Name: a model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium
Uploaded: 2021-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos es estudiante de doctorado en el Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, y contó con el apoyo del Conacyt (CVU: 1002502).

1. Preparación de medio estándar y acondicionado
<ol><li>Para preparar el RPMI 1640 estándar, complemente el medio de cultivo RPMI 1640 con 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS, previamente inactivado por calor) y 1% (v/v) de solución de penicilina-estreptomicina. Conservar el medio a 4 °C.Esterilizar con filtros de 0,22 μm.</li>
	<li>Para preparar la solución de caldo de palmitato, prepare una solución de palmitato de 50 mM en el estándar RPMI 1640 previamente suplementada con 1% de albúmina sérica bovina (...

<ol>
	<li>Younossi, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-alcoholic+fatty+liver+disease+-+a+global+public+health+perspective.">Non-alcoholic fatty liver disease - a global public health perspective.</a> Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).</li><li>Younossi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+perspectives+on+nonalcoholic+fatty+liver+disease+and+nonalcoholic+steatohepatitis.">Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 69 (6), 2672-2682 (2019).</li><li>Eslam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+definition+for+metabolic+dysfunction-associated+fatty+liver+disease:+An+international+expert+consensus+statement.">A new definition for metabolic dysfunction-associated fatty liver disease: An international expert consensus statement.</a> Journal of Hepatology. 73 (1), 202-209 (2020).</li><li>Eslam, M., Sanyal, A. 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Este protocolo pretende proporcionar una estrategia para estudiar la esteatosis in vitro. El cultivo celular es una herramienta poderosa para estudiar aspectos celulares, moleculares, bioquímicos y toxicológicos de las células expuestas a diferentes condiciones. Con este enfoque, la esteatosis se puede visualizar no solo como una etapa de la enfermedad compleja que es MAFLD, sino también como la sobreexposición de los hepatocitos a los lípidos y los posibles resultados resultantes de dicha exposición. Por...

El hígado graso asociado con la disfunción metabólica es altamente prevalente en todo el mundo1,2; se estima que hasta el 25% de la población se ve afectada3. Esta enfermedad anteriormente conocida como enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA), ha actualizado su nomenclatura a disfunción metabólica asociada a la enfermedad del hígado graso (MAFLD) para reflejar con precisión la patogénesis relacionada con la obesidad, la resistencia a la insulina, la diabetes tipo 2 y la dislipidemia, así como los posibles manejos de la enfermedad3,4.
Independientemente del nombre, la enfermedad incluye un amplio espectro de cambios histopatológicos caracterizados por una acumulación anormalmente alta de lípidos en el hígado (>5% de grasa en los hepatocitos5) y podría progresar a través de la acumulación de lípidos típicamente encontrada en la esteatosis simple a esteatohepatitis, que a su vez podría conducir al desarrollo de fibrosis, cirrosis, carcinoma hepatocelular e insuficiencia hepática5,6,7,8. Debido a su creciente prevalencia, se espera que MAFLD se convierta en la primera indicación de trasplante hepático y la principal causa de carcinoma hepatocelular9.
Aunque se ha considerado como una forma benigna o leve de enfermedad del hígado graso, la esteatosis hepática es de hecho la clave metabólica en MAFLD10. Diferentes vías metabólicas se ven afectadas por la acumulación de lípidos en el hígado, incluyendo pero no limitado a la síntesis de lípidos, la exportación y el metabolismo10. La resistencia a la insulina, el estrés oxidativo, el estrés reticular y la disfunción celular están fuertemente asociados a la lipotoxicidad hepática11,12. Por otro lado, los hepatocitos grasos son el objetivo de las especies reactivas de oxígeno, haciendo metabolitos como peróxidos lipídicos, carbonilos proteicos y aductos de ácidos nucleicos13. A nivel celular, los hepatocitos grasos pueden sufrir daño mitocondrial14,senescencia celular15,apoptosis 16,piroptosis12y autofagia17,entre otros eventos.
Los hepatocitos son altamente responsables del metabolismo, la desintoxicación y la síntesis de una amplia gama de moléculas. Muchas de estas funciones podrían verse comprometidas por la acumulación de lípidos observada en la esteatosis. Por lo tanto, es de gran importancia contar con herramientas reproducibles que permitan una evaluación precisa de la esteatosis. En este sentido, los modelos in vitro son fácilmente aplicables y altamente reproducibles. La esteatosis in vitro se ha utilizado con diferentes objetivos16,18,19. Las células HepG2 son ampliamente utilizadas como línea celular de hepatocitos. Tiene ventajas como ser fácil de cultivar y bien caracterizado. Quizás, la única desventaja de las células HepG2 es el hecho de que es una línea celular cancerígena, por lo que esto debe tenerse en cuenta al analizar los resultados. Aquí, se muestra la aplicación de una mezcla de ácidos grasos muy utilizada en cultivo celular: ácido palmítico (PA) y ácido oleico (OA). Tanto la AP como la OA ofrecen resultados diferentes en la cultura20. PA (C 16:0) es el ácido graso saturado más común obtenido de la dieta16. La AF es considerada como un biomarcador de lipogénesis de novo,un paso crucial en el desarrollo de NAFLD21. La AP ha demostrado ser altamente tóxica22; por lo tanto, es posible que no se recomiende inducir esteatosis in vitro. OA (C 18:1) es un ácido graso monoinsaturado. A diferencia de la AP, se ha sugerido que la OA posee propiedades antiinflamatorias y antioxidantes, pudiendo contrarrestar la PA12. Tanto la AF como la OA son los principales ácidos grasos presentes en los triglicéridos, independientemente del estado de salud o enfermedad16. La Tabla 1 proporciona ejemplos del cultivo de hepatocitos con AF, OA y su mezcla, así como los resultados informados12,23,24,25,26,27. Otros ácidos grasos también se han utilizado en el cultivo de hepatocitos, incluyendo el ácido esteárico (C 18:0)28,29,30,ácido linoleico (C 18:1)28,30,31 y sus conjugados (CLA)28,32,ácido palmitoleico (C 16:1)29. Sin embargo, su uso se informa con menos frecuencia en la literatura, tal vez porque su abundancia hepática es menor que PA y OA16.
En conjunto, ambos ácidos grasos se asemejan a la esteatosis in vitro,proporcionando células proliferantes, con mayor muerte celular y menor viabilidad en comparación con las condiciones de control. Vale la pena mencionar que las respectivas sales de estos ácidos grasos están disponibles y también se pueden usar. Uno de los principales problemas a la hora de valorar la sobrecarga lipídica en cultivo de células hepatocitarias se da en la diferenciación entre los modelos toxicológicos y el modelo que mejor representa la esteatosis. Muchos modelos se pueden contabilizar en el primer caso. De hecho, el uso de AF solo podría considerarse entre ellos, y la alta mortalidad es el resultado más evidente12,16,23,24,25,26,27. El uso de dosis altas incluso en el caso de OA también puede considerarse como un modelo toxicológico. El protocolo aquí mostrado es mayor acorde con el desarrollo de esteatosis ya que muestra baja mortalidad en comparación con la observada en otros modelos y permite seguirlo durante varios días con acumulación progresiva de lípidos tal y como ocurre en NAFLD. La posibilidad de evaluar la esteatosis leve y grave a través de condiciones experimentales se considera otra ventaja.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ácidos grasos</td>
			<td colspan="2">Condiciones</td>
			<td colspan="2">Resultados</td>
			<td>Referencia</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">PAPÁ</td>
			<td colspan="2">Concentración: 200 μM</td>
			<td colspan="2">Acumulación de lípidos</td>
			<td rowspan="3">Yan et al, 201925.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tiempo de exposición: 24 h</td>
			<td colspan="2">Daño a hepatocitos</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">Elevación de transaminasas</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">PAPÁ</td>
			<td colspan="2">Concentración: 50, 100 y 200 μM</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Acumulación de lípidos</td>
			<td rowspan="2">Xing et al, 201924.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tiempo de exposición: 24 h</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">PAPÁ</td>
			<td colspan="2">Concentración: 250 μM, 500 μM, 750 μM y 1.000 μM</td>
			<td colspan="2">Acumulación de lípidos</td>
			<td rowspan="2">Wang et al, 202026.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tiempo de exposición: 24 h</td>
			<td colspan="2">Reducción progresiva de la viabilidad celular</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Mezcla de OA/PA</td>
			<td colspan="2">Concentración: 1 mM</td>
			<td colspan="2">Acumulación de lípidos</td>
			<td rowspan="3">Xiao et al, 202027.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tiempo de exposición: 24 h</td>
			<td colspan="2">No reporta lipotoxicidad</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Precio: 2OA:1PA</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Mezcla de OA/PA</td>
			<td colspan="2">Primera estimulación con 200 μM y 400 μM de PA y luego segunda estimulación con 200 μM de OA</td>
			<td colspan="2">Acumulación de lípidos.</td>
			<td rowspan="4">Zeng et al, 202012.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Concentración: 400 μM PA: 200 μM OA</td>
			<td colspan="2">La evidencia de lipotoxicidad inducida por AF se redujo mediante la estimulación de la OA.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Precio: 2PA:1OA</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tiempo de exposición: 24 h</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Mezcla de OA/PA</td>
			<td colspan="2">Concentración: 400 μM PA: 200 μM OA</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Acumulación de lípidos</td>
			<td rowspan="3">Chen et al, 201823.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Precio: 2PA:1OA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tiempo de exposición: 24 h</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Mezcla de OA/PA</td>
			<td colspan="2">Concentración: 50 y 500 μM</td>
			<td colspan="2">Generación de dos tipos de esteatosis: esteatosis leve y esteatosis severa.</td>
			<td rowspan="3">Campos y Guzmán 2021</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Precio: 2PA:1OA</td>
			<td colspan="2">Simula la exposición crónica de la sobrecarga lipídica</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tiempo de exposición: 24 h, 2 días, 3 días y 4 días.</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Cultivo de hepatocitos en condiciones esteatogénicas. La tabla presenta el tipo de ácido graso utilizado, las condiciones mantenidas y los resultados observados en el cultivo de hepatocitos. PA: Ácido palmítico. OA: Ácido oleico.
Finalmente, este modelo es aplicable no solo al estudio de la esteatosis y el hígado graso, sino también a las vías metabólicas hepáticas, sintéticas y de desintoxicación en el contexto de la esteatosis. Además, la esteatosis inducida in vitro podría proporcionar evidencia para la identificación de marcadores potenciales de la enfermedad, así como objetivos terapéuticos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>ESCO Airstream</td>
			<td>AC2-452+C2:C26</td>
			<td>Class II&#160;Type A2&#160;Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top filter</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>430513</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 &#956;m, 500 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albimun (BSA)</td>
			<td>Gold Biotechnology, US</td>
			<td>A-421-10</td>
			<td>BSA Fatty Acid Free for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media RPMI 1640</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>31800-022</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>A4766801</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marienfeld, DE</td>
			<td>640010</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cell line</td>
			<td>ATCC, US</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Hepatocellular carcinoma human cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Thermo Electronic Corporation,US</td>
			<td>Model: 3110</td>
			<td>Temperature (37 &#176;C &#177; 1 &#176;C), humidity (90% &#177; 5%) , CO2 (5% &#177; 1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope Eclipse</td>
			<td>NIKON, JPN</td>
			<td>Model: TE2000-S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>I9030-4L</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O Kit</td>
			<td>Abcam, US</td>
			<td>ab150678</td>
			<td>Kit for histological visualization of neutral fat.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 &#956;g/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Beckman, US</td>
			<td>Model: 360 PH/Temp/MV Meter</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher-Gibco, US</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Sarstedt, AUS</td>
			<td>86.1253.001</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Sarstedt, AUS</td>
			<td>&#160;86.1254.001</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>S5761-1KG</td>
			<td>Preparation of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium oleate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, US</td>
			<td>sc-215879A</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium palmitate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, US</td>
			<td>sc-215881</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring filter</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>431219</td>
			<td>&#160;Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 &#956;m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich, US</td>
			<td>T6146-25G</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>25-052-Cl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>3524</td>
			<td>Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning, US</td>
			<td>3599</td>
			<td>Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium

La enfermedad del hígado graso asociada a la disfunción metabólica (MAFLD), anteriormente conocida como enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), es la enfermedad hepática más prevalente en todo el mundo debido a su relación con la obesidad, la diabetes tipo 2 y la dislipidemia. La esteatosis hepática, la acumulación de gotas lipídicas en el parénquima hepático, es una característica clave de la enfermedad que precede a la inflamación observada en la esteatohepatitis, la fibrosis y la enfermedad hepática en etapa terminal. La acumulación de lípidos en los hepatocitos podría interferir con el metabolismo adecuado de los xenobióticos y las moléculas endógenas, así como inducir procesos celulares que conduzcan al avance de la enfermedad. Aunque el estudio experimental de la esteatosis se puede realizar in vivo, losenfoques in vitro para el estudio de la esteatosis son herramientas complementarias con diferentes ventajas. El cultivo de hepatocitos en medio condicionado por sobrecarga lipídica es una excelente opción reproducible para el estudio de la esteatosis hepática que permite la identificación de procesos celulares relacionados con la acumulación de lípidos, como tensiones oxidativas y reticulares, autofagia, proliferación, muerte celular, etcétera, así como otras pruebas que incluyen la eficacia de los fármacos y las pruebas toxicológicas, entre otras muchas posibles aplicaciones. Aquí, se tuvo como objetivo describir la metodología de cultivo de células de hepatocitos en medio condicionado por sobrecarga lipídica. Las células HepG2 se cultivaron en medio RMPI 1640 acondicionado con palmitato de sodio y oleato de sodio. Es importante destacar que la proporción de estos dos lípidos es crucial para favorecer la acumulación de gotas lipídicas, al tiempo que mantiene la proliferación celular y una tasa de mortalidad moderada, como ocurre en el hígado durante la enfermedad. Se muestra la metodología, a partir de la preparación de las existencias de solución lipídica, mezcla, adición al medio y cultivo de hepatocitos. Con este enfoque, es posible identificar gotas de lípidos en los hepatocitos que son fácilmente observables por tinción de O rojo aceite, así como curvas de tasas de proliferación / mortalidad.

Los hepatocitos cultivados en el medio esteatogénico muestran crecimiento en toda la superficie del pozo; sin embargo, los hepatocitos grasos muestran una tasa de crecimiento más baja en comparación con las células cultivadas en medio de control. La relación y concentración propuesta de OA y PA, garantizan la supervivencia celular durante el cultivo. La siembra de 1 x 105 células por pozo en placas de 24 pozos proporciona una confluencia óptima como se muestra en la Figura 1.</stro...

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A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Este protocolo pretende ser una herramienta para estudiar la esteatosis y los cambios moleculares, bioquímicos, celulares producidos por la sobreexposición de los hepatocitos a los lípidos in vitro.

Un modelo de esteatosis experimental in vitro:cultivo de células de hepatocitos en medio condicionado por sobrecarga lipídica

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

Este protocolo es aplicable al estudio de la esteatosis hepática, así como a las vías hepática, metabólica, sintética y de toxificación en el contexto de la esteatosis. Las principales ventajas de este método son su reproducibilidad y el poco tiempo necesario para obtener resultados. Agregue el hecho de que ofrece dos niveles de esteatosis, leve y grave.La esteatosis inducida in vitro podría proporcionar evidencia para la identificación de marcadores potenciales para el diagnóstico de la enfermedad, así como objetivos terapéuticos. Este método está destinado a ser aplicado en el resultado de la esteatosis. Sin embargo, se puede ajustar a una amplia gama de células diferentes afectadas por la sobreexposición a los lípidos, como durante la obesidad y la lipidemia.Prepare el RPMI 1640 estándar. Suplemento del medio de cultivo RPMI 1640 con un 10% de FBS activado por calor y un 1% de solución de estreptomicina de penicilina. Esterilícelo usando filtros de 0,22 micrómetros y almacene el suplemento a cuatro grados centígrados.Para preparar una solución madre de palmitato, prepare una solución de palmitato de 50 milimolares en el RPMI 1640 estándar complementado con 1% de BSA libre de lípidos. Esterilice entre cinco y diez mililitros de la solución de material utilizando filtros de 0,22 micrómetros y guárdelos a cuatro grados centígrados protegido de la luz durante un mes. Para preparar la solución madre de oleato, prepare una solución de oleato de 50 milimolares en el RPMI 1640 suplementado.Y esterilize la solución de stock utilizando filtros de 0,22 micrómetros. Guárdelo a menos 20 grados centígrados, protegido de la luz hasta por un mes. Para preparar el medio esteatogénico a partir de las existencias preparadas previamente, prepare 100 milímetros de una mezcla micromolar de 50 de una parte de palmitato y dos partes de oleato.Para niveles suaves, vierta una mezcla micromolar de 500 de una parte de palmitato y dos partes de oleato para niveles severos en el estándar RPMI 1640. Y esterilizar con filtros de 0,22 micrómetros. Almacene a cuatro grados centígrados durante un hasta una semana.Alternativamente, para preparar soluciones de stock con los ácidos grasos respectivos mediante el uso de albúmina lipídica libre, disuelva el palmitato o el oleato en dos mililitros de etanol absoluto y luego mezcle el volumen final del estándar RPMI 1640. Disolver el oleato directamente almacenándolo en el medio de cultivo estándar RPMI 1640. Permita la evaporación del etanol incubando en un baño de agua a 70 grados centígrados y mezcle bien.Esterilice ambas soluciones de stock utilizando filtros de 0,22 micrómetros y almacene la solución de caldo de palmitato a cuatro grados centígrados. Y solución de caldo de oleato a menos 20 grados centígrados. Asiento 0.1 millones de células Hep G2 por pozo en una placa de 24 pozos.Agregue un mililitro de RPMI 1640 estándar. Preincubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas, lo que permite la unión celular. Después del pre cultivo, deseche el medio ESTÁNDAR RPMI 1640.Y añadir el medio esteatogénico. Deseche el sobrenadante y agregue un medio esteatogénico fresco cada 24 horas. Para realizar la evaluación de viabilidad y morfología, deseche el sobrenadante y separe las células del pozo agregando 500 microlitros de tripsina EDTA al 0,05%.Incubar durante cinco minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Recoger las células resuspendidas en un micro tubo. Y centrifugar a 300 veces G.Luego desechar el sobrenadante, agregar 200 microlitros de RPMI 1640 estándar y volver a suplir las células.Agregue 15 microlitros de 0.4% de solución azul de tripano en un microtubo fresco. Añadir y mezclar 15 microlitros de la suspensión celular anterior. Cuente las células teñidas y no teñidas en un hemocitómetro y calcule las tasas de viabilidad y mortalidad.Coloque un resbalón de cubierta de cultivo celular en cada pozo en una placa de 24 pozos y seed células Hep G2 como se describe en el manuscrito de texto. Después de la incubación adecuada, lave las células con un mililitro de PBS y deseche el sobrenadante. Mézclalos con un mililitro de paraformaldehído al 4% en PBS e incuba durante una hora a temperatura ambiente.Deseche el exceso de paraformaldehído y enjuague las células con un mililitro de agua destilada. Luego agregue un mililitro de isopropanol al 70% e incube durante cinco minutos. Deseche el exceso de isopropanol y agregue un mililitro de solución de Oil-Red O e incube durante 30 minutos.Deseche el exceso de solución oil-red O y luego enjuague con un mililitro de agua destilada. Observe las células bajo el microscopio a un aumento de 400x. Seleccione y capture aleatoriamente fotografías de 10 campos ópticos del área completa del pozo.Repita las imágenes para cada pozo. Para evaluar el porcentaje de área teñida de rojo, abra el software ImageJ e importe los archivos requeridos, luego haga clic en ajustar y, utilizando la herramienta "umbral de color", defina el parámetro de tono para la detección de color rojo. A continuación, ajuste la saturación y el brillo de la imagen.Compare el área teñida con el área completa del campo óptico, utilizando la herramienta de análisis de partículas y calcule el porcentaje promedio de cada pozo. Sentar 0,1 millones de hepatocitos por pozo en placas de 24 pozos proporciona una confluencia óptima. La viabilidad disminuyó progresivamente a medida que aumentaba el tiempo de cultivo, alcanzando el nivel más bajo del 60% a los cuatro días en la esteatosis severa.En consecuencia, la tasa de mortalidad fue mayor en los hepatocitos cultivados en las condiciones esteatogénicas. Y aumentó progresivamente con el tiempo de exposición a los lípidos. El número de células aumentó progresivamente como resultado de la proliferación.Sin embargo, la tasa de proliferación fue menor en la esteatosis leve a los tres y cuatro días. En contraste, la esteatosis severa se asoció con una menor proliferación en 24 horas. La tinción de células con Oil-Red O demostró al menos un aumento del doble de las gotas de lípidos en las células cultivadas en condiciones esteatogénicas.La grasa intracelular aumentó según el tiempo de exposición del cultivo en el medio esteatogénico. En la esteatosis leve, los contenidos de lípidos aumentaron a partir del segundo día, mientras que en la esteatosis grave fueron significativamente altos a partir de las 24 horas. El cultivo celular requiere experiencia previa.El cultivo de células Hep G2 en una condición estándar antes de usar este protocolo podría ser útil. La preparación del caldo de ácidos grasos también es un punto crucial. El ácido palmítico es sólido a temperatura ambiente y debe calentarse antes de su manejo.Este método debe permitir el análisis molecular de diferentes vías, incluyendo, pero no limitado a la proliferación, apoptosis, autofagia, estrés oxidativo y análisis farmacológico y toxicológico.

Research

JoVE Journal

Medicine

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