Name: injections of aav vectors for optogenetics in anesthetized and awake behaving non-human primate brain
Uploaded: 2021-08-04T14:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من قبل WaNPRC / ITHS P51OD010425 (JTT) ، ومنح المعهد الوطني للصحة (NIH) EY023277 (R01 ل YK) ، و EY030441 (R01 ل GH) ، و MH114126 (RF1 إلى JTT ، و Boaz Levi ، و Ed Lein) ، و MH120095 (UG3 ل JTT و GH) ، و EY028902 (R01 ل RS) ، وأصبحت ممكنة بفضل منح المعاهد الوطنية للصحة OD010425 (P51 ل WaNPRC) وصندوق أبحاث الملوك بجامعة واشنطن A148416. يود المؤلفون أن يشكروا ياسمين الشمايلة وفيكتوريا أومستيد على علم الأنسجة ، وريفوجيو مارتينيز على استنساخ النواقل الفيروسية ، وجون ميشيل على المساعدة في معالجة أنسجة المخ NHP.

<ol>
	<li>Kojima, Y., Robinson, F. R., Soetedjo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+fastigial+nucleus+influence+on+ipsilateral+abducens+activity+during+saccades.">Cerebellar fastigial nucleus influence on ipsilateral abducens activity during saccades.</a> Journal of Neurophysiology. 111 (8), 1553-1563 (2014).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+the+error+signal+in+the+superior+colliculus+impairs+saccade+motor+learning.">Elimination of the error signal in the superior colliculus impairs saccade motor learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8987-8995 (2018).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+GABA+agonist+and+antagonist+injections+into+the+oculomotor+vermis+on+horizontal+saccades.">Effects of GABA agonist and antagonist injections into the oculomotor vermis on horizontal saccades.</a> Brain Research. 1366, 93-100 (2010).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inactivation+and+disinhibition+of+the+oculomotor+vermis+on+saccade+adaptation.">Effect of inactivation and disinhibition of the oculomotor vermis on saccade adaptation.</a> Brain Research. 1401, 30-39 (2011).</li><li>De, A., El-Shamayleh, Y., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+reversible+neural+inactivation+in+macaque+cortex+by+optogenetic+stimulation+of+GABAergic+neurons.">Fast and reversible neural inactivation in macaque cortex by optogenetic stimulation of GABAergic neurons.</a> eLife. 9, 52658 (2020).</li><li>El-Shamayleh, Y., Kojima, Y., Soetedjo, R., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+optogenetic+control+of+Purkinje+cells+in+monkey+cerebellum.">Selective optogenetic control of Purkinje cells in monkey cerebellum.</a> Neuron. 95 (1), 51-62 (2017).</li><li>Mich, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+enhancer+elements+drive+subclass-selective+expression+from+mouse+to+primate+neocortex.">Functional enhancer elements drive subclass-selective expression from mouse to primate neocortex.</a> Cell Reports. 34 (13), 108754 (2021).</li><li>Graybuck, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+viruses+for+combinatorial+cell+subclass-specific+labeling.">Enhancer viruses for combinatorial cell subclass-specific labeling.</a> Neuron. (21), 00159 (2020).</li><li>Michel, J., Benninger, D., Dietz, V., van Hedel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacle+stepping+in+patients+with+Parkinson's+disease.+Complexity+does+influence+performance.">Obstacle stepping in patients with Parkinson's disease. Complexity does influence performance.</a> Journal of Neurology. 256 (3), 457-463 (2009).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li><li>Kaku, Y., Yoshida, K., Iwamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+signals+from+the+superior+colliculus+for+adaptation+of+saccadic+eye+movements+in+the+monkey.">Learning signals from the superior colliculus for adaptation of saccadic eye movements in the monkey.</a> Journal of Neuroscience. 29 (16), 5266-5275 (2009).</li><li>Soetedjo, R., Fuchs, A. F., Kojima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subthreshold+activation+of+the+superior+colliculus+drives+saccade+motor+learning.">Subthreshold activation of the superior colliculus drives saccade motor learning.</a> Journal of Neuroscience. 29 (48), 15213-15222 (2009).</li><li>Kleinbart, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+implant+system+for+multimodal+recording+and+manipulation+of+the+primate+brain.">A modular implant system for multimodal recording and manipulation of the primate brain.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. Annual International Conference. 2018, 3362-3365 (2018).</li><li>Arieli, A., Grinvald, A., Slovin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dural+substitute+for+long-term+imaging+of+cortical+activity+in+behaving+monkeys+and+its+clinical+implications.">Dural substitute for long-term imaging of cortical activity in behaving monkeys and its clinical implications.</a> Journal of Neuroscience Methods. 114 (2), 119-133 (2002).</li><li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Fredericks, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+mechanical+delivery+of+viral+vectors+into+rhesus+monkey+brain.">Methods for mechanical delivery of viral vectors into rhesus monkey brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108730 (2020).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+labeling+of+inhibitory+and+excitatory+cortical+neurons+by+endogenous+tropism+of+adeno-associated+virus+and+lentivirus+vectors.">Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors.</a> Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

وقد أدى التقدم في علم البصريات الوراثي NHP إلى خلق حاجة إلى طرق حقن دقيقة وموثوقة داخل الجمجمة. مزايا الطريقة الموصوفة في هذا التقرير هي أنها غير مكلفة ، وتستخدم مكونات معقمة ويمكن التخلص منها ، ولديها القدرة على استهداف مناطق الدماغ المتنوعة من أي عمق. كما يسمح بالتحكم في سرعة الحقن وحجمه بحكم السرعة التي يمكن بها التحكم في صمام الهواء. يمكن زيادة ضغط الهواء بشكل عابر لإزاحة انسداد ثم تقليله بسرعة لتجنب الإفراط في الحقن اللاحق الذي قد ينتج عن الضغط المستمر. تقلل المكونات التي تستخدم لمرة واحدة من خطر التلوث المتبادل بين مواقع الحقن.
تشمل الخطوات الحاسمة في بروتوكول الحقن هذا بناء قنيات عالية الجودة ، وتحميلها دون إدخال فقاعات ، واختيار مواقع الحقن التي ليست قريبة جدا من بعضها البعض. عادة ما تؤدي الحقن التي ≥1 سم إلى نقل مناطق غير متداخلة ، ولكن هذا الاستدلال يعتمد على النمط المصلي الفيروسي ، والعيار ، والمروج ، والحجم ، والهدف ، وطريقة الكشف. إن اختيار مواقع الحقن غير المتصلة مباشرة يتجنب الارتباكات المحتملة الناتجة عن الاتجار بالأوبسين على طول المحاور العصبية وميل بعض الأنماط المصلية AAV للنقل الرجعي.
يمكن استخدام هذه الطريقة لحقن NHPs أثناء التخدير وفي إطار مجسمة (الشكل 3) أو تنبيه وتثبيت الرأس (الشكل 4). الأول لديه ميزة السماح باستهداف الحقن في إحداثيات مجسمة ، ويسمح بتأكيد بصري لاختراق القنية من خلال استئصال القرنية الحاد (شق الجافية في مستيقظ ، من خلال بضع القحف المزمن ، يزيد من خطر العدوى). يتميز النهج الأخير بمزايا تقليل عدد جراحات البقاء على قيد الحياة وبالتالي الضغط على الحيوان ، كونه متوافقا مع التسجيلات الكهروفسيولوجية أثناء السلوك ، واستخدام نفس الإطار الإحداثي والأجهزة المستخدمة لإدخال الألياف البصرية لتجارب ما بعد الحقن. يمكن تحسين تقنية الحقن في القرود المستيقظة عن طريق إجراء الحقن من خلال الجافية الاصطناعية13،14،15. وهذا من شأنه أن يمنح مزايا إضافية للتصور المباشر لمواقع الحقن وتألق الأنسجة الذي يشير إلى النقل الناجح.
تم استخدام العديد من تقنيات حقن AAV الأخرى في NHPs. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير جهاز حقن متعدد القنوات لتوصيل ناقلات AAV بشكل موحد إلى المناطق القشرية NHP الكبيرة16. يمكن الحصول على نتائج مماثلة باستخدام التسليم المعزز بالحمل الحراري17,18. تهدف هذه الطرق إلى زيادة انتشار النقل إلى أقصى حد ، وهو هدف مهم ولكنه يختلف عن الدقة المكانية التي تهدف طريقتنا إلى تحقيقها.
طريقة بديلة أخرى هي حقن ناقلات AAV من خلال أنابيب البورسليكات التي يتم شطبها إلى طرف حاد على أحد طرفيها وربطها بحقنة هاميلتون علىالطرف الآخر 5,6. هذه الطريقة لديها الكثير من القواسم المشتركة مع الطريقة الموضحة في هذه الورقة. يتم الاحتفاظ بالناقل الفيروسي في طول الأنابيب ، ويتم ملء المساحة الموجودة في الأنابيب خلف الفيروس بالزيت المصبوغ ، ويتم رصد تدفق الناقل عن طريق حركة الغضروف المفصلي الناقل للنفط. تتطلب هذه التقنية البديلة معدات وتحضيرا أقل ، ولكنها تتطلب سحب الزيت إلى أنابيب البورسليكات من خلال الطرف المشطوف عن طريق الضغط السلبي وتحميل الناقل عبر نفس الطريق لاحقا. هذا يؤدي حتما إلى آثار النفط التي يتم تسليمها إلى الدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، في تجربتنا ، يجب أن يكون قطر أنابيب البورسليكات ~ 350 ميكرومتر لاختراق الجافية حتى عندما تكون مشطوفة ، وبالتالي تسبب أضرارا ميكانيكية أكبر من القنية المعدنية الأرق الموصوفة في هذه الورقة (الشكل 2D). تم استخدام أنابيب 30 جم لأن حمل الإبزيم الحرج مرتفع بما يكفي للتوسط في اختراق الجافية على الرغم من طوله 1-10 سم ، لأنه يناسب أنبوب PTFE بإحكام ، ولأنه نادرا ما يصبح مسدودا. أنابيب 33 G تسد وتنحني بسهولة أكبر وأكثر صعوبة للتزاوج مع أنابيب PTFE. أنابيب 36 G ليست قاسية بما فيه الكفاية لاختراق NHP الأم الجافية.
تقنية حقن بديلة أخرى هي تزاوج خرج مضخة الهواء إلى الجزء الخلفي من ماصة زجاجية محملة بالمتجه ومسحوبة19. يتم إجبار المتجه من طرف الماصة عن طريق ضغط الهواء المباشر والمتقطع من المضخة ، مما يلغي الحاجة إلى الزيت. على غرار طريقة الأنبوب الواحد الموضحة أعلاه ، فإن عدم وجود أي تقاطعات مادية بين الغضروف المفصلي وطرف القنية يقلل من خطر التسرب. ومع ذلك ، فإن المستدق الحاد والنصائح الدقيقة للماصات الزجاجية تمنعها من اختراق NHP dura أو استهداف الهياكل العميقة.

عادة ما ينطوي علم البصريات الوراثي في الرئيسيات غير البشرية (NHPs) على حقن الناقل الفيروسي مباشرة في الدماغ. تعتمد فئة واحدة من النواقل المناسبة تماما لهذا التطبيق على الفيروس المرتبط بالغدي (AAV). تتكون هذه النواقل من قفيصة بروتين تحيط بجينوم الحمض النووي أحادي الخيط الذي يتكون بدوره من مروج ، وجين أوبسين ، واختياريا ، عناصر أخرى لترميز البروتين وتنظيم الجينات. وقد يسر التقدم المحرز في الاستنساخ الجزيئي التلاعب بهذه المكونات والجمع بينها من أجل تطوير ناقلات جديدة. وبالتالي ، فإن مجموعة ناقلات AAV التي يحتمل أن تكون مفيدة ل NHP البصريات الوراثية كبيرة وتنمو بسرعة.
في الوقت الحاضر ، تتطلب فائدة ناقل AAV لعلم البصريات الوراثي NHP الاختبار في الجسم الحي. وتشكل هذه الحقيقة عائقا كبيرا أمام التقدم. يجب استخدام الحيوانات بشكل مقتصد ، ويتطلب اختبار ناقلات متعددة في واحد وضع مواقع الحقن بحكمة بالنسبة للبنية العصبية وفصلها جيدا بالنسبة لانتشار الفيروس. يتطلب التقييم النسيجي الدقيق أن تكون الحقن دقيقة مكانيا وحجميا. تم تكييف تقنية الحقن المستخدمة سابقا للتوصيل البؤري للعوامل الدوائية1،2،3،4 وتبسيطها لإجراء مثل هذه الحقن. تقنية الحقن هذه غير مكلفة ، وتستخدم مكونات يمكن التخلص منها وتعقيمها ، ويمكن استخدامها في القرود المخدرة أو المستيقظة ، ويمكن استخدامها لاستهداف مناطق الدماغ المتنوعة من أي عمق. يصف البروتوكول التالي الإجراءات خطوة بخطوة لتصنيع المكونات التي يمكن التخلص منها وإجراء الحقن في دماغ NHP. تتم مناقشة مزايا وعيوب هذه التقنية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment: Stereotaxic set</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allen keys</td>
			<td>BONDHUS</td>
			<td>10936</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula holder</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1770</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier (manipulator)</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1404</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier platform</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier stand</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1449</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye, ear, mouth bars</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic base</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1210</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: Cannula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Luer-lock syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannulas*</td>
			<td>(homemade - see below)</td>
			<td>NA</td>
			<td>steam (autoclave)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colored oil**</td>
			<td>(homemade - see below)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator (for tube rack)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-08057-10</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>23-404</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microbeads</td>
			<td>Lumafluor</td>
			<td>R170</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10003M</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>22-161</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>3060004</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rack</td>
			<td>homemade</td>
			<td>NA</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector solution</td>
			<td>(homemade)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: Electric air pump set</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric air pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot pedal</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>3260</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube cover</td>
			<td>EZ Drape</td>
			<td>A400-1000</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: General surgery tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>azlon</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>277-10-235</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double pronged tissue pick</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18067-11</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drapes</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJP3004</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>6-118</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>Q9R-5400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bits</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>277-82-87</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>NON26334</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic mosquito forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>7-2, 7-4</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light handles</td>
			<td>SKYTRON</td>
			<td>Stellar XL</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle hodler</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>8-2</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periosteal elevator</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>18-1968</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>17-4800</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>BAXTER</td>
			<td>2F7122</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>372610</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>5-12, 5-114</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senn retractors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>28065</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>Triumph Micro</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction</td>
			<td>medela</td>
			<td>200-4869</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction tip</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNDFR12S</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction tube</td>
			<td>COVIDEN</td>
			<td>8888301614</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gowns</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJP2002S</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical pens &#38; ruler</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJSM03</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>COVIDEN</td>
			<td>SL-635</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>6-114</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Towel clamps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>7-504</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood swabs</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>MDS202095</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: *cannulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle</td>
			<td>EXELINT INTERNATIONAL</td>
			<td>26437</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>K-TUBE</td>
			<td>K30R</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tube</td>
			<td>ZEUS</td>
			<td>216200</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: **colored oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Candle Dye Concentrate</td>
			<td>PremiumCraft</td>
			<td>Red/Pink</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Vi-Jon</td>
			<td>S0883</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injections of aav vectors for optogenetics in anesthetized and awake behaving non-human primate brain

أحدثت التقنيات البصرية الجينية ثورة في أبحاث علم الأعصاب وهي على وشك أن تفعل الشيء نفسه في العلاج الجيني العصبي. ومع ذلك ، فإن الاستخدام السريري لعلم البصريات الوراثي يتطلب إثبات السلامة والفعالية في النماذج الحيوانية ، ومن الناحية المثالية في الرئيسيات غير البشرية (NHPs) ، بسبب تشابهها العصبي مع البشر. عدد المتجهات المرشحة التي يحتمل أن تكون مفيدة لعلم الأعصاب والطب هائل ، ولا توجد حتى الآن وسائل عالية الإنتاجية لاختبار هذه النواقل. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تقنيات لإجراء حقن متعددة دقيقة مكانيا وحجميا للناقلات الفيروسية في دماغ NHP والتي يمكن تحديدها بشكل لا لبس فيه من خلال علم الأنسجة بعد الوفاة. الموصوفة هنا هي مثل هذه الطريقة. يتم تصنيع قنيات الحقن من أنابيب البولي تترافلورو إيثيلين وأنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ. هذه القنيبات قابلة للتعقيم ، ويمكن التخلص منها ، ولها أحجام تحميل منخفضة ، مما يجعلها مثالية لحقن محاليل ناقلات فيروسية باهظة الثمن وعالية التركيز. يملأ الزيت المعدني الخامل المصبوغ باللون الأحمر المساحة الميتة ويشكل غضروفا مفصليا مرئيا بمحلول متجه ، مما يسمح بقياس فوري ودقيق لمعدلات الحقن وأحجامه. يتم تحميل الزيت في الجزء الخلفي من القنية ، مما يقلل من خطر الحقن المشترك مع الناقل. يمكن تحميل Cannulas في 10 دقائق ، ويمكن إجراء الحقن في 20 دقيقة. هذا الإجراء مناسب تماما للحقن في الحيوانات المستيقظة أو المخدرة. عند استخدامه لتقديم ناقلات فيروسية عالية الجودة ، يمكن أن ينتج هذا الإجراء تعبيرا قويا عن البروتينات البصرية الجينية ، مما يسمح بالتحكم البصري في النشاط العصبي والسلوك في NHPs.

لإثبات التعبير الجيني المحور عن طريق الحقن المجسمة في الجسم الحي في دماغ NHP باستخدام طريقة الحقن الجراحية الموضحة هنا ، تم اختيار اثنين من النواقل التي تحتوي على معززات تقود التعبير عن بروتين الفلورسنت الأصفر الفائق -2 (SYFP2) في أنواع الخلايا العصبية المتميزة 8,9. تم تعبئة النواقل الفيروسية في قفيصة PHP.eB10 ، التي تم تنقيتها بواسطة الطرد المركزي لليوديكسانول ، ثم تركزت إلى عيار عال (>1E13 الجينوم الفيروسي / مل) كما تم قياسه بواسطة qPCR. تم حقن حجم 0.5 ميكرولتر في كل من الأعماق العشرة على طول عشرة مسارات عبر القشرة الدماغية لحجم حقن إجمالي قدره 5 ميكرولتر / مسار. يوضح الشكل 3A-C تعبير SYFP2 عن طريق التلطيخ المناعي المضاد ل GFP بعد 113 يوما من حقن متجه AAV الخاص بالفئة الفرعية PVALB ، CN2045 ، في القشرة البصرية الأولية لذكر بالغ من المكاكا نيميسترينا. تم الكشف عن الجين المتحول SYFP2 بقوة في العديد من الخلايا العصبية غير الهرمية المنتشرة عبر العمق القشري ، وكانت معظم الخلايا العصبية المعبرة عن SYFP2 أيضا مناعية ل PVALB7. يوضح الشكل 3D تعبير SYFP2 الأصلي في القشرة الحركية الأولية بعد 64 يوما من حقن متجه AAV الخاص بالفئة الفرعية للخلايا العصبية L5 ، CN2251. تحتوي جميع الخلايا العصبية التي تحمل علامة SYFP2 على مورفولوجيا هرمية واضحة مع سوماتا تقتصر على الطبقة 5 والتشعبات القمية السميكة المميزة. تظهر هذه البيانات بشكل لا لبس فيه التحكم الدقيق في التعبير الجيني المحور في مجموعات مختارة من الخلايا العصبية القشرية الجديدة في دماغ NHP عن طريق الحقن المجسمة لنوع الخلايا التي تستهدف ناقلات AAV.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig3v2.jpg"> الشكل 3: مثال على تعبير SYFP2 الخاص بنوع الخلية بوساطة متجهات AAV التي يتم حقنها في دماغ NHP . (A) التصوير المجهري الضوئي اللامع لمقطع ثابت من قشرة المكاك البصرية الأولية بعد 113 يوما من حقن متجه AAV خاص بفئة PVALB. شريط الميزان: 1 مم.  (ب، ج) صورة تكبير أعلى للمنطقة المربعة تظهر في A. (ب) إشارة مضادة ل GFP. (ج) إشارة مضادة ل PVALB. أشرطة المقياس: 250 ميكرومتر (D) التصوير المجهري الضوئي Epifluororescence من التألق الأصلي SYFP2 في قسم ثابت من قشرة المكاك الحركية الأولية بعد 64 يوما من حقن متجه AAV خاص بالطبقة 5 خارج الدماغ. شريط المقياس: 500 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig3v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
لإثبات فائدة تقنية الحقن هذه للتلاعبات البصرية الفسيولوجية العصبية والسلوكية ، تم إجراء ثلاث تجارب ، كل منها على مختلف (Macaca mulatta). في التجربة الأولى (الشكل 4A-D) ، تم حقن ناقلات AAV التي تحمل الجين المحوري channelrhodopsin-2 (AAV1-hSyn1-ChR2-mCherry) في كوليكولوس العلوي الأيسر (SC). تم حقن المتجه كل 250 ميكرومتر على عمق 19 لما مجموعه 12 ميكرولتر. في التجربة الثانية (الشكل 4E-G) ، تم حقن 3 ميكرولتر من محلول AAV1-hSyn-ArchT-EYFP في النواة الشبكية tegmenti pontis (NRTP). في التجربة الثالثة (الشكل 4H-K) ، تم حقن 24 ميكرولتر من محلول AAV9-L7-ChR2-mCherry في قشرة المخيخ 6. بعد ستة إلى ثمانية أسابيع من كل حقنة ، تم إدخال ألياف بصرية وقطب التنغستن في الدماغ عبر أنبوب توجيه مزدوج البرميل (الشكل 1G).
يوضح الشكل 4B استجابة خلية عصبية SC للضوء الأزرق (450 نانومتر). أنتج الضوء المستمر (1.2 ثانية) عند 40 ميجاوات سلسلة من إمكانات الحركة المتتالية (الشكل 4B ، الأعلى). فشلت نبضات الضوء التي تبلغ مدتها 1 مللي ثانية في استحضار إمكانات الفعل عند 40 ميجاوات (الشكل 4B ، الوسط) ولكنها استحضرت إمكانات الحركة بشكل موثوق عند 160 mW ، وهو مستوى الطاقة الآخر الوحيد الذي تم اختباره ، مع زمن انتقال يبلغ 2.7 ± 0.6 مللي ثانية (الشكل 4B ، أسفل). أثار قطار النبض (160 ميجاوات، التردد: 300 هرتز، دورة العمل: 15٪، المدة: 300 مللي ثانية) السكاديس بشكل متسق بمتوسط زمن انتقال يبلغ 97 ± 32 مللي ثانية، ومتوسط سعة 10.4 درجة ومتوسط زاوية 47 درجة (صعودا ويمينا؛ ومتوسط سعة يبلغ 10.4 درجة، ومتوسط زاوية 47 درجة (صعودا ويمينا؛ ومتوسط سعة يبلغ 10.4 درجة، ومتوسط زاوية 47 درجة (صعودا ويمينا؛ ومتوسط سعة يبلغ 10.4 درجة، ومتوسط زاوية 47 درجة (صعودا وهبوطا؛ ومتوسط سعة؛ ومتوسط زمن انتقال يبلغ 47 درجة؛ ومتوسط زمن انتقال يبلغ 97 و32 مللي ثانية، ومتوسط سعة يبلغ 10.4 درجة، ومتوسط زاوية يبلغ 47 درجة (صعودا ويمينا؛ ومتوسط سعة دوران يبلغ 10.4 درجة، ومتوسط زاوية 47 درجة (صعودا ويمينا؛ ومتوسط سعة 10.4 درجة، ومتوسط زاوية 47 درجة (صعودا الشكل 4 جيم).
وتمشيا مع الدراسات التي عدلت كسب الساكيد باستخدام التحفيز الكهربائي دون العتبة ل SC 11,12 ، فإن التحفيز البصري ل SC بعد 15 ° و18 ° و 20 ° يسارا وهبوطا (225 °) يقلل تدريجيا من اكتساب الساكيد (الشكل 4D). تطلب هذا الانخفاض في الكسب حوالي 250 تجربة (دوائر خضراء) للعودة إلى كسب ما قبل التكيف (الدوائر السوداء) ، مما يؤكد أساسه في اللدونة على المدى الطويل.
في التجربة الثانية (الشكل 4E) ، تم قمع إسقاط الألياف الطحلبية من NRTP إلى الفيرميس الحركي العيني (OMV) للقشرة المخيخية (الفصيصات VIc و VII) بصريا. يوضح الشكل 4F الألياف الطحلبية والورود ذات العلامات الفلورية في OMV (داخلي). تم تسليم ضوء الليزر الأصفر (589 نانومتر) إلى OMV عبر الألياف البصرية ، وتم استخدام قطب التنغستن القريب لتسجيل نشاط خلية Purkinje. يوضح الشكل 4G نشاط الارتفاع البسيط قبل (رمادي) وبعد (برتقالي) التعطيل البصري الجيني لإسقاطات NRTP (الشكل 4G ، الأعلى). قبل التعطيل ، أظهرت خلية Purkinje نمط انفجار مزدوج ل 12 درجة من السكادات اليمنى (الشكل 4G ، الوسط ، الرمادي). أثناء التعطيل ، انخفض معدل إطلاق النار وتغير إلى نمط توقف مفاجئ (الشكل 4G ، الوسط ، البرتقالي). تشير مقارنة هذين النمطين من الاستجابة إلى أن مدخلات الألياف الطحلبية إلى خلايا Purkinje تؤثر على مرحلة تباطؤ الساكيد عن طريق قيادة الانفجار الثاني (الشكل 4G ، الوسط ، الأخضر). تم تقليل تباين السكاديس إلى اليمين أثناء التعطيل البصري الوراثي ، بما يتفق مع فكرة أن بعض التباين من تجربة إلى تجربة في مقاييس الساكيد يرجع إلى التباين في الإشارات التي تحملها الألياف الطحلبية (الشكل 4G ، القاع ، البرتقالي).
في التجربة الثالثة (الشكل 4H) ، تم تحفيز خلايا Purkinje من OMV بصريا (الشكل 4I). زاد قطار من نبضات الضوء القصيرة (نبضات 1.5 مللي ثانية ، 65 ميجاوات ، 50 هرتز) من نشاط الارتفاع البسيط لخلية Purkinje معزولة (الشكل 4J ، الأعلى). غالبا ما تثير نبضات الضوء الفردية التي تبلغ 1.5 مللي ثانية >1 ارتفاع بسيط (الشكل 4J ، الأسفل). تنشيط السنبلة البسيطة البصرية الجينية ، الذي تم توقيته ليحدث أثناء الساكيد (نبضة ضوئية 10 مللي ثانية ، 60 ميجاوات) ، وزيادة سعة الساكيد (الشكل 4K) ، مما يؤكد الدور المثبط لخلايا Purkinje على مولد الانفجار الحركي العيني.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig4v2.jpg"> الشكل 4: ملخص ثلاث تجارب بصرية جينية أجريت على القرود المستيقظة. (A-D) أجريت التجربة 1 ، الإثارة العصبية الشاملة: الحقن الفيروسي ، والتحفيز بالليزر ، وتسجيل الوحدة في كوليكولوس العليا (A). (ب) نشاط الوحدة التمثيلية الناجم عن التحفيز بالليزر. (C) ، المكونات الأفقية (العليا) والرأسية (الوسطى) لحركات العين والمخطط النقطي لنشاط الوحدة (أسفل) التي يثيرها التحفيز بالليزر. (د) جلسة تمثيلية للتكيف مع الساكيد الناجم عن التحفيز بالليزر. تم تسليم التحفيز (100 نبضة ليزر 0.5 مللي ثانية) 80 مللي ثانية بعد كل ساكيد (مضمن). انخفض كسب Saccade (سعة الساكيد / سعة الهدف) تدريجيا عبر التجارب. (ه-ز) التجربة 2 ، تثبيط المسار المحدد: تم حقن ناقل فيروسي في النواة الشبكية tegmenti pontis ، وتم إجراء التحفيز بالليزر وتسجيل الوحدة في فيرميس حركي العين (E). (و) القسم النسيجي من الفيرميس الحركي العيني الذي يظهر ألياف الطحالب المصنفة (شريط الميزان: 1 مم) وورداتها (مضمن، شريط مقياس: 100 ميكرومتر). (ز) نشاط خلية بوركينجي (أعلى: نقطي، وسط: متوسط معدل إطلاق النار) ومسارات السكاديس الموجهة بصريا (أسفل) مع وبدون تحفيز الليزر. الرمادي: تجارب إيقاف تشغيل الليزر، البرتقالي: الليزر في التجارب، الأخضر: الفرق بين الرمادي والبرتقالي. (H-K) التجربة 3 ، التنشيط الخاص بنوع الخلية: تم إجراء الحقن الفيروسي ، والتحفيز بالليزر ، وتسجيل الوحدة في فيرميس حركي العين (H). (I) القسم النسيجي من الفيرميس الحركي العيني الذي يظهر خلايا Purkinje المسماة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر (J) نشاط ارتفاع بسيط لخلية Purkinje يثيره التحفيز بالليزر. الجزء العلوي: مخطط نقطي من 14 تجربة. أسفل: تتبع الجهد من تجربة تمثيلية واحدة. (ك) مسارات السكاديس الموجهة بصريا مع وبدون التحفيز بالليزر. زادت نبضة الضوء التي تبلغ 10 مللي ثانية أثناء السكاديس من سعات الساكيد. مسارات الساكيد الفردية (سماوية) ومتوسطها (أزرق) في تجارب الليزر. مسارات الساكيد الفردية (الرمادي الفاتح) ومتوسطها (الرمادي الداكن) في تجارب إيقاف الليزر. كان الطول الموجي للضوء 450 نانومتر في التجربتين 1 و 3 وكان 589 نانومتر في التجربة 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig4v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain at JoVE.com

Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain

وكما هو مطبق حاليا، فإن علم البصريات الوراثي في الرئيسيات غير البشرية يتطلب حقن النواقل الفيروسية في الدماغ. يجب أن تكون طريقة الحقن المثلى موثوقة ، وبالنسبة للعديد من التطبيقات ، قادرة على استهداف المواقع الفردية ذات العمق التعسفي التي يتم تحديدها بسهولة وبشكل لا لبس فيه في علم الأنسجة بعد الوفاة. يتم تقديم طريقة حقن مع هذه الخصائص.

حقن ناقلات AAV لعلم البصريات الوراثي في الدماغ الرئيسيات غير البشرية المخدر والمستيقظ

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of ...

تتضمن العديد من الدراسات العلاجية الجينية والعلمية العصبية حقن ناقلات AAV في أدمغة الرئيسيات غير البشرية. لكي تنجح هذه الدراسات ، يجب أن تكون تقنية الحقن موثوقة. تقنية الحقن لدينا فورية ودقيقة.يعمل هذا الإجراء بشكل جيد للحقن في الحيوانات المخدرة أو المستيقظة. لدينا قنية محلية الصنع سهلة التعامل معها ومنخفضة التكلفة. سيوضح الإجراء كيفن ماي ، وهو فني هندسي من مختبري.للبدء ، قم بتخفيف طرف إبرة تحت الجلد بقياس 30 ملم 13 ملم باستخدام مطحنة قرص. ثم ، قطع قطعة من أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ إلى طول اعتمادا على عمق منطقة الدماغ المستهدفة. باستخدام مطحنة الأقراص ، قم بشطب أحد طرفي الأنبوب المقطوع وقم بتنعيم الطرف الآخر.Deburr داخل الأنبوب مع بروش. بعد ذلك ، قم بقطع قطعة من أنابيب PTFE إلى طول مناسب لحجم محلول المتجه المراد تحميله. قم بإشعال طرفي الأنبوب عن طريق إدخال إبرة تحت الجلد المخففة.أدخل الإبرة تحت الجلد المخففة حوالي خمسة ملليمترات في أحد طرفي أنبوب PTFE. ثم أدخل الطرف غير المشطوف من أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ حوالي خمسة ملليمترات في الطرف الآخر. اختبر القنية عن طريق حقن المياه المصفاة من خلال محور الإبرة تحت الجلد.تأكد من أن الماء يخرج من طرف أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ المشطوف بسلاسة وأن الماء لا يتسرب من أي من التقاطعين. بعد اختبار القنية ، ضعها في كيس الأوتوكلاف وقم بتعقيمها عن طريق التعقيم. انقل المحلول المتجه برفق إلى أنبوب PCR معقم باستخدام ماصة P-20 ، مع تجنب تكوين الفقاعة.بعد ذلك ، قم بإرفاق القنية مع الطرف المشطوف المواجه لأسفل بحامل ستيريوتاكسي موجه رأسيا. ثم قم بتوصيل حقنة قفل luer سعة ملليلتر واحد بمحور الإبرة تحت الجلد في الكانيولا. اغمر الطرف المشطوف في محلول المتجه.بعد ذلك ، ضع ضغطا سلبيا لطيفا باستخدام حقنة سعة ملليلتر واحد لتحميل المحلول في القنية مع تتبع الغضروف المفصلي بصريا بين المحلول والهواء. بمجرد تحميل محلول المتجه ، استمر في الضغط السلبي اللطيف حتى يصل المحلول إلى محور الإبرة. ثم ، قم بإزالة حقنة المليلتر الواحد وحقن الزيت المعدني الملون ببطء على طول الجدار الداخلي لمحور الإبرة تحت الجلد ، مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء.قم بتوصيل محور الإبرة تحت الجلد بأحد المنفذين المفتوحين لقفل قفل luer ثلاثي الاتجاهات. ثم أغلق المنفذ. املأ حقنة سعة ملليلتر واحد بالهواء وقم بتوصيلها بأي من المنفذين الآخرين.أخيرا ، أغلق المنفذ المتبقي من السدادة لتوصيل المحقنة بالقنية. إن ربط المحقنة بالهواء في السدادة ، وتحويل هذا الهواء إلى الميناء غير المأهول يمنعه من دفع محلول المتجه مرة أخرى إلى أسفل الكانيولا. ادفع الهواء ببطء من المحقنة إلى الكانيولا.بمجرد ظهور الزيت الملون عند طرف الإبرة الحادة في أنبوب PTFE ، تحقق من وجود هواء بين المحلول والزيت الملون. استمر في تطبيق الضغط الإيجابي حتى تظهر قطرة من محلول المتجه عند طرف القنية المشطوف. ثم ، أغلق السدادة لمنع المتجه من الخروج من القنية عن طريق الجاذبية.بمجرد تحميل محلول المتجه ، قم بلصق القنية على المتلاعب المجسم. بعد ذلك ، لتوصيل السدادة بمضخة الهواء الكهربائية ، خذ أنبوب المضخة من المساعد غير المعقم. أمسك بموصل قفل luer من خلال جدار الأكمام المعقمة.قم بإسقاط طوق الأكمام ، مما يسمح لها بالتمدد على طول الأنبوب عن طريق الجاذبية. بعد ذلك ، قم بتثبيت الإيقاف وربط الأكمام بإحكام حول موصل قفل luer. بعد ذلك ، اختبر مضخة الهواء والقنية عن طريق ضبط مضخة الهواء على ضغط منخفض ، قبل تشغيلها وزيادة الضغط حتى يتقدم الزيت عبر القنية وتظهر قطرة من محلول ناقل عند طرف القنية.قم بلصق مسطرة بلاستيكية بأنبوب PTFE لقياس حركة الغضروف المفصلي أثناء الحقن. ثم ، قم بقيادة القنية لأسفل باستخدام المتلاعب المجسمة حتى يصل الطرف إلى السطح ويسجل العمق. قم بقيادة القنية إلى أعمق موقع ليتم حقنه على طول المسار.سوف يغمر السطح عند الاتصال. لتقليل سوء الاستهداف بسبب ضغط الأنسجة ، قم بدفع القنية لأسفل وتجاوز أعمق موقع حقن بمقدار 500 ميكرومتر. ثم ، تراجع ببطء.البدائل الأخرى هي دفع القنية ببطء أو قيادتها بسرعة والانتظار في القاع لمدة دقيقة إلى خمس دقائق. بمجرد وضع القنية في أعمق موقع حقن ، استخدم مضخة الهواء الكهربائية لحقن 0.5 ميكرولتر من محلول المتجه على مدار 10 إلى 30 ثانية. تأكد من تدفق الحقن عن طريق تتبع الغضروف المفصلي بين الزيت الملون والمحلول المتجه في أنبوب PTFE.بعد الانتظار لمدة دقيقة واحدة ، اسحب القنية إلى موقع الحقن التالي على طول المسار. بعد الحقن النهائي ، اترك القنية في مكانها لمدة 10 دقائق لتجنب تدفق النواقل. ثم ، قم بسحب القنية وتخلص منها في حاوية حادة للمخاطر البيولوجية.أنتج حقن ناقلات AAV التي تحمل قناة رودوبسين II المتحولة في كوليكولوس العلوي الأيسر ، متبوعا بالتحفيز بالضوء الأزرق المستمر عند 40 مللي واط ، سلسلة من إمكانات العمل المتتالية. فشلت نبضات الضوء التي تبلغ مدتها مللي ثانية واحدة في استحضار إمكانات الحركة عند 40 مللي واط ، ولكنها استحضرتها بشكل موثوق عند 160 مللي واط. أدى التحفيز البصري للكوليكولوس المتفوق الناجم عن السكاديس الموجهة بصريا إلى تقليل اكتساب الساكيد تدريجيا.ويتسق بطء هذا التغيير مع اللدونة المستحثة بصريا. توصيل ضوء الليزر الأصفر إلى فيرميس حركي العين بعد حقن AAV في النواة الشبكية tegmentae pontis قمع نشاط الألياف الطحلبية ، وهو مدخلات إلى المخيخ. قلل هذا القمع من نشاط خلية Purkinje ، وهو ناتج من المخيخ.أثناء القمع البصري الوراثي ، انخفض معدل إطلاق النار وتغير إلى نمط انفجار المسام ، مما يشير إلى أن مدخلات الألياف الطحلبية المثبطة لخلايا Purkinje تؤثر على مرحلة تباطؤ الساكيد عن طريق قيادة الانفجار الثاني. تم التعبير عن قناة رودوبسين حصريا في خلايا Purkinje في فيرميس حركية العين. أدى توصيل نبضات الضوء القصيرة إلى زيادة نشاط السنبلة البسيط لخلية Purkinje المعزولة.وكثيرا ما أثارت نبضة ضوئية واحدة مدتها 1.5 مللي ثانية أكثر من ارتفاع بسيط واحد. تنشيط السنبلة البسيطة البصرية الوراثية التي تم توقيتها لتحدث أثناء الساكيد زادت من سعة الساكيد ، مما يؤكد الدور المثبط لخلايا Purkinje على مولد انفجار المحرك العيني . يمكن لفقاعات الهواء في القنية أن تعطل الغضروف المفصلي الناقل للنفط ، وتعقد تحديد أحجام الحقن ، وتمنع التحكم الدقيق في معدل التدفق.لهذه الأسباب ، يعد تحميل المحاليل المتجهة بدون فقاعات هواء أمرا بالغ الأهمية لهذا الإجراء. بعد ستة إلى ثمانية أسابيع من الحقن ، يمكن إجراء التلاعب البصري الوراثي ويمكن معالجة أنسجة المخ للتحليل النسيجي. تسمح هذه التقنية للباحثين باختبار العديد من النواقل في عدد قليل من الحيوانات ، مما يسهل بدوره تطوير ناقلات جديدة والتحقق من صحتها.وهناك مجال معين من مجالات الاهتمام الحالي يتمثل في تطوير النواقل التي ستستهدف أنواعا محددة من الخلايا العصبية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC وصفها من الخلايا العصبية من القوارض والإنسان غير شرائح الدماغ الرئيسيات

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

على نطاق واسع التسجيل من الخلايا العصبية بواسطة مجسات سيليكون المنقول في يتصرفون القوارض

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

إجراء لغرس صالحة المنظمة من Microwires للتسجيلات واحدة وحدة في استيقظ، تتصرف الحيوانات

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

في وقت واحد تسجيل الكهربية والصغرى، والحقن وكلاء المثبطة في الدماغ القوارض

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

إعداد أنسجة المخ الرئيسيات غير البشرية لمرحلة ما قبل تضمين المناعية والمجهر الإلكتروني

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

أوبتوجينيتيك الرائعة للذبذبات ثيتا هيبوكامبال في التصرف الفئران

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

تحديد نوع الخلايا العصبية مع أوبترودي زجاج في الفئران مستيقظا أوبتوجينيتيكس

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

إنتاج وتنقية ومراقبة الجودة لناقلات القائم على الفيروسات المرتبطة بالغدة

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

في فيفو الحقن المجسمة داخل الدماغ لتحفيز البصريات من المدخلات بعيدة المدى في شرائح الدماغ الماوس

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

في التصوير الحي لأنسجة الدماغ النشطة بالكامل في يرقات حمار وحشي مستيقظا والأحداث عن طريق إزالة الجمجمة والجلد

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...