Name: injections of aav vectors for optogenetics in anesthetized and awake behaving non-human primate brain
Uploaded: 2021-08-04T14:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af WaNPRC / ITHS P51OD010425 (JTT), National Institute of Health (NIH) tilskud EY023277 (R01 for YK), EY030441 (R01 for GH), MH114126 (RF1 til JTT, Boaz Levi, Ed Lein), MH120095 (UG3 for JTT og GH), EY028902 (R01 for RS) og muliggjort af NIH-tilskud OD010425 (P51 for WaNPRC) og University of Washington Royalty Research Fund A148416. Forfatterne vil gerne takke Yasmine El-Shamayleh og Victoria Omstead for histologi, Refugio Martinez for viral vektorkloning og John Mich for hjælp til NHP-hjernevævsbehandling.

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr og overskred de minimale krav, der blev anbefalet af Institute of Laboratory Animal Resources og Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International. Alle procedurer blev evalueret og godkendt af Animal Care and Use Committee ved University of Washington (UW IACUC protokol # 4167-01). Fem sunde makaker (2 Macaca mulatta, 3 Macaca nemestrina; mand. 4-11 år) deltog i denne undersøgelse. Sterile instrumenter og teknik blev brugt gennem alle kirurgiske procedurer.
1. At lave en kanyle (figur 1A)
<ol><li>Forberedelse af hver del<ol><li>Blunt spidsen af en hypodermisk nål (30 G, 13 mm længde) med en skiveslibemaskine.</li>
		<li>Skær et rustfrit stålrør (30 G, indvendig diameter = 0,16 mm, udvendig diameter = 0,31 mm) til en længde, der er skræddersyet til dybden af målhjerneområdet (25 mm er velegnet til at injicere hjernebarkens rygoverflade). Med en skiveslibemaskine skrå den ene ende af det afskårne rør og glat den anden. Afgrat indersiden af røret med en broach.</li>
		<li>Polytetrafluorethylen (PFTE) slangen (indvendig diameter = 0,23 mm ± 0,02 mm, væg = 0,23 mm ± 0,02 mm, 1 mm svarer til 42 nL ± 7 nL væske) i en længde, der passer til den mængde vektoropløsning, der skal belastes (1 μL vektoropløsning optager 24 mm slanger). Flare begge ender af PTFE-røret ved indsættelse af den stumpe hypodermiske nål.</li>
	</ol></li>
	<li>Indsæt den stumpede kanyle ca. 5 mm i den ene ende af PTFE-røret. Den ubevægelige ende af det rustfrie stålrør indsættes ca. 5 mm i den anden ende (figur 1A).</li>
	<li>Udfør test før injektion. Injicer filtreret vand gennem kanylens hypodermiske nålenav. Bekræft, at vand kommer ud af det skrå rustfrit stålrør fra spidsen, og at vand ikke lækker fra nogen af krydsene.</li>
</ol>2. Injektionsprocedure for bedøvede dyr
<ol><li>Kirurgisk forberedelse<ol><li>Steriliser kirurgiske instrumenter og forsyninger ved hjælp af procedurerne i materialetabellen.</li>
		<li>Hvis det er nødvendigt, skal du tage en hoved-MR til målretning af dybe hjernestrukturer (figur 2A).</li>
		<li>Umiddelbart før operationen bedøves dyrene med ketamin (10-15 mg/kg) og administreres antibiotika (cefazolin) og analgetika (buprenorphin og meloxicam med vedvarende frigivelse) intramuskulært. Derefter leveres propofol via intravenøst (IV) kateter i de saphenøse eller cephalic vener.</li>
		<li>Intuber dyret og overfør det til isoflurangas. Bekræft korrekt bedøvelse ved stabil puls, blodtryk, åndedrætsfrekvens, afslappede skeletmuskler og fravær af palpebrale eller tilbagetrækningsreflekser.</li>
		<li>Barber dyrets hoved. Påfør kunstig tåresalve på hornhinderne for at forhindre tørring.</li>
	</ol></li>
	<li>Forberedelse af injektionsområde<ol><li>Placer dyrets hoved i den stereotaxiske ramme. Påfør kirurgisk skrubbeopløsning på den barberede hud med gazesvampe, påfør blidt tryk for at frigive snavs og skyl med isopropylalkohol. Gentag denne proces tre gange. Dæk dyret med en steril fenestreret drapering. Skær huden og reflekter musklen. Placer manipulatoren på den stereotaxiske arm, placer den for at sigte mod målhjerneområdet, og marker kraniotomipositionen på kraniet med en steriliseret pen.</li>
		<li>Fjern den stereotaxiske manipulator og udfør kraniotomien. Skær duraen, hvis det ønskes (f.eks. for at visualisere sulcal landemærker). Returner manipulatoren til den stereotaxiske arm.</li>
	</ol></li>
	<li>Indlæsning af vektoropløsning (figur 1C)<ol><li>Overfør forsigtigt vektoropløsningen til et steriliseret PCR-rør med en P20-pipetter, og undgå bobler.</li>
		<li>Fastgør en kanyle med den skrå spids nedad til en lodret orienteret stereotaxisk holder. Tilslut en 1 ml Luer-lock sprøjte til kanylens kanylenav.</li>
		<li>Nedsænk den skrå spids af kanylen i vektoropløsningen. BEMÆRK: Sprøjten skal allerede være fastgjort; Vedhæftning af det på dette tidspunkt ville introducere bobler i vektoropløsningen.</li>
		<li>Opløsningen lægges i kanylen ved at påføre et forsigtigt undertryk med 1 ml sprøjten. Spor visuelt menisken mellem opløsningen og luften.</li>
		<li>Når vektoropløsningen er blevet indlæst, fortsættes det blide undertryk, indtil opløsningen når nålenavet. Fjern 1 ml sprøjten og injicer den farvede mineralolie i det hypodermiske nålenav. BEMÆRK: Olien skal injiceres langsomt langs indersiden af nålenavet for at danne en klar menisk med vektoropløsningen og for at undgå luftbobler.</li>
		<li>Fastgør det hypodermiske nålenav til en af de to åbne porte på en 3-vejs Luer-lock stophane. BEMÆRK: Fastgørelse af den hypodermiske nål til den lukkede port vil introducere uønsket lufttryk bag olien.</li>
		<li>Luk porten, der er tilsluttet det hypodermiske nålenav, fyld en 1 ml sprøjte med luft, og fastgør den til en af de to andre porte. Til sidst skal du lukke den resterende port på stophanen for at forbinde sprøjten til kanylen.</li>
		<li>Skub langsomt luft ind i kanylen. Når den farvede olie vises på spidsen af den stumpe nål i PTFE-slangen, skal du kontrollere, om der er luft mellem opløsningen og den farvede olie.</li>
		<li>Hvis der er luft til stede, skal du anvende negativt tryk på sprøjten for at returnere den farvede olie i nålenavet. Fjern boblen og påfør positivt tryk, indtil en dråbe vektoropløsning er synlig ved den skrå kanylespids.</li>
		<li>Fjern 1 ml sprøjten for at frigive uønsket lufttryk bag olien, og luk stophanen for at forhindre vektoren i at forlade kanylen ved tyngdekraften.</li>
		<li>Tape en plastiklineal til PTFE-slangen for at måle meniskens bevægelse under injektion (figur 1B, D, F).</li>
	</ol></li>
	<li>Kanyleindsættelse i målhjerneområdet (figur 1B)<ol><li>Fastgør kanylen på den stereotaxiske manipulator.</li>
		<li>Overfør pumpeslangen manuelt (som slutter i et Luer-lock-stik) fra den ikke-sterile assistent til kirurgen. Kirurgen skal gribe Luer-lock-stikket gennem væggen på en steril ærme, fastgøre en anden steril stophane på stikket, tape ærmet tæt rundt om det og derefter slippe ærmets krave, så det kan strække sig langs røret ved tyngdekraften.</li>
		<li>Tilslut stophanen, der er fastgjort til kanyleslangen, til stophanen, der er fastgjort til luftpumpen. Indstil luftpumpen til lavt tryk, tænd den, og øg trykket, indtil olien kommer frem gennem kanylen, og en dråbe vektoropløsning er synlig ved kanylespidsen.</li>
		<li>Juster plastlinealpositionen på PTFE-slangen for at måle meniskens bevægelse under injektionen.</li>
		<li>Kør kanylen ned med den stereotaxiske manipulator og optag dybden, hvor spidsen når ved overfladen (dura eller pia mater).</li>
		<li>Kør kanylen til det dybeste sted, der skal injiceres langs sporet. Overfladen vil dæmpes. Hvis du injicerer overfladebarken, skal du visuelt bekræfte, at kanylen er trængt ind i overfladen, med et kirurgisk mikroskop eller forstørrelseslommer, hvis det er tilgængeligt.</li>
		<li>For at minimere forkert målretning på grund af vævskompression skal du køre kanylen langsomt ind (1 mm / min), hurtigt (0,5 mm / s) med en 1-5 minutters ventetid i bunden eller overskride det dybeste injektionssted med 500 μm og derefter trække sig tilbage.</li>
	</ol></li>
	<li>Injektion<ol><li>Injicer 0,5 μL vektoropløsningen med den elektriske luftpumpe over 10-30 s. Bekræft injektionsflowet ved at spore menisken mellem den farvede olie og vektoropløsningen i PTFE-røret.</li>
		<li>Vent i 1 minut, og træk kanylen tilbage til det næste injektionssted langs banen.</li>
		<li>Efter den sidste injektion skal du lade kanylen være på plads i 10 minutter for at undgå vektorudstrømning.</li>
		<li>Træk kanylen tilbage og kassér den i en beholder med biohazard sharps.</li>
		<li>Du kan også injicere en lille mængde (≤1 μL) fluorescerende mikroperler nær vektorinjektionsstedet for at lette identifikationen af injektionsstedet post mortem.</li>
		<li>Gentag denne procedure som ønsket for de andre vektorløsninger andre steder (figur 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>Kirurgi lukning<ol><li>Sutur dura, muskel og hud.</li>
		<li>Fjern aben fra stereotaxic-rammen, og fjern alle skærmkabler.</li>
		<li>Fjern aben fra isofluranbedøvelse og ekstuberer efter tilbagelevering af synkerefleksen.</li>
		<li>Giv postkirurgisk behandling (3-5 dage meloxicam og 7-10 dage cephalexin). Overvåg dyret mindst en gang hvert 10. minut, indtil det er i stand til at opretholde en stabil opretstående siddeposition.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kirurgi og AAV-vektorinjektion til dyr med vågen adfærd (figur 1D)
BEMÆRK: En variant af teknikken kan bruges til at lave injektioner i hjernen hos vågne, opførende aber, som beskrevet nedenfor.
<ol><li>Samtidig injektion med optagelse<ol><li>For at registrere elektrisk aktivitet på injektionsstedet skal du belægge ydersiden af kanylen med epoxy (nederste ~ 15 mm) og polyimidrør (resterende længde). Afslør metallet i spidsen ved at skrabe epoxy fra det (Injectrode, figur 1F)2. Alternativt indsættes kanylen og en separat ekstracellulær elektrode side om side i et dobbelt-tønde styrerør (dobbelt-tønde styrerør, figur 1E).</li>
	</ol></li>
	<li>Cannula indsættelse i målhjerneområdet.<ol><li>Placer aben i forsøgskabinen, begræns hovedets bevægelse, og rengør det kraniummonterede optagekammer ved hjælp af standardteknikker.</li>
		<li>Fastgør et styrerør til microdrive. Indsæt injektionskanylen i styrerøret.</li>
		<li>Fremryk kanylen, indtil spidsen stikker ud af styrerøret.</li>
		<li>Tilslut stophanen til den elektriske luftpumpe. For at bekræfte korrekt systemfunktion skal du skubbe en dråbe vektoropløsning fra spidsen ved hjælp af luftpumpen og bekræfte bevægelsen af olievektoropløsningens menisk.</li>
		<li>Træk kanylen ~ 5 mm ind i styrerøret for at beskytte den mod skader under rørindsættelsen i hjernen. Indsæt styrerøret i hjernen.</li>
		<li>Kør kanylen til det sted, der skal injiceres ved hjælp af microdrive. Identificer målstedet ved hjælp af enten elektrisk optagelse (figur 2C) eller stimulering.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig1v2.jpg"> Figur 1: Opsætning af kirurgi og apparatur . (A) Injektionskanyle. Hver del af kanylen er angivet. Indsat nederst til højre: forstørret billede af kanylespids, skalabjælke: 500 μm. (B) Operationsopsætning for bedøvede aber. Aben placeres i en stereotaxisk ramme under en kirurgisk drapering. Ventilator (V), intravenøs linje (IV), blodtryksmåler (BP) og iltmætningsmonitor (O2) er forbundet til aben. Injektionskanylen indsættes i målområdet ved hjælp af en stereotaxisk mikromanipulator. Vektoropløsningen injiceres af en elektrisk luftpumpe (nederst til venstre indsats, brun) koblet til en luftkompressor (nederst til venstre indsat, blå). En plastiklineal (øverste indsats) tapes til PTFE-slangen for at måle meniskens bevægelse mellem farvet olie (topindsats, rød) og vektoropløsning (topindsats, klar) under injektion. (C) Opsætning til at indlæse vektoropløsning i kanylen. (D) En abe under en injektion af vektoropløsning i en forsøgskabine. Dyrets hoved holdes på plads af tre stabiliseringsstolper, og øjenpositionen registreres af et scleral søgespolesystem. Indsprøjtningskanylen holdes og køres til måldybden ved hjælp af en mikroelektrodeholder/driver. Injektion styres ved at overvåge menisken mellem den farvede olie og vektoropløsningen gennem et USB-kamera (indsat billede). (E) Dobbelt-tønde styrerør injektion. En dobbelt-tønde styrerørsholder / driver indeholder en injektionskanyle og en mikroelektrode (se indsat). (F) Injiceret. Metallet i spidsen af kanylen, udsat ved at skrabe epoxybelægningen, giver elektrisk adgang til neuroner (indsat, skala bar: 500 μm). (G) Opsætning af laserstimulering. En dobbelt-tønde styrerørsholder / driver rummer både en optisk fiber og en mikroelektrode (se indsats). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig2v2.jpg"> Figur 2: Diagram over AAV-injektionssteder . (A) Sagittal sektion af hjerne MR-billede, der viser injektionssteder i den primære motoriske cortex og primære visuelle cortex af en Macaca nemestrina. (B) Visning fra rygoverfladen på den tilsvarende Atlas-plade, der viser kanyleplacering i forhold til den centrale sulcus (primærmotorisk cortex) og primær visuel cortex. (C) Enhedsregistrering ved injektion i superior colliculus. En enhed, der blev isoleret før injektionen (højre top), forsvandt efter injektionen (højre bund). (D) Injektionsspor (hvide pile). Skala bar: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
4. Behandling af hjernevæv til histologi
<ol><li>Vent 6-8 uger efter injektion for at maksimere transgenekspression. BEMÆRK: Den optimale varighed afhænger af den nøjagtige virale vektor, der anvendes i eksperimentet.</li>
	<li>Behandle hjernen ved hjælp af konventionelle histologiske teknikker til at vurdere transduktionseffektivitet og selektivitet 5,6,7.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kojima, Y., Robinson, F. R., Soetedjo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+fastigial+nucleus+influence+on+ipsilateral+abducens+activity+during+saccades.">Cerebellar fastigial nucleus influence on ipsilateral abducens activity during saccades.</a> Journal of Neurophysiology. 111 (8), 1553-1563 (2014).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+the+error+signal+in+the+superior+colliculus+impairs+saccade+motor+learning.">Elimination of the error signal in the superior colliculus impairs saccade motor learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8987-8995 (2018).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+GABA+agonist+and+antagonist+injections+into+the+oculomotor+vermis+on+horizontal+saccades.">Effects of GABA agonist and antagonist injections into the oculomotor vermis on horizontal saccades.</a> Brain Research. 1366, 93-100 (2010).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inactivation+and+disinhibition+of+the+oculomotor+vermis+on+saccade+adaptation.">Effect of inactivation and disinhibition of the oculomotor vermis on saccade adaptation.</a> Brain Research. 1401, 30-39 (2011).</li><li>De, A., El-Shamayleh, Y., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+reversible+neural+inactivation+in+macaque+cortex+by+optogenetic+stimulation+of+GABAergic+neurons.">Fast and reversible neural inactivation in macaque cortex by optogenetic stimulation of GABAergic neurons.</a> eLife. 9, 52658 (2020).</li><li>El-Shamayleh, Y., Kojima, Y., Soetedjo, R., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+optogenetic+control+of+Purkinje+cells+in+monkey+cerebellum.">Selective optogenetic control of Purkinje cells in monkey cerebellum.</a> Neuron. 95 (1), 51-62 (2017).</li><li>Mich, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+enhancer+elements+drive+subclass-selective+expression+from+mouse+to+primate+neocortex.">Functional enhancer elements drive subclass-selective expression from mouse to primate neocortex.</a> Cell Reports. 34 (13), 108754 (2021).</li><li>Graybuck, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+viruses+for+combinatorial+cell+subclass-specific+labeling.">Enhancer viruses for combinatorial cell subclass-specific labeling.</a> Neuron. (21), 00159 (2020).</li><li>Michel, J., Benninger, D., Dietz, V., van Hedel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacle+stepping+in+patients+with+Parkinson's+disease.+Complexity+does+influence+performance.">Obstacle stepping in patients with Parkinson's disease. Complexity does influence performance.</a> Journal of Neurology. 256 (3), 457-463 (2009).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li><li>Kaku, Y., Yoshida, K., Iwamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+signals+from+the+superior+colliculus+for+adaptation+of+saccadic+eye+movements+in+the+monkey.">Learning signals from the superior colliculus for adaptation of saccadic eye movements in the monkey.</a> Journal of Neuroscience. 29 (16), 5266-5275 (2009).</li><li>Soetedjo, R., Fuchs, A. F., Kojima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subthreshold+activation+of+the+superior+colliculus+drives+saccade+motor+learning.">Subthreshold activation of the superior colliculus drives saccade motor learning.</a> Journal of Neuroscience. 29 (48), 15213-15222 (2009).</li><li>Kleinbart, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+implant+system+for+multimodal+recording+and+manipulation+of+the+primate+brain.">A modular implant system for multimodal recording and manipulation of the primate brain.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. Annual International Conference. 2018, 3362-3365 (2018).</li><li>Arieli, A., Grinvald, A., Slovin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dural+substitute+for+long-term+imaging+of+cortical+activity+in+behaving+monkeys+and+its+clinical+implications.">Dural substitute for long-term imaging of cortical activity in behaving monkeys and its clinical implications.</a> Journal of Neuroscience Methods. 114 (2), 119-133 (2002).</li><li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Fredericks, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+mechanical+delivery+of+viral+vectors+into+rhesus+monkey+brain.">Methods for mechanical delivery of viral vectors into rhesus monkey brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108730 (2020).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+labeling+of+inhibitory+and+excitatory+cortical+neurons+by+endogenous+tropism+of+adeno-associated+virus+and+lentivirus+vectors.">Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors.</a> Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Fremskridt inden for NHP-optogenetik har skabt et behov for nøjagtige, pålidelige intrakranielle injektionsmetoder. Fordelene ved den metode, der er beskrevet i denne rapport, er, at den er billig, bruger steriliserbare og engangskomponenter og har evnen til at målrette mod forskellige hjerneområder af enhver dybde. Det tillader også kontrol af injektionshastighed og volumen i kraft af den hastighed, hvormed luftventilen kan styres. Lufttrykket kan øges forbigående for at løsne en tilstopning og derefter reduceres hurtigt for at undgå efterfølgende overinjektion, der ville blive produceret ved vedvarende tryk. Engangskomponenter reducerer risikoen for krydskontaminering mellem injektionssteder.
Kritiske trin i denne injektionsprotokol inkluderer konstruktion af kanyler af høj kvalitet, ilægning af dem uden at indføre bobler og valg af injektionssteder, der ikke er for tæt på hinanden. Injektioner ≥1 cm fra hinanden transducerer normalt ikke-overlappende regioner, men denne heuristik er afhængig af viral serotype, titer, promotor, volumen, mål og detektionsmetode. Ved at vælge injektionssteder, der ikke er direkte forbundet, undgås potentielle confounds produceret af opsinhandel langs axoner og tilbøjeligheden hos nogle AAV-serotyper til retrograd transduktion.
Metoden kan bruges til at injicere NHP'er, mens de bedøves og i en stereotaxisk ramme (figur 3) eller alarm og hovedfikseret (figur 4). Førstnævnte har den fordel, at injektioner kan målrettes i stereotaxiske koordinater, og det tillader visuel bekræftelse af kanyleindtrængning gennem en akut durotomi (indskæring af dura i en vågen abe gennem en kronisk kraniotomi øger risikoen for infektion). Sidstnævnte tilgang har fordelene ved at reducere antallet af overlevelsesoperationer og dermed stresset for dyret, være kompatibelt med elektrofysiologiske optagelser under adfærd og bruge den samme koordinatramme og instrumentering, der bruges til at indsætte optiske fibre til eksperimenter efter injektion. Injektionsteknikken i vågne aber kunne forbedres yderligere ved at foretage injektioner gennem kunstig dura13,14,15. Dette ville give de yderligere fordele ved direkte visualisering af injektionssteder og vævsfluorescens, der indikerer vellykket transduktion.
For nylig blev der udviklet en multikanals injektionsanordning til at levere AAV-vektorer ensartet til store NHP-kortikale regioner16. Lignende resultater kan opnås ved hjælp af konvektionsforbedret levering17,18. Disse metoder sigter mod at maksimere transduktionsspredning, hvilket er et vigtigt mål, men et, der adskiller sig fra den rumlige præcision, vores metode sigter mod at opnå.
En anden alternativ metode er at injicere AAV-vektorer gennem borosilikatslanger, der er skråt til en skarp spids i den ene ende og fastgjort til en Hamilton-sprøjte i den anden 5,6. Denne metode har meget til fælles med den metode, der er beskrevet i dette papir. Den virale vektor holdes i en slangelængde, rummet i slangen bag virussen er fyldt med farvet olie, og vektorens strømning overvåges via bevægelsen af olievektormenisken. Denne alternative teknik kræver mindre udstyr og forberedelse, men det kræver at trække olie ind i borosilikatslangen gennem den skrå spids ved undertryk og indlæse vektoren via den samme rute efterfølgende. Dette resulterer uundgåeligt i spor af olie leveret til hjernen. Derudover skal borosilikatslangen efter vores erfaring have en diameter på ~ 350 μm for at trænge ind i dura, selv når den er skrå og derfor forårsager større mekanisk skade end den tyndere metalkanyle beskrevet i dette papir (figur 2D). 30 G rør blev brugt, fordi dens kritiske spændebelastning er høj nok til at formidle dura-penetration på trods af en længde på 1-10 cm, fordi den passer tæt til PTFE-slangen, og fordi den sjældent bliver blokeret. 33 G-slanger træsko og bøjer lettere og er sværere at parre med PTFE-slangen. 36 G-slangen er ikke tilstrækkelig stiv til at trænge ind i NHP dura mater.
En anden alternativ injektionsteknik er at parre luftpumpens output til en bagside af en vektorbelastet, trukket glaspipette19. Vektoren tvinges fra pipettespidsen af direkte, intermitterende lufttryk fra pumpen, hvilket eliminerer behovet for olie. I lighed med enkeltrørsmetoden forklaret ovenfor reducerer manglen på materialeforbindelser mellem menisken og kanylespidsen risikoen for lækager. Imidlertid forhindrer den skarpe tilspidsning og sarte spidser af glaspipetter dem i at trænge ind i NHP dura eller målrette mod dybe strukturer.

Optogenetik hos ikke-menneskelige primater (NHP'er) involverer typisk injektion af viral vektor direkte i hjernen. En klasse af vektorer, der er velegnet til denne applikation, er baseret på adeno-associeret virus (AAV). Disse vektorer består af et proteinkapsid, der omgiver et enkeltstrenget DNA-genom, der igen består af en promotor, et opsin-gen og eventuelt andre proteinkodende og genregulerende elementer. Fremskridt inden for molekylær kloning har lettet manipulation og kombination af disse komponenter til udvikling af nye vektorer. Derfor er samlingen af AAV-vektorer, der potentielt er nyttige til NHP-optogenetik, stor og vokser hurtigt.
På nuværende tidspunkt kræver brugen af en AAV-vektor til NHP-optogenetik test in vivo. Denne kendsgerning er en væsentlig hindring for fremskridt. Dyr skal anvendes sparsomt, og test af flere vektorer i et enkelt dyr kræver, at injektionssteder placeres fornuftigt i forhold til neural arkitektur og godt adskilt i forhold til viral spredning. Nøjagtig histologisk vurdering kræver, at injektioner er rumligt og volumetrisk nøjagtige. En injektionsteknik, der tidligere blev anvendt til fokal levering af farmakologiske midler 1,2,3,4, blev tilpasset og forenklet til fremstilling af sådanne injektioner. Denne injektionsteknik er billig, bruger engangs-, steriliserbare komponenter, kan bruges i bedøvede eller vågne aber og kan bruges til at målrette mod forskellige hjerneområder af enhver dybde. Følgende protokol beskriver trinvise procedurer til fremstilling af engangskomponenter og injektioner i NHP-hjernen. Fordele og ulemper ved teknikken diskuteres.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment: Stereotaxic set</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allen keys</td>
			<td>BONDHUS</td>
			<td>10936</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula holder</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1770</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier (manipulator)</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1404</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier platform</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier stand</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1449</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye, ear, mouth bars</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic base</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1210</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: Cannula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Luer-lock syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannulas*</td>
			<td>(homemade - see below)</td>
			<td>NA</td>
			<td>steam (autoclave)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colored oil**</td>
			<td>(homemade - see below)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator (for tube rack)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-08057-10</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>23-404</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microbeads</td>
			<td>Lumafluor</td>
			<td>R170</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10003M</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>22-161</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>3060004</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rack</td>
			<td>homemade</td>
			<td>NA</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector solution</td>
			<td>(homemade)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: Electric air pump set</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric air pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot pedal</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>3260</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube cover</td>
			<td>EZ Drape</td>
			<td>A400-1000</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: General surgery tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>azlon</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>277-10-235</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double pronged tissue pick</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18067-11</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drapes</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJP3004</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>6-118</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>Q9R-5400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bits</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>277-82-87</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>NON26334</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic mosquito forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>7-2, 7-4</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light handles</td>
			<td>SKYTRON</td>
			<td>Stellar XL</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle hodler</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>8-2</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periosteal elevator</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>18-1968</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>17-4800</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>BAXTER</td>
			<td>2F7122</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>372610</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>5-12, 5-114</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senn retractors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>28065</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>Triumph Micro</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction</td>
			<td>medela</td>
			<td>200-4869</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction tip</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNDFR12S</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction tube</td>
			<td>COVIDEN</td>
			<td>8888301614</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gowns</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJP2002S</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical pens &#38; ruler</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJSM03</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>COVIDEN</td>
			<td>SL-635</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>6-114</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Towel clamps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>7-504</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood swabs</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>MDS202095</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: *cannulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle</td>
			<td>EXELINT INTERNATIONAL</td>
			<td>26437</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>K-TUBE</td>
			<td>K30R</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tube</td>
			<td>ZEUS</td>
			<td>216200</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: **colored oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Candle Dye Concentrate</td>
			<td>PremiumCraft</td>
			<td>Red/Pink</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Vi-Jon</td>
			<td>S0883</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injections of aav vectors for optogenetics in anesthetized and awake behaving non-human primate brain

Optogenetiske teknikker har revolutioneret neurovidenskabelig forskning og er klar til at gøre det samme for neurologisk genterapi. Den kliniske anvendelse af optogenetik kræver imidlertid, at sikkerhed og virkning påvises i dyremodeller, ideelt set hos ikke-menneskelige primater (NHP'er), på grund af deres neurologiske lighed med mennesker. Antallet af kandidatvektorer, der potentielt er nyttige til neurovidenskab og medicin, er enormt, og der findes endnu ingen midler med høj kapacitet til at teste disse vektorer. Der er således behov for teknikker til at foretage flere rumligt og volumetisk nøjagtige injektioner af virale vektorer i NHP-hjernen, der kan identificeres entydigt gennem postmortem histologi. Beskrevet heri er en sådan metode. Injektionskanyler er konstrueret af koblede polytetrafluorethylen og rustfrit stålrør. Disse kanyler er autoklaverbare, engangsbrug og har lave minimalbelastningsvolumener, hvilket gør dem ideelle til injektion af dyre, stærkt koncentrerede virale vektoropløsninger. En inert, rødfarvet mineralolie fylder det døde rum og danner en synlig menisk med vektoropløsningen, hvilket muliggør øjeblikkelig og nøjagtig måling af injektionshastigheder og volumener. Olien lægges i bagsiden af kanylen, hvilket reducerer risikoen for co-injektion med vektoren. Kanyler kan indlæses på 10 min, og injektioner kan foretages på 20 min. Denne procedure er velegnet til injektioner i vågne eller bedøvede dyr. Når den bruges til at levere virale vektorer af høj kvalitet, kan denne procedure producere robust ekspression af optogenetiske proteiner, hvilket muliggør optisk kontrol af neural aktivitet og adfærd i NHP'er.

For at demonstrere transgenekspression ved in vivo stereotaxisk injektion i NHP-hjernen ved hjælp af den kirurgiske injektionsmetode, der er beskrevet her, blev der valgt to vektorer, der indeholdt forstærkere, der drev ekspression af det supergule fluorescerende protein-2 (SYFP2) i forskellige neuronale typer 8,9. Virale vektorer blev pakket i PHP.eB capsid10, oprenset ved iodixanolcentrifugering og derefter koncentreret til høj titer (>1E13 virale genomer / ml) målt ved qPCR. Et volumen på 0,5 μL blev injiceret i hver af ti dybder langs ti spor gennem cortex for et samlet injektionsvolumen på 5 μL / spor. Figur 3A-C viser SYFP2-ekspression via anti-GFP-immunostaining 113 dage efter injektion af PVALB-underklassespecifik AAV-vektor, CN2045, i den primære visuelle cortex hos en voksen mandlig Macaca nemestrina. SYFP2-transgenet er robust påvist i adskillige ikke-pyramidale neuroner spredt over kortikal dybde, og de fleste SYFP2-ekspressive neuroner var også immunreaktive for PVALB7. Figur 3D viser native SYFP2-ekspression i den primære motoriske cortex 64 dage efter injektion af L5-neuronens underklassespecifikke AAV-vektor, CN2251. De SYFP2-mærkede neuroner har alle klar pyramidemorfologi med somata begrænset til lag 5 og karakteristiske tykke apikale dendritter. Disse data demonstrerer entydigt præcis kontrol af transgenekspression i udvalgte populationer af neokortiske neuroner i NHP-hjernen ved stereotaxisk injektion af celletype rettet mod AAV-vektorer.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig3v2.jpg"> Figur 3: Eksempel på celletypespecifik SYFP2-ekspression medieret af AAV-vektorer injiceret i NHP-hjernen . (A) Epifluorescensfotomikrograf af et fast snit fra makak primær visuel cortex 113 dage efter injektion af en PVALB-underklassespecifik AAV-vektor. Skala bjælke: 1 mm.  (B,C) Billede med højere forstørrelse af det indrammede område, der vises i A. (B) Anti-GFP-signal. (C) Anti-PVALB-signal. Skalasøjler: 250 μm. (D) Epifluorescensfotomikrograf af indfødt SYFP2-fluorescens i en fast sektion fra makak primærmotorisk cortex 64 dage efter injektion af en lag 5 ekstratelencefalisk underklassespecifik AAV-vektor. Skala bar: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
For at demonstrere nytten af denne injektionsteknik til neurofysiologiske og adfærdsmæssige optogenetiske manipulationer blev der udført tre eksperimenter, hver på en anden abe (Macaca mulatta). I det første eksperiment (figur 4A-D) blev AAV-vektorer, der bærer channelrhodopsin-2-transgenet (AAV1-hSyn1-ChR2-mCherry), injiceret i venstre superior colliculus (SC). Vektoren blev injiceret hver 250 μm ved 19 dybder i alt 12 μL. I det andet forsøg (figur 4E-G) blev 3 μL AAV1-hSyn-ArchT-EYFP-opløsning injiceret i kernen reticularis tegmenti pontis (NRTP). I det tredje forsøg (figur 4H-K) blev 24 μL AAV9-L7-ChR2-mCherry-opløsning injiceret i cerebellar cortex 6. Seks til otte uger efter hver injektion blev en optisk fiber og en wolframelektrode indsat i hjernen via et dobbelt tønde styrerør (figur 1G).
Figur 4B viser responsen fra en SC-neuron på blåt lys (450 nm). Kontinuerligt lys (1,2 s) ved 40 mW frembragte en række på hinanden følgende handlingspotentialer (figur 4B, øverst). Lysimpulser af 1 ms varighed kunne ikke fremkalde handlingspotentialer ved 40 mW (figur 4B, midten), men fremkaldte handlingspotentialer pålideligt ved 160 mW, det eneste andet testede effektniveau med en latenstid på 2,7 ± 0,6 ms (figur 4B, nederst). Et pulstog (160 mW, frekvens: 300 Hz, driftscyklus: 15%, varighed: 300 ms) fremkaldte saccader i overensstemmelse med en gennemsnitlig latenstid på 97 ± 32 ms, en gennemsnitlig amplitude på 10,4° og en gennemsnitsvinkel på 47° (opad og til højre; Figur 4C).
I overensstemmelse med undersøgelser, der modificerede saccadeforøgelse ved hjælp af subthreshold elektrisk stimulering af SC11,12, optisk stimulering af SC efter 15 °, 18 ° og 20 ° venstre- og nedadgående (225 °) saccades gradvist reducerede saccadeforøgelsen (figur 4D). Dette fald i gevinst krævede ~ 250 forsøg (grønne cirkler) for at vende tilbage til prætilpasningsgevinsten (sorte cirkler), hvilket bekræfter dens grundlag i langsigtet plasticitet.
I det andet forsøg (figur 4E) blev den mosede fiberprojektion fra NRTP til den oculomotoriske vermis (OMV) i cerebellar cortex (lobuler VIc og VII) optisk undertrykt. Figur 4F viser fluorescerende mærkede mosbegroede fibre og rosetter i OMV (indsat). Gult laserlys (589 nm) blev leveret til OMV via optisk fiber, og en nærliggende wolframelektrode blev brugt til at registrere Purkinje-celleaktivitet. Figur 4G viser simpel spikeaktivitet før (grå) og efter (orange) optogenetisk inaktivering af NRTP-fremskrivninger (figur 4G, øverst). Før inaktiveringen udviste Purkinje-cellen et dobbelt burstmønster for 12 ° højre saccades (figur 4G, midten, grå). Under inaktivering faldt affyringshastigheden og ændrede sig til et burst-pause-mønster (figur 4G, midten, orange). Sammenligning af disse to responsmønstre tyder på, at den mosede fiberindgang til Purkinje-celler påvirker saccadedecelerationsfasen ved at køre den anden burst (figur 4G, midten, grøn). Variabiliteten af højregående saccader blev reduceret under optogenetisk inaktivering, i overensstemmelse med ideen om, at noget af trial-to-trial-variabiliteten i saccademålinger skyldes variabilitet i signalerne, der bæres af mosede fibre (figur 4G, bund, orange).
I det tredje eksperiment (figur 4H) blev Purkinje-celler i OMV stimuleret optogenetisk (figur 4I). Et tog af korte lysimpulser (1,5 ms impulser, 65 mW, 50 Hz) øgede den enkle spike-aktivitet i en isoleret Purkinje-celle (figur 4J, øverst). Individuelle 1,5 ms lysimpulser fremkaldte ofte >1 simpel spids (figur 4J, nederst). Optogenetisk simpel spike-aktivering, tidsindstillet til at forekomme under en saccade (10 ms lyspuls, 60 mW), øget saccadeamplitude (figur 4K), hvilket bekræfter Purkinje-cellernes hæmmende rolle på den oculomotoriske burstgenerator.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig4v2.jpg"> Figur 4: Resumé af tre optogenetiske eksperimenter udført i vågne aber. (A-D) Eksperiment 1, pan-neuronal excitation: viral injektion, laserstimulering og enhedsoptagelse blev udført i superior colliculus (A). (B) Repræsentativ enhedsaktivitet fremkaldt af laserstimulering. (C), Vandrette (øverste) og lodrette (midterste) komponenter i øjenbevægelser og rasterplot af enhedsaktivitet (nederst) fremkaldt af laserstimulering. (D) En repræsentativ session med saccadetilpasning induceret af laserstimulering. Stimulering (100 0,5 ms laserimpulser) blev leveret 80 ms efter hver saccade (indsats). Saccadeforstærkning (saccadeamplitude / målamplitude) faldt gradvist på tværs af forsøg. (E-G) Eksperiment 2, vejspecifik hæmning: en viral vektor blev injiceret i kernen reticularis tegmenti pontis, og laserstimulering og enhedsoptagelse blev udført i det oculomotoriske vermis (E). (F) Histologisk del af den oculomotoriske vermis, der viser mærkede mosbegroede fibre (skalastang: 1 mm) og deres rosetter (indsat, skalabjælke: 100 μm). (G) Purkinje-celleaktivitet (øverst: raster, midt: gennemsnitlig affyringshastighed) og baner for visuelt styrede saccader (nederst) med og uden laserstimulering. Grå: laser off forsøg, orange: laser på forsøg, grøn: forskel mellem grå og orange. (H-K) Eksperiment 3, celletypespecifik aktivering: viral injektion, laserstimulering og enhedsoptagelse blev udført i det oculomotoriske vermis (H). (I) Histologisk sektion af det oculomotoriske vermis, der viser mærkede Purkinje-celler. Skala bar: 100 μm. (J) Enkel spike aktivitet af en Purkinje celle fremkaldt af laser stimulering. Øverst: raster plot fra 14 forsøg. Nederst: spændingsspor fra et enkelt repræsentativt forsøg. (K) Baner af visuelt styrede saccader med og uden laserstimulering. En 10-ms lyspuls under saccader øgede saccadeamplituder. Individuelle saccadebaner (cyan) og deres gennemsnit (blå) på laser-on-forsøg. Individuelle saccadebaner (lysegrå) og deres gennemsnit (mørkegrå) på laser-off forsøg. Lysbølgelængden var 450 nm i eksperiment 1 og 3 og var 589 nm i eksperiment 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain at JoVE.com

Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain

Som det i øjeblikket er implementeret, kræver optogenetik hos ikke-menneskelige primater injektion af virale vektorer i hjernen. En optimal injektionsmetode bør være pålidelig og til mange anvendelser i stand til at målrette mod individuelle steder med vilkårlig dybde, der let og utvetydigt identificeres i postmortemhistologi. En injektionsmetode med disse egenskaber præsenteres.

Injektioner af AAV-vektorer til optogenetik i bedøvet og vågen adfærd ikke-menneskelig primathjerne

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of ...

Mange genterapeutiske og neurovidenskabelige undersøgelser involverer injektioner af AAV-vektorer i hjernen hos ikke-menneskelige primater. For at disse undersøgelser skal lykkes, skal injektionsteknikken være pålidelig. Vores injektionsteknik er øjeblikkelig og præcis.Denne procedure fungerer godt til injektion i bedøvede eller vågne dyr. Vores hjemmelavede kanyle er nem at håndtere og billig. Kevin Mai, en tekniker fra mit laboratorium, demonstrerer proceduren.Til at begynde med skal du stumpe en 30-gauge 13 millimeter hypodermisk nålespids med en skivekværn. Skær derefter et stykke rustfrit stålrør i en længde afhængigt af dybden af målhjerneområdet. Med en skiveslibemaskine skal du skrå den ene ende af det afskårne rør og glatte den anden.Afgrat indersiden af røret med en broach. Skær derefter et stykke PTFE-rør i en længde, der passer til vektoropløsningsvolumenet, der skal indlæses. Flare begge ender af røret ved at indsætte den stumpe hypodermiske nål.Indsæt den stumpede hypodermiske nål cirka fem millimeter i den ene ende af PTFE-røret. Indsæt derefter den uindrettede ende af rustfrit stålrør cirka fem millimeter i den anden ende. Test kanylen ved at injicere filtreret vand gennem det hypodermiske nålenav.Bekræft, at vand kommer glat ud af den skrå slangespids i rustfrit stål, og at vand ikke lækker fra nogen af krydsene. Efter test af kanylen skal du placere den i en autoklavepose og sterilisere den ved autoklavering. Overfør forsigtigt vektoropløsningen til et steriliseret PCR-rør med en P-20 pipetter, undgå bobledannelse.Fastgør derefter kanylen med den skrå spids vendt ned til en lodret orienteret stereotaxisk holder. Tilslut derefter en en-milliliter luerlåssprøjte til kanylens hypodermiske nålenav. Nedsænk den skrå spids i vektoropløsningen.Påfør derefter blidt undertryk med sprøjten på en milliliter for at indlæse opløsningen i kanylen, mens menisken visuelt spores mellem opløsningen og luften. Når vektoropløsningen er blevet indlæst, fortsættes det blide undertryk, indtil opløsningen når nålenavet. Fjern derefter sprøjten på en milliliter og injicer langsomt farvet mineralolie langs indersiden af det hypodermiske nålenav, og pas på at undgå luftbobler.Fastgør det hypodermiske nålenav til en af de to åbne porte i en trevejs luer lock stophane. Luk derefter havnen. Fyld en en-milliliter sprøjte med luft og fastgør den til en af de to andre porte.Til sidst skal du lukke den resterende port på stophanen for at forbinde sprøjten til kanylen. Fastgørelse af sprøjten tvinger luft ind i stophanen, og rangering af denne luft til den ubesatte port forhindrer den i at skubbe vektoropløsningen tilbage ned i kanylen. Skub langsomt luften fra sprøjten ind i kanylen.Når den farvede olie vises på spidsen af den stumpe nål i PTFE-slangen, skal du kontrollere, om der er luft mellem opløsningen og den farvede olie. Fortsæt med at anvende positivt tryk, indtil en dråbe vektoropløsning er synlig ved den skrå kanylespids. Luk derefter stophanen for at forhindre vektoren i at forlade kanylen ved tyngdekraften.Når vektoropløsningen er indlæst, anbringes kanylen på den stereotaxiske manipulator. For at forbinde stophanen til den elektriske luftpumpe skal du derefter tage pumpeslangen fra den ikke-sterile assistent. Tag fat i luerlåsstikket gennem væggen på en steril ærme.Slip ærmets krave, så den kan strække sig langs røret ved tyngdekraften. Fastgør derefter stophanen og tape ærmet tæt rundt om luerlåsstikket. Test derefter luftpumpen og kanylen ved at indstille luftpumpen til lavt tryk, før du tænder den og øger trykket, indtil olien kommer frem gennem kanylen, og en dråbe vektoropløsning er synlig ved kanylespidsen.Tape en plastiklineal til PTFE-slangen for at måle meniskens bevægelse under injektionen. Kør derefter kanylen ned med den stereotaxiske manipulator, indtil spidsen når overfladen og optag dybden. Kør kanylen til det dybeste sted, der skal injiceres langs sporet.Overfladen vil dæmpes ved kontakt. For at minimere forkert målretning på grund af vævskompression skal du køre kanylen ned og overskride det dybeste injektionssted med 500 mikrometer. Træk derefter langsomt tilbage.Andre alternativer er at køre kanylen langsomt ned eller køre den hurtigt og vente i bunden i et til fem minutter. Når kanylen er placeret på det dybeste injektionssted, skal du bruge den elektriske luftpumpe til at injicere 0,5 mikroliter vektoropløsning over 10 til 30 sekunder. Bekræft injektionsflowet ved at spore menisken mellem den farvede olie og vektoropløsningen i PTFE-røret.Efter at have ventet i et minut, træk kanylen tilbage til det næste injektionssted langs sporet. Efter den sidste injektion skal du lade kanylen være på plads i 10 minutter for at undgå vektorudstrømning. Træk derefter kanylen tilbage og kassér den i en beholder med biologisk farlige skarpe genstande.Injektion af AAV-vektorer, der bærer kanalen rhodopsin II-transgenet i venstre overlegne colliculus, efterfulgt af stimulering med kontinuerligt blåt lys ved 40 milliwatt, producerede en række på hinanden følgende handlingspotentialer. Et millisekunds lysimpulser kunne ikke fremkalde handlingspotentialer ved 40 milliwatt, men fremkaldte dem pålideligt ved 160 milliwatt. Optisk stimulering af den overlegne colliculus udløst af visuelt styrede saccader reducerede saccadeforøgelsen gradvist.Langsomheden af denne ændring er i overensstemmelse med optogenetisk induceret plasticitet. Levering af gult laserlys til den oculomotoriske vermis efter AAV-injektioner i kernen reticularis tegmentae pontis undertrykte mossy fiberaktivitet, som er et input til lillehjernen. Denne undertrykkelse reducerede Purkinje-celleaktiviteten, som er et output fra lillehjernen.Under optogenetisk undertrykkelse faldt fyringshastigheden og ændrede sig til et sprængt poremønster, hvilket tyder på, at den hæmmede mosede fiberindgang til Purkinje-celler påvirker saccadedecelerationsfasen ved at køre den anden burst. Channel rhodopsin blev udelukkende udtrykt i Purkinje-celler af den oculomotoriske vermis. Levering af korte lysimpulser øgede simpel spikeaktivitet i en isoleret Purkinje-celle.En enkelt 1,5 millisekunds lyspuls fremkaldte ofte mere end en simpel spids. Optogenetisk simpel spikeaktivering tidsindstillet til at forekomme under saccaden øgede saccadeamplitude, hvilket bekræfter Purkinje-cellernes hæmmende rolle på den oculomotoriske burstgenerator. Luftbobler i kanylen kan forstyrre olievektormenisken, komplicere bestemmelsen af injektionsvolumener og forhindre fin kontrol af strømningshastigheden.Af disse grunde er indlæsning af vektoropløsningerne uden luftbobler afgørende for denne procedure. Seks til otte uger efter injektionen kan optogenetiske manipulationer udføres, og hjernevævet kan behandles til histologisk analyse. Denne teknik gør det muligt for forskere at teste mange vektorer i få dyr, hvilket igen letter udviklingen og valideringen af nye vektorer.Et særligt område af aktuel interesse er i udviklingen af vektorer, der vil målrette mod specifikke neuronale typer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

Storstilet Registrering af neuroner ved Flytbare Silicon Probes at opføre sig Gnavere

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

A Procedure til implantering Organized Arrays af Microwires for Single-unit optagelser i Vågn op, fungerende dyr

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Samtidig Elektrofysiologisk optagelse og Micro-injektioner af inhiberende Agents i Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Udarbejdelse af ikke-menneskelig primat Brain Tissue til Pre-indlejring Immunohistokemi og Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic medrivning af hippocampus Theta svingninger i opfører sig mus

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Optogenetics identifikation af en Neuronal Type med et glas Optrode i vågen mus

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, oprensning og kvalitetskontrol for Adeno-associeret Virus-baseret vektorer

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

In vivo intracerebral Stereotaxiske injektioner til Optogenetisk stimulering af langtrækkende indgange i musehjerne skiver

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo Imaging af fuldt aktivt hjernevæv i vågen zebrafisk larver og unge fugle ved kraniet og fjernelse af huden

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...