo metabolismo, desintoxicação e síntese de uma ampla gama de moléculas. Muitas dessas funções podem ser comprometidas pelo acúmulo lipídudo observado na esteatose. Portanto, é de grande importância ter ferramentas reprodutíveis que permitam uma avaliação precisa da esteatose. Nesse sentido, os modelos in vitro são prontamente aplicáveis e altamente reprodutíveis. Esteatose in vitro tem sido usada com diferentes gols16,18,19. As células HepG2 são amplamente utilizadas como linha celular hepatocitte. Tem vantagens como ser fácil de cultivar e bem caracterizado. Talvez, a única desvantagem das células HepG2 seja o fato de ser uma linha celular cancerígena, por isso isso deve ser considerado ao analisar os desfechos. Aqui, mostra-se a aplicação de uma mistura de ácidos graxos amplamente utilizados na cultura celular: ácido palmítico (PA) e ácido oleico (OA). Tanto o PA quanto o OA oferecem resultados diferentes na cultura20. Pa (C 16:0) é o ácido graxo saturado mais comum obtido da dieta16. A AF é considerada biomarcadora da lipogênese de-novo,um passo crucial no desenvolvimento do NAFLD21. Pa é mostrado como altamente tóxico22; portanto, pode não ser recomendado induzir esteatose in vitro. OA (C 18:1) é um ácido graxo monoinsaturado. Em contraste com a AF, foi sugerido que a OA possui propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes, sendo capaz de neutralizar a PA12. Tanto a AF quanto a OA são os principais ácidos graxos presentes nos triglicérides, independentemente da condição de saúde ou doença16. A Tabela 1 fornece exemplos da cultura hepatocitte com PA, OA e sua mistura, bem como os resultados relatados12,23,24,25,26,27. Outros ácidos graxos também têm sido utilizados na cultura hepatocita, incluindo ácido esteárico (C 18:0)28,29,30, ácido linoleico (C 18:1)28,30,31 e seus conjugados (CLA)28,32, ácido palmitoleico (C 16:1)29. No entanto, seu uso é menos frequentemente relatado na literatura, talvez porque sua abundância hepática é menor que a PA e OA16.
Em conjunto, ambos os ácidos graxos se assemelham à esteatose in vitro,proporcionando células proliferadoras, com maior morte celular e menor viabilidade em comparação com as condições de controle. Vale ressaltar que os respectivos sais desses ácidos graxos estão disponíveis e também podem ser usados. Um dos principais problemas na avaliação da sobrecarga lipídica na cultura celular hepatocitte é dado na diferenciação entre modelos toxicológicos e um modelo que melhor representa a esteatose. Muitos modelos podem ser contabilizados no primeiro caso. De fato, o uso apenas de PA pode ser considerado entre eles, e a alta mortalidade é o desfecho mais evidente12,16,23,24,25,26,27. O uso de altas doses mesmo no caso de OA também pode ser considerado como um modelo toxicológico. O protocolo aqui mostrado está em maior conformidade com o desenvolvimento da esteatose, pois mostra baixa mortalidade em comparação com o observado em outros modelos e permite que seja seguido durante vários dias com acúmulo progressivo de lipídios como ocorre na NAFLD. A possibilidade de avaliar esteatose leve e grave por meio de condições experimentais é considerada outra vantagem.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ácidos graxos</td>
			<td colspan="2">Condições</td>
			<td colspan="2">Resultados</td>
			<td>Referência</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">PAPAI</td>
			<td colspan="2">Concentração: 200 μM</td>
			<td colspan="2">Acúmulo de lipídios</td>
			<td rowspan="3">Yan et al, 201925.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Exposição de tempo: 24 h</td>
			<td colspan="2">Dano à hepatocita</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">Elevação de transminases</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">PAPAI</td>
			<td colspan="2">Concentração: 50, 100 e 200 μM</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Acúmulo de lipídios</td>
			<td rowspan="2">Xing et al, 201924.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Exposição de tempo: 24 h</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">PAPAI</td>
			<td colspan="2">Concentração: 250 μM , 500 μM, 750 μM e 1.000 μM</td>
			<td colspan="2">Acúmulo de lipídios</td>
			<td rowspan="2">Wang et al, 202026.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Exposição de tempo: 24 h</td>
			<td colspan="2">Redução progressiva da viabilidade celular</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Mistura de OA/PA</td>
			<td colspan="2">Concentração: 1 mM</td>
			<td colspan="2">Acúmulo de lipídios</td>
			<td rowspan="3">Xiao et al, 202027.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Exposição de tempo: 24 h</td>
			<td colspan="2">Não relata lipotoxicidade</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Taxa: 2OA:1PA</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Mistura de OA/PA</td>
			<td colspan="2">Primeiro estimulação com 200 μM e 400 μM de PA e depois segundo estímulo com 200 μM de OA</td>
			<td colspan="2">Acúmulo de lipídios.</td>
			<td rowspan="4">Zeng et al, 202012.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Concentração:400 μM PA: 200 μM OA</td>
			<td colspan="2">A evidência de lipotoxicidade induzida pela AF foi reduzida por estimulação de OA.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Taxa: 2PA:1OA</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Exposição de tempo: 24 h</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Mistura de OA/PA</td>
			<td colspan="2">Concentração: 400 μM PA: 200 μM OA</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Acúmulo de lipídios</td>
			<td rowspan="3">Chen et al, 201823.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Taxa: 2PA:1OA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Exposição de tempo: 24 h</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Mistura de OA/PA</td>
			<td colspan="2">Concentração :50 e 500 μM</td>
			<td colspan="2">Geração de dois tipos de esteatose: esteatose leve e esteatose grave.</td>
			<td rowspan="3">Campos e Guzmán 2021</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Taxa: 2PA:1OA</td>
			<td colspan="2">Simula exposição crônica de sobrecarga lipídica</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Exposição de tempo: 24h, 2 dias,3 dias e 4 dias.</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
</tbody></table>Mesa 1. Cultura hepatocita em condições esteatogênicas. A tabela apresenta o tipo de ácido graxo utilizado, as condições mantidas e os desfechos observados na cultura hepatócica. Pa: Ácido palmítico. Ácido oleico.
Por fim, este modelo é aplicável não apenas ao estudo da esteatose e fígado gorduroso, mas também às vias hepáticas metabólicas, sintéticas e desintoxicação no contexto da esteatose. Além disso, a esteatose in vitro induzida pode fornecer evidências para a identificação de potenciais marcadores da doença, bem como alvos terapêuticos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>ESCO Airstream</td>
			<td>AC2-452+C2:C26</td>
			<td>Class II&#160;Type A2&#160;Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>430513</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 &#956;m, 500 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albimun (BSA)</td>
			<td>Gold Biotechnology, US</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td>BSA Fatty Acid Free for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>31800-022</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>A4766801</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marienfeld, DE</td>
			<td>640010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cell line</td>
			<td>ATCC, US</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Hepatocellular carcinoma human cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Thermo Electronic Corporation,US</td>
			<td>Model: 3110</td>
			<td>Temperature (37 &#176;C &#177; 1 &#176;C), humidity (90% &#177; 5%) , CO2 (5% &#177; 1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope Eclipse</td>
			<td>NIKON, JPN</td>
			<td>Model: TE2000-S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>I9030-4L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O Kit</td>
			<td>Abcam, US</td>
			<td>ab150678</td>
			<td>Kit for histological visualization of neutral fat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 &#956;g/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Beckman, US</td>
			<td>Model: 360 PH/Temp/MV Meter</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Sarstedt, AUS</td>
			<td>86.1253.001</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Sarstedt, AUS</td>
			<td>&#160;86.1254.001</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td>Preparation of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium oleate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, US</td>
			<td>sc-215879A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium palmitate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, US</td>
			<td>sc-215881</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring filter</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>431219</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>T6146-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>25-052-Cl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>3524</td>
			<td>Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>3599</td>
			<td>Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium

A doença hepática gordurosa associada à disfunção metabólica (MAFLD), anteriormente conhecida como doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), é a doença hepática mais prevalente em todo o mundo devido à sua relação com obesidade, diabetes tipo 2 e dislipidemia. Esteatose hepática, o acúmulo de gotículas lipídicas no parnchyma hepático, é uma característica fundamental da doença que precede a inflamação observada na esteatohepatite, fibrose e doença hepática em estágio terminal. O acúmulo de lipídios em hepatócitos pode interferir com o metabolismo adequado de xenobióticos e moléculas endógenas, bem como induzir processos celulares que levem ao avanço da doença. Embora o estudo experimental da esteatose possa ser realizado in vivo,abordagens in vitro para o estudo da esteatose são ferramentas complementares com diferentes vantagens. A cultura hepatocito em meio lipídico-condicionado é uma excelente opção reprodutível para o estudo da esteatose hepática que permite a identificação de processos celulares relacionados ao acúmulo de lipídios, como estresses oxidativos e reticulares, autofagia, proliferação, morte celular, etc, bem como outros testes, incluindo eficácia de drogas, e testes toxicológicos, entre muitas outras aplicações possíveis. Aqui, teve como objetivo descrever a metodologia da cultura celular hepatocitada em meio lipídios condicionados por sobrecarga. As células hepG2 foram cultivadas em RMPI 1640 médio condicionado com palmitato de sódio e oleato de sódio. É importante ressaltar que a razão desses dois lipídios é crucial para favorecer o acúmulo de gotículas lipídicas, mantendo a proliferação celular e uma taxa de mortalidade moderada, como ocorre no fígado durante a doença. A metodologia, a partir da preparação dos estoques de solução lipídica, mistura, além do meio, e cultura hepatócida é mostrada. Com essa abordagem, é possível identificar gotículas lipídicas nos hepatócitos que são prontamente observáveis pela mancha O vermelha-óleo, bem como curvas de taxas de proliferação/mortalidade.

Hepatócitos cultivados no meio esteatogênico apresentam crescimento em toda a superfície do poço; no entanto, hepatócitos gordurosos apresentam menor taxa de crescimento em comparação com células cultivadas no meio de controle. A proporção proposta e concentração de OA e PA, garantem a sobrevivência celular durante a cultura. Semear 1 x 105 células por poço em placas de 24 poços fornece confluência ideal como mostrado na Figura 1.
A via...

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A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Este protocolo pretende ser uma ferramenta para estudar a esteatose e as alterações moleculares, bioquímicas, celulares produzidas pela exposição excessiva de hepatócitos a lipídios in vitro.

Um modelo de esteatose experimental in vitro: cultura celular hepatocitada em meio lipídidamente condicionado

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

Este protocolo é aplicável ao estudo da esteatose hepática, bem como às vias hepáticas, metabólicas, sintéticas e toxificação no contexto da esteatose. As principais vantagens desse método são sua reprodutibilidade e o pouco tempo necessário para obter resultados. Adicione o fato de que oferece dois níveis de esteatose, leve e grave.A esteatose in vitro induzida pode fornecer evidências para a identificação de potenciais marcadores para o diagnóstico da doença, bem como alvos terapêuticos. Este método deve ser aplicado no resultado da esteatose. No entanto, pode ser ajustado para uma ampla gama de células diferentes afetadas por superexposição lipídica, como durante a obesidade e lipidemia.Prepare o RPMI padrão 1640. Suplemento RPMI 1640 cultura média com 10% de FBS ativado por calor, e 1% de solução de estreptomicina de penicilina. Esterilizá-lo usando filtros de 0,22 micrômetros e armazene o suplemento a quatro graus Celsius.Para preparar uma solução de estoque palmitato prepare uma solução de 50 mililitros de palmitato no RPMI padrão 1640 suplementado com 1% de BSA livre de lipídios. Esterilize cerca de cinco a dez mililitros da solução de estoque usando filtros de 0,22 micrômetros e armazene a quatro graus Celsius protegidos da luz por até um mês. Para preparar a solução de estoque oleate prepare uma solução de 50 milimilitos de oleato no RPMI 1640 suplementado.E esterilizar a solução de estoque usando filtros de 0,22 micrômetros. Armazene-o a menos 20 graus Celsius, protegido da luz por até um mês. Para preparar o meio esteatogênico dos estoques previamente preparados, prepare 100 milímetros de uma mistura de 50 micromolar de uma parte palmitate e duas partes oleato.Para níveis leves, despeje uma mistura de 500 micromolar de uma parte palmitato e duas partes oleate para níveis severos no RPMI padrão 1640. E esterilizar usando filtros de 0,22 micrômetros. Guarde a 4 graus Celsius por até uma semana.Alternativamente, para preparar soluções de estoque com os respectivos ácidos graxos usando albumina lipídica livre, dissolver palmitato ou oleato em dois mililitros de etanol absoluto e, em seguida, misturar no volume final do RPMI padrão 1640. Dissolva oleate diretamente armazenando no meio de cultura RPMI padrão 1640. Permita a evaporação do etanol incubando em um banho de água a 70 graus Celsius e misture bem.Esterilize ambas as soluções de estoque usando filtros de 0,22 micrômetros e armazene a solução de estoque palmitato a quatro graus Celsius. E solução de estoque oleate a menos 20 graus Celsius. Assento 0,1 milhões de células Hep G2 por poço em uma placa de 24 poços.Adicione um mililitro do RPMI padrão 1640. Pré-incubar a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono por 24 horas, permitindo a fixação celular. Após a pré cultura, descarte o meio RPMI padrão 1640.E adicione o meio esteatogênico. Descarte o supernasal e adicione um meio esteatogênico fresco a cada 24 horas. Para realizar a avaliação de viabilidade e morfologia, descarte as células supernascidas e desacadas do poço adicionando 500 microliters de 0,05% de trippsina EDTA.Incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Colete as células resuspended em um micro tubo. E centrífuga a 300 vezes G.Então descarte o supernante, adicione 200 microliters de RPMI padrão 1640, e resuspense as células.Adicione 15 microliters de 0,4% da solução azul trypan em um micro tubo fresco. Adicione e misture 15 microliters da suspensão celular anterior. Conte as células manchadas e não manchadas em um hemótmetro e calcule as taxas de viabilidade e mortalidade.Coloque um deslizamento de cobertura de cultura celular em cada poço em uma placa de 24 poços e células hep g2 como descrito no manuscrito do texto. Após a incubação apropriada, lave as células com um mililitro de PBS e descarte o sobrenante. Misture-os com um mililitro de 4% de paraformaldeído na PBS e incubar por uma hora à temperatura ambiente.Descarte o excesso de paraformaldeído e enxágue as células com um mililitro de água destilada. Em seguida, adicione um mililitro de isopropanol de 70% e incubar por cinco minutos. Descarte o excesso de isopropanol e adicione um mililitro da solução Oil-Red O e incubar por 30 minutos.Descarte o excesso de solução Oil-Red O e enxágue com um mililitro de água destilada. Observe as células sob o microscópio a uma ampliação de 400x. Selecione e capture aleatoriamente fotografias de 10 campos ópticos da área completa do poço.Repita a imagem para cada poço. Para avaliar a porcentagem de área manchada de vermelho, abra o software ImageJ e importe arquivos necessários, clique em ajustar e use a ferramenta limiar de cor", defina o parâmetro de matiz para detecção de cores vermelhas. Em seguida, ajuste a saturação e o brilho para a imagem.Compare a área manchada com a área completa do campo óptico, utilizando a ferramenta de partículas de análise e calcule a porcentagem média de cada poço. Acomodar 0,1 milhão de hepatócitos por poço em placas de 24 poços proporciona uma confluência ideal. A viabilidade diminuiu progressivamente à medida que o tempo da cultura aumentava, atingindo o menor de 60% em quatro dias em esteatose grave.Assim, a taxa de mortalidade foi maior em hepatócitos cultivados nas condições esteatogênicas. E aumentou progressivamente com o tempo de exposição a lipídios. O número de células aumentou progressivamente como resultado da proliferação.No entanto, a taxa de proliferação foi menor em esteatose leve em três e quatro dias. Em contrapartida, a esteatose grave foi associada à menor proliferação em 24 horas. As células de coloração com O Vermelho-Óleo demonstraram pelo menos um aumento duplo de gotículas lipídicas em células cultivadas sob condições esteatogênicas.A gordura intracelular aumentou de acordo com o tempo de exposição da cultura no meio esteatogênico. Em esteatose leve, o conteúdo lipídudo foi aumentado a partir do segundo dia, enquanto na esteatose grave foram significativamente elevados a partir das 24 horas. A cultura celular requer experiência prévia.Culturing Hep G2 cells em uma condição padrão antes de usar este protocolo pode ser útil. A preparação do estoque de ácidos graxos também é um ponto crucial. O ácido palmítico é sólido à temperatura ambiente, e precisa ser aquecido antes de sua gestão.Este método deve permitir a análise molecular de diferentes caminhos, incluindo, mas não se limitando à proliferação, apoptose, autofagia, estresse oxidativo e análise farmacológica e toxicológica.

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