Name: injections of aav vectors for optogenetics in anesthetized and awake behaving non-human primate brain
Uploaded: 2021-08-04T14:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door WaNPRC/ITHS P51OD010425 (JTT), National Institute of Health (NIH) subsidies EY023277 (R01 voor YK), EY030441 (R01 voor GH), MH114126 (RF1 aan JTT, Boaz Levi, Ed Lein), MH120095 (UG3 voor JTT en GH), EY028902 (R01 voor RS), en mogelijk gemaakt door NIH-subsidies OD010425 (P51 voor WaNPRC) en University of Washington Royalty Research Fund A148416. De auteurs willen Yasmine El-Shamayleh en Victoria Omstead bedanken voor histologie, Refugio Martinez voor het klonen van virale vectoren en John Mich voor hulp bij de verwerking van NHP-hersenweefsel.

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en overschreden de minimale vereisten die werden aanbevolen door het Institute of Laboratory Animal Resources en de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International. Alle procedures werden geëvalueerd en goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Washington (UW IACUC-protocol # 4167-01). Vijf gezonde makaken (2 Macaca mulatta, 3 Macaca nemestrina; man. 4-11 jaar oud) namen deel aan deze studie. Steriele instrumenten en techniek werden gebruikt bij alle chirurgische ingrepen.
1. Het maken van een canule (Figuur 1A)
<ol><li>Voorbereiding van elk onderdeel<ol><li>Stomp de punt van een hypodermische naald (30 G, 13 mm lengte) af met een schijfslijper.</li>
		<li>Snijd een roestvrijstalen buis (30 G, binnendiameter = 0,16 mm, buitendiameter = 0,31 mm) tot een lengte die is afgestemd op de diepte van het doelhersengebied (25 mm is zeer geschikt om het dorsale oppervlak van de hersenschors te injecteren). Met een schijfslijper, schuin het ene uiteinde van de gesneden buis en maak het andere glad. Ontbraam de binnenkant van de buis met een broach.</li>
		<li>Snijd de buis van polytetrafluorethyleen (PFTE) (binnendiameter = 0,23 mm ± 0,02 mm, wand = 0,23 mm ± 0,02 mm, 1 mm komt overeen met 42 nL ± 7 nL vloeistof) tot een lengte die geschikt is voor de hoeveelheid te laden vectoroplossing (1 μL vectoroplossing neemt 24 mm buis in beslag). Flare beide uiteinden van de PTFE-buis door het inbrengen van de stompe hypodermische naald.</li>
	</ol></li>
	<li>Steek de stompe hypodermische naald ongeveer 5 mm in het ene uiteinde van de PTFE-buis. Steek het ongeflankte uiteinde van de roestvrijstalen buis ongeveer 5 mm in het andere uiteinde (figuur 1A).</li>
	<li>Voer pre-injectietests uit. Injecteer gefilterd water door de hypodermische naaldnaaf van de canule. Controleer of er water uit de afgeschuinde roestvrijstalen buis van de punt komt en dat er geen water uit beide juncties lekt.</li>
</ol>2. Injectieprocedure voor verdoofde dieren
<ol><li>Voorbereiding van de operatie<ol><li>Steriliseer chirurgische instrumenten en benodigdheden met behulp van de procedures in de materiaaltabel.</li>
		<li>Neem indien nodig een hoofd-MRI voor het richten op diepe hersenstructuren (figuur 2A).</li>
		<li>Verdoof de dieren onmiddellijk voor de operatie met ketamine (10-15 mg/kg) en dien intramusculair antibiotica (cefazoline) en analgetica (buprenorfine en meloxicam met aanhoudende afgifte) toe. Lever vervolgens propofol toe via intraveneuze (IV) katheter in de sapheneuze of cefalische aderen.</li>
		<li>Intubeer het dier en breng het over in isofluraangas. Bevestig de juiste anesthesie door stabiele hartslag, bloeddruk, ademhalingsfrequentie, ontspannen skeletspieren en de afwezigheid van palpebrale of ontwenningsreflexen.</li>
		<li>Scheer het hoofd van het dier. Breng kunstmatige traanzalf aan op de hoornvliezen om uitdroging te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van het injectiegebied<ol><li>Plaats het hoofd van het dier in het stereotaxische frame. Breng chirurgische scrub-oplossing aan op de geschoren huid met gaasponzen, oefen zachte druk uit om vuil vrij te maken en spoel met isopropylalcohol. Herhaal dit proces drie keer. Bedek het dier met een steriele fenestrated drape. Snijd de huid in en reflecteer de spier. Plaats de manipulator op de stereotaxische arm, plaats deze om op het doelgebied van de hersenen te richten en markeer de craniotomiepositie op de schedel met een gesteriliseerde pen.</li>
		<li>Verwijder de stereotaxische manipulator en voer de craniotomie uit. Snijd de dura indien gewenst in (bijvoorbeeld om sulcale oriëntatiepunten te visualiseren). Breng de manipulator terug naar de stereotaxische arm.</li>
	</ol></li>
	<li>Vectoroplossing laden (figuur 1C)<ol><li>Breng de vectoroplossing voorzichtig over op een gesteriliseerde PCR-buis met een P20-pipettor en vermijd bubbels.</li>
		<li>Bevestig een canule, met de afgeschuinde punt naar beneden gericht, aan een verticaal georiënteerde stereotaxische houder. Sluit een Luerlock spuit van 1 ml aan op de injectienaaldnaaf van de canule.</li>
		<li>Dompel de afgeschuinde punt van de canule onder in de vectoroplossing. OPMERKING: De spuit moet al zijn bevestigd; het op dit punt bevestigen zou bellen in de vectoroplossing introduceren.</li>
		<li>Plaats de oplossing in de canule door zachte onderdruk uit te oefenen met de spuit van 1 ml. Volg de meniscus visueel tussen de oplossing en de lucht.</li>
		<li>Zodra de vectoroplossing is geladen, gaat u door met de zachte negatieve druk totdat de oplossing de naaldnaaf bereikt. Verwijder de spuit van 1 ml en injecteer de gekleurde minerale olie in de injectienaaldnaaf. OPMERKING: De olie moet langzaam langs de binnenwand van de naaldnaaf worden geïnjecteerd om een doorzichtige meniscus te vormen met de vectoroplossing en om luchtbellen te voorkomen.</li>
		<li>Bevestig de hypodermische naaldnaaf aan een van de twee open poorten van een 3-weg Luer-lock stopcock. OPMERKING: Als u de hypodermische naald aan de gesloten poort bevestigt, wordt ongewenste luchtdruk achter de olie geïntroduceerd.</li>
		<li>Sluit de poort die is aangesloten op de hypodermische naaldnaaf, vul een spuit van 1 ml met lucht en bevestig deze aan een van de andere twee poorten. Sluit ten slotte de resterende poort van de stopkraan om de spuit op de canule aan te sluiten.</li>
		<li>Duw langzaam lucht in de canule. Zodra de gekleurde olie verschijnt aan de punt van de stompe naald in de PTFE-buis, controleert u op lucht tussen de oplossing en de gekleurde olie.</li>
		<li>Als er lucht aanwezig is, oefen dan negatieve druk uit op de spuit om de gekleurde olie terug te brengen naar de naaldnaaf. Verwijder de bel en oefen positieve druk uit totdat een druppel vectoroplossing zichtbaar is aan de afgeschuinde canulepunt.</li>
		<li>Verwijder de spuit van 1 ml om ongewenste luchtdruk achter de olie los te laten en sluit de stopkraan om te voorkomen dat de vector door de zwaartekracht de canule verlaat.</li>
		<li>Plak een plastic liniaal op de PTFE-buis om de beweging van de meniscus tijdens injectie te meten (figuur 1B, D, F).</li>
	</ol></li>
	<li>Canule-inbrenging in het doelhersengebied (figuur 1B)<ol><li>Bevestig de canule op de stereotaxische manipulator.</li>
		<li>Breng de pompslang (die eindigt in een Luer-lock connector) handmatig over van de niet-steriele assistent naar de chirurg. De chirurg moet de Luer-lock-connector door de wand van een steriele huls grijpen, een tweede steriele stopkraan op de connector bevestigen, de mouw er strak omheen plakken en vervolgens de kraag van de mouw laten vallen, waardoor deze door de zwaartekracht langs de buis kan worden uitgeschoven.</li>
		<li>Sluit de stopkraan die aan de canulebuis is bevestigd aan op de stopkraan die aan de luchtpomp is bevestigd. Zet de luchtpomp op lage druk, zet deze aan en verhoog de druk totdat de olie door de canule gaat en een druppel vectoroplossing zichtbaar is aan de tip van de canule.</li>
		<li>Pas de positie van de plastic liniaal op de PTFE-buis aan om de beweging van de meniscus tijdens de injectie te meten.</li>
		<li>Drijf de canule naar beneden met de stereotaxische manipulator en noteer de diepte waarop de punt aan het oppervlak reikt (dura of pia mater).</li>
		<li>Rijd de canule naar de diepste plaats om langs het spoor te worden geïnjecteerd. Het oppervlak zal kuiltjes worden. Als u de oppervlakteschors injecteert, bevestig dan visueel dat de canule het oppervlak is binnengedrongen, met een chirurgische microscoop of vergrootbare loepen, indien beschikbaar.</li>
		<li>Om mistargeting als gevolg van weefselcompressie te minimaliseren, drijft u de canule langzaam (1 mm / min), snel (0, 5 mm / s) in met een wachttijd van 1-5 minuten aan de onderkant, of schiet u de diepste injectieplaats met 500 μm over en trekt u zich vervolgens terug.</li>
	</ol></li>
	<li>Injectie<ol><li>Injecteer 0,5 μL van de vectoroplossing met de elektrische luchtpomp gedurende 10-30 s. Bevestig de injectiestroom door de meniscus tussen de gekleurde olie en de vectoroplossing in de PTFE-buis te volgen.</li>
		<li>Wacht 1 minuut en trek de canule terug naar de volgende injectieplaats langs de baan.</li>
		<li>Laat na de laatste injectie de canule 10 minuten op zijn plaats om vectorefflux te voorkomen.</li>
		<li>Trek de canule in en gooi deze weg in een biohazard sharps-container.</li>
		<li>Injecteer optioneel een kleine hoeveelheid (≤1 μL) fluorescerende microbeads in de buurt van de vectorinjectieplaats om de identificatie van de injectieplaats post mortem te vergemakkelijken.</li>
		<li>Herhaal deze procedure zoals gewenst voor de andere vectoroplossingen op andere locaties (figuur 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>Operatie sluiten<ol><li>Hecht de dura, de spier en de huid.</li>
		<li>Verwijder de aap uit het stereotaxische frame en verwijder alle monitorkabels.</li>
		<li>Verwijder de aap uit de isofluraanane-anesthesie en extubeer na de terugkeer van de slikreflex.</li>
		<li>Zorg voor postoperatieve behandeling (3-5 dagen meloxicam en 7-10 dagen cefalexine). Controleer het dier minstens één keer per 10 minuten totdat het in staat is om een stabiele rechtopstaande zitpositie te behouden.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Chirurgie en AAV-vectorinjectie voor wakker gedragende dieren (figuur 1D)
OPMERKING: Een variant van de techniek kan worden gebruikt om injecties te maken in de hersenen van wakkere, zich gedragende apen, zoals hieronder beschreven.
<ol><li>Gelijktijdige injectie met opname<ol><li>Om de elektrische activiteit op de injectieplaats te registreren, bedekt u de buitenkant van de canule met epoxy (onderkant ~ 15 mm) en polyimidebuizen (resterende lengte). Onthul het metaal aan de punt door de epoxy eraf te schrapen (Injectrode, figuur 1F)2. U kunt ook de canule en een afzonderlijke extracellulaire elektrode naast elkaar in een geleidebuis met dubbele loop plaatsen (geleidebuis met dubbele loop, figuur 1E).</li>
	</ol></li>
	<li>Canule-inbrenging in het doelhersengebied.<ol><li>Plaats de aap in de experimentele cabine, beperk de beweging van het hoofd en reinig de op de schedel gemonteerde opnamekamer met behulp van standaardtechnieken.</li>
		<li>Bevestig een geleidingsbuis aan de microdrive. Steek de injectiecanule in de geleidebuis.</li>
		<li>Beweeg de canule totdat de punt uit de geleidebuis steekt.</li>
		<li>Sluit de stopkraan aan op de elektrische luchtpomp. Om de juiste systeemfunctie te bevestigen, duwt u een druppel vectoroplossing van de punt met behulp van de luchtpomp en bevestigt u de beweging van de meniscus van de olievectoroplossing.</li>
		<li>Trek de canule ~ 5 mm terug in de geleidebuis om deze te beschermen tegen schade tijdens het inbrengen van de buis in de hersenen. Steek de geleidebuis in de hersenen.</li>
		<li>Rijd de canule naar de plaats om te worden geïnjecteerd met behulp van de microdrive. Identificeer de doellocatie door elektrische opname (figuur 2C) of stimulatie.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig1v2.jpg"> Figuur 1: Opstelling van chirurgie en apparatuur. (A) Injectiecanule. Elk deel van de canule is geïndiceerd. Inzet rechtsonder: vergrote afbeelding van canulepunt, schaalbalk: 500 μm. (B) Chirurgische opstelling voor verdoofde apen. De aap wordt in een stereotaxisch frame onder een chirurgisch gordijn geplaatst. Ventilator (V), intraveneuze lijn (IV), bloeddrukmeter (BP) en zuurstofverzadigingsmonitor (O2) zijn verbonden met de aap. De injectiecanule wordt in het doelgebied ingebracht met behulp van een stereotaxische micromanipulator. De vectoroplossing wordt geïnjecteerd door een elektrische luchtpomp (inzet linksonder, bruin) gekoppeld aan een luchtcompressor (inzet linksonder, blauw). Een plastic liniaal (bovenste inzet) wordt op de PTFE-buis geplakt om de beweging van de meniscus tussen gekleurde olie (bovenste inzet, rood) en vectoroplossing (bovenste inzet, helder) tijdens injectie te meten. (C) Instellen om vectoroplossing in de canule te laden. (D) Een aap tijdens een injectie van vectoroplossing in een experimentele cabine. Het hoofd van het dier wordt op zijn plaats gehouden door drie stabilisatiepalen en de oogpositie wordt geregistreerd door een scleraal zoekspoelsysteem. De injectiecanule wordt vastgehouden en naar de doeldiepte gedreven met behulp van een micro-elektrodehouder/driver. De injectie wordt geregeld door de meniscus tussen de gekleurde olie en de vectoroplossing te bewaken via een USB-camera (inzetafbeelding). (E) Injectie met dubbele loopgeleidingsbuis. Een dubbelloops geleidebuishouder/driver bevat een injectiecanule en een micro-elektrode (zie inzet). (F) Injectrode. Het metaal aan de punt van de canule, blootgesteld door het schrapen van de epoxylaag, biedt elektrische toegang tot neuronen (inzet, schaalbalk: 500 μm). (G) Laserstimulatie instellen. Een dubbelloops geleidebuishouder/driver bevat zowel een optische vezel als een micro-elektrode (zie inzet). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig2v2.jpg"> Figuur 2: Diagram van AAV-injectieplaatsen. (A) Sagittale sectie van de MR-afbeelding van de hersenen met injectieplaatsen in de primaire motorische cortex en primaire visuele cortex van een Macaca-nemestrina. (B) Uitzicht vanaf het dorsale oppervlak op de overeenkomstige Atlasplaat met canuleplaatsing ten opzichte van de centrale sulcus (primaire motorische cortex) en primaire visuele cortex. (C) Eenheidsregistratie door injectrode in de superieure colliculus. Een eenheid die vóór de injectie was geïsoleerd (rechtsboven) verdween na de injectie (rechtsonder). (D) Injectiespoor (witte pijlen). Schaalbalk: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
4. Verwerking van hersenweefsel voor histologie
<ol><li>Wacht 6-8 weken na de injectie om de transgenexpressie te maximaliseren. OPMERKING: De optimale duur is afhankelijk van de exacte virale vector die in het experiment wordt gebruikt.</li>
	<li>Verwerk de hersenen met behulp van conventionele histologische technieken om transductie-efficiëntie en selectiviteit te beoordelen 5,6,7.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kojima, Y., Robinson, F. R., Soetedjo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+fastigial+nucleus+influence+on+ipsilateral+abducens+activity+during+saccades.">Cerebellar fastigial nucleus influence on ipsilateral abducens activity during saccades.</a> Journal of Neurophysiology. 111 (8), 1553-1563 (2014).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+the+error+signal+in+the+superior+colliculus+impairs+saccade+motor+learning.">Elimination of the error signal in the superior colliculus impairs saccade motor learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8987-8995 (2018).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+GABA+agonist+and+antagonist+injections+into+the+oculomotor+vermis+on+horizontal+saccades.">Effects of GABA agonist and antagonist injections into the oculomotor vermis on horizontal saccades.</a> Brain Research. 1366, 93-100 (2010).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inactivation+and+disinhibition+of+the+oculomotor+vermis+on+saccade+adaptation.">Effect of inactivation and disinhibition of the oculomotor vermis on saccade adaptation.</a> Brain Research. 1401, 30-39 (2011).</li><li>De, A., El-Shamayleh, Y., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+reversible+neural+inactivation+in+macaque+cortex+by+optogenetic+stimulation+of+GABAergic+neurons.">Fast and reversible neural inactivation in macaque cortex by optogenetic stimulation of GABAergic neurons.</a> eLife. 9, 52658 (2020).</li><li>El-Shamayleh, Y., Kojima, Y., Soetedjo, R., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+optogenetic+control+of+Purkinje+cells+in+monkey+cerebellum.">Selective optogenetic control of Purkinje cells in monkey cerebellum.</a> Neuron. 95 (1), 51-62 (2017).</li><li>Mich, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+enhancer+elements+drive+subclass-selective+expression+from+mouse+to+primate+neocortex.">Functional enhancer elements drive subclass-selective expression from mouse to primate neocortex.</a> Cell Reports. 34 (13), 108754 (2021).</li><li>Graybuck, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+viruses+for+combinatorial+cell+subclass-specific+labeling.">Enhancer viruses for combinatorial cell subclass-specific labeling.</a> Neuron. (21), 00159 (2020).</li><li>Michel, J., Benninger, D., Dietz, V., van Hedel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacle+stepping+in+patients+with+Parkinson's+disease.+Complexity+does+influence+performance.">Obstacle stepping in patients with Parkinson's disease. Complexity does influence performance.</a> Journal of Neurology. 256 (3), 457-463 (2009).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li><li>Kaku, Y., Yoshida, K., Iwamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+signals+from+the+superior+colliculus+for+adaptation+of+saccadic+eye+movements+in+the+monkey.">Learning signals from the superior colliculus for adaptation of saccadic eye movements in the monkey.</a> Journal of Neuroscience. 29 (16), 5266-5275 (2009).</li><li>Soetedjo, R., Fuchs, A. F., Kojima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subthreshold+activation+of+the+superior+colliculus+drives+saccade+motor+learning.">Subthreshold activation of the superior colliculus drives saccade motor learning.</a> Journal of Neuroscience. 29 (48), 15213-15222 (2009).</li><li>Kleinbart, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+implant+system+for+multimodal+recording+and+manipulation+of+the+primate+brain.">A modular implant system for multimodal recording and manipulation of the primate brain.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. Annual International Conference. 2018, 3362-3365 (2018).</li><li>Arieli, A., Grinvald, A., Slovin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dural+substitute+for+long-term+imaging+of+cortical+activity+in+behaving+monkeys+and+its+clinical+implications.">Dural substitute for long-term imaging of cortical activity in behaving monkeys and its clinical implications.</a> Journal of Neuroscience Methods. 114 (2), 119-133 (2002).</li><li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Fredericks, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+mechanical+delivery+of+viral+vectors+into+rhesus+monkey+brain.">Methods for mechanical delivery of viral vectors into rhesus monkey brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108730 (2020).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+labeling+of+inhibitory+and+excitatory+cortical+neurons+by+endogenous+tropism+of+adeno-associated+virus+and+lentivirus+vectors.">Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors.</a> Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vooruitgang in NHP-optogenetica heeft een behoefte gecreëerd aan nauwkeurige, betrouwbare intracraniale injectiemethoden. Voordelen van de methode die in dit rapport wordt beschreven, zijn dat deze goedkoop is, steriliseerbare en wegwerpcomponenten gebruikt en de mogelijkheid heeft om verschillende hersengebieden van elke diepte te targeten. Het maakt ook controle van de injectiesnelheid en het volume mogelijk op basis van de snelheid waarmee de luchtklep kan worden geregeld. De luchtdruk kan tijdelijk worden verhoogd om een verstopping los te maken en vervolgens snel worden verlaagd om een volgende overinjectie te voorkomen die zou worden geproduceerd door aanhoudende druk. Wegwerpcomponenten verminderen het risico op kruisbesmetting tussen injectieplaatsen.
Cruciale stappen in dit injectieprotocol zijn het bouwen van hoogwaardige canules, het laden ervan zonder bubbels te introduceren en het selecteren van injectieplaatsen die niet te dicht bij elkaar liggen. Injecties ≥1 cm uit elkaar meestal niet-overlappende regio's transduceren, maar deze heuristiek is afhankelijk van viraal serotype, titer, promotor, volume, doelwit en detectiemethode. Het selecteren van injectieplaatsen die niet direct verbonden zijn, vermijdt mogelijke confounds geproduceerd door opsinehandel langs axonen en de neiging van sommige AAV-serotypen voor retrograde transductie.
De methode kan worden gebruikt om NHP's te injecteren terwijl ze verdoofd zijn en in een stereotaxisch frame (figuur 3) of alert en head-fixed (figuur 4). De eerste heeft het voordeel dat injecties kunnen worden gericht in stereotaxische coördinaten, en het maakt visuele bevestiging van canule-penetratie mogelijk door een acute durotomie (het insnijden van de dura in een wakkere aap, door een chronische craniotomie, verhoogt het risico op infectie). De laatste benadering heeft de voordelen van het verminderen van het aantal overlevingsoperaties en dus de stress voor het dier, is compatibel met elektrofysiologische opnames tijdens gedrag en gebruikt hetzelfde coördinatenframe en instrumentatie dat wordt gebruikt om optische vezels in te brengen voor experimenten na injectie. De injectietechniek bij wakkere apen kan verder worden verbeterd door injecties te maken via kunstmatige dura 13,14,15. Dit zou de extra voordelen opleveren van directe visualisatie van injectieplaatsen en de weefselfluorescentie die wijst op succesvolle transductie.
Verschillende andere AAV-injectietechnieken zijn gebruikt in NHP's. Onlangs is een meerkanaals injectieapparaat ontwikkeld om AAV-vectoren uniform af te leveren aan grote NHP-corticale regio's16. Vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen met behulp van convectie-verbeterde levering17,18. Deze methoden zijn gericht op het maximaliseren van de transductiespreiding, wat een belangrijk doel is, maar een die verschilt van de ruimtelijke precisie die onze methode beoogt te bereiken.
Een andere alternatieve methode is om AAV-vectoren te injecteren door borosilicaatbuizen die aan het ene uiteinde tot een scherpe punt zijn afgeschuind en aan het andereuiteinde aan een Hamilton-spuit zijn bevestigd. Deze methode heeft veel gemeen met de methode die in dit artikel wordt beschreven. De virale vector wordt in een lengte van de buis gehouden, de ruimte in de buis achter het virus is gevuld met geverfde olie en de stroom van de vector wordt bewaakt via de beweging van de olievector meniscus. Deze alternatieve techniek vereist minder apparatuur en voorbereiding, maar het vereist het trekken van olie in de borosilicaatbuis door de afgeschuinde punt door negatieve druk en het vervolgens laden van de vector via dezelfde route. Dit resulteert onvermijdelijk in sporen van olie die aan de hersenen worden afgegeven. Bovendien, in onze ervaring, moet de borosilicaatbuis een diameter van ~ 350 μm hebben om dura te penetreren, zelfs wanneer afgeschuind en veroorzaakt daarom grotere mechanische schade dan de dunnere metalen canule beschreven in dit artikel (figuur 2D). 30 G buizen werden gebruikt omdat de kritische knikbelasting hoog genoeg is om dura-penetratie te bemiddelen ondanks een lengte van 1-10 cm, omdat het de PTFE-buis strak past en omdat het zelden wordt belemmerd. 33 G slang verstopt en buigt gemakkelijker en is moeilijker te paren met de PTFE-buizen. 36 G slang is onvoldoende stijf om nhp dura mater te penetreren.
Een andere alternatieve injectietechniek is om de output van de luchtpomp te koppelen aan een achterkant van een vectorbelaste pipet van getrokken glas19. De vector wordt uit de pipetpunt geperst door directe, intermitterende luchtdruk van de pomp, waardoor er geen olie nodig is. Net als bij de hierboven beschreven methode met één buis, vermindert het ontbreken van materiaalverbindingen tussen de meniscus en de canulepunt het risico op lekken. De scherpe taps toelopende en delicate uiteinden van glazen pipetten voorkomen echter dat ze NHP dura binnendringen of zich richten op diepe structuren.

Optogenetica bij niet-menselijke primaten (NHP's) omvat meestal de injectie van virale vector rechtstreeks in de hersenen. Een klasse van vectoren die zeer geschikt is voor deze toepassing is gebaseerd op adeno-geassocieerd virus (AAV). Deze vectoren bestaan uit een eiwitcapsid rond een enkelstrengs DNA-genoom dat op zijn beurt bestaat uit een promotor, een opsine-gen en optioneel andere eiwitcoderende en genregulerende elementen. Vooruitgang in moleculair klonen heeft de manipulatie en combinatie van deze componenten voor de ontwikkeling van nieuwe vectoren vergemakkelijkt. Bijgevolg is de verzameling AAV-vectoren die potentieel nuttig is voor NHP-optogenetica groot en groeit deze snel.
Op dit moment vereist het nut van een AAV-vector voor NHP-optogenetica testen in vivo. Dit feit is een aanzienlijke belemmering voor vooruitgang. Dieren moeten spaarzaam worden gebruikt en het testen van meerdere vectoren in één dier vereist dat injectieplaatsen oordeelkundig worden gepositioneerd ten opzichte van neurale architectuur en goed gescheiden ten opzichte van virale verspreiding. Nauwkeurige histologische beoordeling vereist dat injecties ruimtelijk en volumetrisch nauwkeurig zijn. Een injectietechniek die eerder werd gebruikt voor focale toediening van farmacologische middelen 1,2,3,4 werd aangepast en vereenvoudigd om dergelijke injecties te maken. Deze injectietechniek is goedkoop, maakt gebruik van wegwerpbare, steriliseerbare componenten, kan worden gebruikt bij verdoofde of wakker gedragende apen en kan worden gebruikt om verschillende hersengebieden van elke diepte te targeten. Het volgende protocol beschrijft stapsgewijze procedures voor het fabriceren van de wegwerpcomponenten en het maken van injecties in de NHP-hersenen. De voor- en nadelen van de techniek komen aan bod.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment: Stereotaxic set</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allen keys</td>
			<td>BONDHUS</td>
			<td>10936</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula holder</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1770</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier (manipulator)</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1404</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier platform</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier stand</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1449</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye, ear, mouth bars</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic base</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1210</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: Cannula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Luer-lock syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannulas*</td>
			<td>(homemade - see below)</td>
			<td>NA</td>
			<td>steam (autoclave)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colored oil**</td>
			<td>(homemade - see below)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator (for tube rack)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-08057-10</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>23-404</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microbeads</td>
			<td>Lumafluor</td>
			<td>R170</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10003M</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>22-161</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>3060004</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rack</td>
			<td>homemade</td>
			<td>NA</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector solution</td>
			<td>(homemade)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: Electric air pump set</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric air pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot pedal</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>3260</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube cover</td>
			<td>EZ Drape</td>
			<td>A400-1000</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: General surgery tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>azlon</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>277-10-235</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double pronged tissue pick</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18067-11</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drapes</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJP3004</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>6-118</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>Q9R-5400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bits</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>277-82-87</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>NON26334</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic mosquito forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>7-2, 7-4</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light handles</td>
			<td>SKYTRON</td>
			<td>Stellar XL</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle hodler</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>8-2</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periosteal elevator</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>18-1968</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>17-4800</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>BAXTER</td>
			<td>2F7122</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>372610</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>5-12, 5-114</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senn retractors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>28065</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>Triumph Micro</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction</td>
			<td>medela</td>
			<td>200-4869</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction tip</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNDFR12S</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction tube</td>
			<td>COVIDEN</td>
			<td>8888301614</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gowns</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJP2002S</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical pens &#38; ruler</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJSM03</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>COVIDEN</td>
			<td>SL-635</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>6-114</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Towel clamps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>7-504</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood swabs</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>MDS202095</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: *cannulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle</td>
			<td>EXELINT INTERNATIONAL</td>
			<td>26437</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>K-TUBE</td>
			<td>K30R</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tube</td>
			<td>ZEUS</td>
			<td>216200</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: **colored oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Candle Dye Concentrate</td>
			<td>PremiumCraft</td>
			<td>Red/Pink</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Vi-Jon</td>
			<td>S0883</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injections of aav vectors for optogenetics in anesthetized and awake behaving non-human primate brain

Optogenetische technieken hebben een revolutie teweeggebracht in neurowetenschappelijk onderzoek en staan klaar om hetzelfde te doen voor neurologische gentherapie. Het klinische gebruik van optogenetica vereist echter dat veiligheid en werkzaamheid worden aangetoond in diermodellen, idealiter bij niet-menselijke primaten (NHP's), vanwege hun neurologische gelijkenis met mensen. Het aantal kandidaat-vectoren dat potentieel nuttig is voor de neurowetenschappen en geneeskunde is enorm, en er bestaat nog geen high-throughput middel om deze vectoren te testen. Er is dus behoefte aan technieken om meerdere ruimtelijk en volumetrisch nauwkeurige injecties van virale vectoren in NHP-hersenen te maken die ondubbelzinnig kunnen worden geïdentificeerd door middel van postmortale histologie. Hierin beschreven is zo'n methode. Injectiecanules zijn opgebouwd uit gekoppelde polytetrafluorethyleen en roestvrijstalen buizen. Deze canules zijn autoclaveerbaar, wegwerpbaar en hebben lage minimale laadvolumes, waardoor ze ideaal zijn voor de injectie van dure, sterk geconcentreerde virale vectoroplossingen. Een inerte, rood geverfde minerale olie vult de dode ruimte en vormt een zichtbare meniscus met de vectoroplossing, waardoor onmiddellijke en nauwkeurige meting van injectiesnelheden en volumes mogelijk is. De olie wordt in de achterkant van de canule geladen, waardoor het risico op co-injectie met de vector wordt verminderd. Canules kunnen in 10 minuten worden geladen en injecties kunnen in 20 minuten worden gemaakt. Deze procedure is zeer geschikt voor injecties bij wakkere of verdoofde dieren. Wanneer deze procedure wordt gebruikt om virale vectoren van hoge kwaliteit te leveren, kan deze procedure robuuste expressie van optogenetische eiwitten produceren, waardoor optische controle van neurale activiteit en gedrag in NHP's mogelijk is.

Om transgene expressie door in vivo stereotaxische injectie in de NHP-hersenen aan te tonen met behulp van de hier beschreven chirurgische injectiemethode, werden twee vectoren geselecteerd die versterkers bevatten die de expressie van het supergele fluorescerende eiwit-2 (SYFP2) in verschillende neuronale typen 8,9 drijven. Virale vectoren werden verpakt in de PHP.eB capsid10, gezuiverd door iodixanol centrifugatie, en vervolgens geconcentreerd tot hoge titer (>1E13 virale genomen / ml) zoals gemeten door qPCR. Een volume van 0,5 μL werd geïnjecteerd op elk van de tien diepten langs tien sporen door de cortex voor een totaal injectievolume van 5 μL / track. Figuur 3A-C toont SYFP2-expressie via anti-GFP-immunostaining 113 dagen na injectie van de PVALB subklasse-specifieke AAV-vector, CN2045, in de primaire visuele cortex van een volwassen mannelijke Macaca nemestrina. Het SYFP2-transgen wordt robuust gedetecteerd in tal van niet-piramidale neuronen verspreid over de corticale diepte, en de meeste SYFP2-expressieneuronen waren ook immunoreactief voor PVALB7. Figuur 3D toont native SYFP2-expressie in de primaire motorische cortex 64 dagen na injectie van de L5 neuron subklasse-specifieke AAV-vector, CN2251. De SYFP2-gelabelde neuronen hebben allemaal een duidelijke piramidale morfologie met somata beperkt tot laag 5 en karakteristieke dikke apicale dendrieten. Deze gegevens tonen ondubbelzinnig nauwkeurige controle van transgene expressie in geselecteerde populaties van neocorticale neuronen in de NHP-hersenen door stereotaxische injectie van celtype gerichte AAV-vectoren.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig3v2.jpg"> Figuur 3: Voorbeeld van celtypespecifieke SYFP2-expressie gemedieerd door AAV-vectoren geïnjecteerd in NHP-hersenen. (A) Epifluorescentiefotomicrografie van een vaste sectie van de macaak primaire visuele cortex 113 dagen na injectie van een PVALB-subklassespecifieke AAV-vector. Schaalbalk: 1 mm.  (B,C) Afbeelding met hogere vergroting van het ingepakte gebied dat in A wordt weergegeven. (B) Anti-GFP-signaal. (C) Anti-PVALB signaal. Schaalbalken: 250 μm. (D) Epifluorescentiefotomicrografie van inheemse SYFP2-fluorescentie in een vaste sectie van de primaire motorische cortex van makaaken 64 dagen na injectie van een laag 5 extratelencefale subklasse-specifieke AAV-vector. Schaalbalk: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Om het nut van deze injectietechniek voor neurofysiologische en gedragsmatige optogenetische manipulaties aan te tonen, werden drie experimenten uitgevoerd, elk op een andere aap (Macaca mulatta). In het eerste experiment (figuur 4A-D) werden AAV-vectoren die het channelrhodopsine-2-transgen (AAV1-hSyn1-ChR2-mCherry) droegen, geïnjecteerd in de linker superieure colliculus (SC). De vector werd elke 250 μm geïnjecteerd op 19 dieptes voor een totaal van 12 μL. In het tweede experiment (figuur 4E-G) werd 3 μL AAV1-hSyn-ArchT-EYFP-oplossing geïnjecteerd in de nucleus reticularis tegmenti pontis (NRTP). In het derde experiment (figuur 4H-K) werd 24 μL AAV9-L7-ChR2-mCherry-oplossing geïnjecteerd in de cerebellaire cortex6. Zes tot acht weken na elke injectie werden een optische vezel en een wolfraamelektrode in de hersenen ingebracht via een geleidebuis met dubbele loop (figuur 1G).
Figuur 4B toont de reactie van een SC-neuron op blauw licht (450 nm). Continu licht (1,2 s) bij 40 mW produceerde een reeks opeenvolgende actiepotentialen (figuur 4B, boven). Lichtpulsen met een duur van 1 ms konden geen actiepotentialen oproepen bij 40 mW (figuur 4B, midden), maar riepen wel op betrouwbare wijze actiepotentialen op bij 160 mW, het enige andere geteste vermogensniveau, met een latentie van 2,7 ± 0,6 ms (figuur 4B, onder). Een pulstrein (160 mW, frequentie: 300 Hz, duty cycle: 15%, duur: 300 ms) riep saccades op met een gemiddelde latentie van 97 ± 32 ms, een gemiddelde amplitude van 10,4° en een gemiddelde hoek van 47° (naar boven en naar rechts; Figuur 4C).
In overeenstemming met studies die de saccadewinst wijzigden met behulp van subthreshold elektrische stimulatie van de SC 11,12, verminderde optische stimulatie van de SC na 15°, 18° en 20° linker- en neerwaartse (225°) saccades geleidelijk de saccadewinst (figuur 4D). Deze afname van de winst vereiste ~ 250 proeven (groene cirkels) om terug te keren naar de pre-adaptatiewinst (zwarte cirkels), wat de basis in plasticiteit op lange termijn bevestigt.
In het tweede experiment (figuur 4E) werd de mosachtige vezelprojectie van de NRTP naar de oculomotorische vermis (OMV) van de cerebellaire cortex (lobben VIc en VII) optisch onderdrukt. Figuur 4F toont fluorescerend gelabelde mosachtige vezels en rozetten in de OMV (inzet). Geel laserlicht (589 nm) werd via optische vezels aan de OMV geleverd en een nabijgelegen wolfraamelektrode werd gebruikt om purkinje-celactiviteit te registreren. Figuur 4G toont eenvoudige piekactiviteit voor (grijs) en na (oranje) optogenetische inactivatie van NRTP-projecties (figuur 4G, boven). Vóór de inactivatie vertoonde de Purkinje-cel een dubbel burst-patroon voor 12° rechtse saccades (figuur 4G, midden, grijs). Tijdens de inactivering nam de vuursnelheid af en veranderde in een burst-pauzepatroon (figuur 4G, midden, oranje). Het vergelijken van deze twee responspatronen suggereert dat de mosachtige vezelinvoer naar Purkinje-cellen de vertragingsfase van de saccade beïnvloedt door de tweede uitbarsting aan te drijven (figuur 4G, midden, groen). De variabiliteit van rechtse saccades werd verminderd tijdens optogenetische inactivatie, in overeenstemming met het idee dat een deel van de trial-to-trial variabiliteit in saccade-metrieken te wijten is aan variabiliteit in de signalen die worden gedragen door mosachtige vezels (figuur 4G, bodem, oranje).
In het derde experiment (figuur 4H) werden Purkinje-cellen van de OMV optogenetisch gestimuleerd (figuur 4I). Een trein van korte lichtpulsen (1,5 ms pulsen, 65 mW, 50 Hz) verhoogde de eenvoudige piekactiviteit van een geïsoleerde Purkinje-cel (figuur 4J, boven). Individuele lichtpulsen van 1,5 ms riepen vaak >1 eenvoudige piek op (figuur 4J, onderaan). Optogenetische eenvoudige spike-activering, getimed om op te treden tijdens een saccade (10-ms lichtpuls, 60 mW), verhoogde saccade amplitude (figuur 4K), wat de desinhibitory rol van Purkinje-cellen op de oculomotorische burstgenerator bevestigt.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig4v2.jpg"> Figuur 4: Samenvatting van drie optogenetische experimenten uitgevoerd bij wakkere apen. (A-D) Experiment 1, pan-neuronale excitatie: virale injectie, laserstimulatie en eenheidsregistratie werden uitgevoerd in de superieure colliculus (A). (B) Representatieve eenheidsactiviteit die wordt opgeroepen door laserstimulatie. (C), horizontale (boven) en verticale (middelste) componenten van oogbewegingen en rasterplot van eenheidsactiviteit (onder) opgeroepen door laserstimulatie. (D) Een representatieve sessie van saccade-aanpassing geïnduceerd door laserstimulatie. Stimulatie (100 laserpulsen van 0,5 ms) werd 80 ms na elke saccade (inzet) toegediend. Saccade gain (saccade amplitude / doelamplitude) nam geleidelijk af gedurende onderzoeken. (E-G) Experiment 2, pathway-specifieke remming: een virale vector werd geïnjecteerd in de nucleus reticularis tegmenti pontis, en laserstimulatie en unitregistratie werden uitgevoerd in de oculomotorische vermis (E). (F) Histologisch gedeelte van de oculomotorische vermis met gelabelde mosachtige vezels (schaalbalk: 1 mm) en hun rozetten (inzet, schaalbalk: 100 μm). (G) Purkinje-celactiviteit (boven: raster, midden: gemiddelde vuursnelheid) en trajecten van visueel geleide saccades (onder) met en zonder laserstimulatie. Grijs: laser off trials, oranje: laser op trials, groen: verschil tussen grijs en oranje. (H-K) Experiment 3, celtypespecifieke activering: virale injectie, laserstimulatie en eenheidsregistratie werden uitgevoerd in de oculomotorische vermis (H). (I) Histologisch gedeelte van de oculomotorische vermis met gelabelde Purkinje-cellen. Schaalbalk: 100 μm. (J) Eenvoudige piekactiviteit van een Purkinje-cel opgeroepen door laserstimulatie. Boven: rasterplot uit 14 proeven. Onder: spanningstracering van een enkele representatieve studie. (K) Trajecten van visueel geleide saccades met en zonder laserstimulatie. Een lichtpuls van 10 ms tijdens saccades verhoogde de saccadeamplitudes. Individuele saccadetrajecten (cyaan) en hun gemiddelde (blauw) op laser-on proeven. Individuele saccadetrajecten (lichtgrijs) en hun gemiddelde (donkergrijs) op laser-off proeven. De lichtgolflengte was 450 nm in experimenten 1 en 3 en was 589 nm in experiment 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain at JoVE.com

Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain

Zoals momenteel geïmplementeerd, vereist optogenetica bij niet-menselijke primaten injectie van virale vectoren in de hersenen. Een optimale injectiemethode moet betrouwbaar zijn en, voor veel toepassingen, in staat zijn om individuele locaties van willekeurige diepte te targeten die gemakkelijk en ondubbelzinnig worden geïdentificeerd in de postmortale histologie. Een injectiemethode met deze eigenschappen wordt gepresenteerd.

Injecties van AAV-vectoren voor optogenetica in verdoofde en wakkere zich gedragende niet-menselijke primatenhersenen

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of ...

Veel gentherapeutische en neurowetenschappelijke studies omvatten de injecties van AAV-vectoren in de hersenen van niet-menselijke primaten. Om deze studies succesvol te laten zijn, moet de injectietechniek betrouwbaar zijn. Onze injectietechniek is onmiddellijk en nauwkeurig.Deze procedure werkt goed voor injectie bij verdoofde of wakkere dieren. Onze zelfgemaakte canule is gemakkelijk te hanteren en goedkoop. De procedure wordt gedemonstreerd door Kevin Mai, een technische technicus uit mijn laboratorium.Om te beginnen stompt u een 30-gauge 13-millimeter hypodermische naaldpunt met een schijfslijper. Snijd vervolgens een stuk roestvrijstalen buis op een lengte, afhankelijk van de diepte van het doelhersengebied. Met een schijvenslijper, afschuin het ene uiteinde van de gesneden buis en strijk het andere glad.Ontbraam de binnenkant van de buis met een broach. Snijd vervolgens een stuk PTFE-buis op een lengte die geschikt is voor het te laden vectoroplossingsvolume. Flare beide uiteinden van de buis door de stompe hypodermische naald in te brengen.Steek de stompe hypodermische naald ongeveer vijf millimeter in het ene uiteinde van de PTFE-buis. Steek vervolgens het ongeflankte uiteinde van de roestvrijstalen buis ongeveer vijf millimeter in het andere uiteinde. Test de canule door gefilterd water door de hypodermische naaldnaaf te injecteren.Controleer of water de afgeschuinde roestvrijstalen buispunt soepel verlaat en dat er geen water uit beide juncties lekt. Plaats na het testen van de canule deze in een autoclaafzak en steriliseer deze door autoclaveren. Breng de vectoroplossing voorzichtig over naar een gesteriliseerde PCR-buis met een P-20-pipetter, waardoor bellenvorming wordt vermeden.Bevestig vervolgens de canule met de afgeschuinde punt naar beneden gericht op een verticaal georiënteerde stereotaxische houder. Sluit vervolgens een luerlockspuit van één milliliter aan op de injectienaaldnaaf van de canule. Dompel de afgeschuinde punt onder in de vectoroplossing.Oefen vervolgens zachte negatieve druk uit met de spuit van één milliliter om de oplossing in de canule te laden terwijl u de meniscus visueel volgt tussen de oplossing en de lucht. Zodra de vectoroplossing is geladen, gaat u door met de zachte negatieve druk totdat de oplossing de naaldnaaf bereikt. Verwijder vervolgens de spuit van één milliliter en injecteer langzaam gekleurde minerale olie langs de binnenwand van de hypodermische naaldnaaf, waarbij u ervoor zorgt dat luchtbellen worden vermeden.Bevestig de hypodermische naaldnaaf aan een van de twee open poorten van een drieweg luer lock stopcock. Sluit vervolgens de poort. Vul een spuit van één milliliter met lucht en bevestig deze aan een van de andere twee poorten.Sluit ten slotte de resterende poort van de stopkraan om de spuit op de canule aan te sluiten. Door de spuit te bevestigen, wordt lucht in de stopkraan geforceerd en door deze lucht naar de onbezette poort te verplaatsen, wordt voorkomen dat de vectoroplossing terug naar beneden wordt geduwd in de canule. Duw de lucht van de spuit langzaam in de canule.Zodra de gekleurde olie verschijnt aan de punt van de stompe naald in de PTFE-buis, controleert u op lucht tussen de oplossing en de gekleurde olie. Blijf positieve druk uitoefenen totdat een druppel vectoroplossing zichtbaar is aan de afgeschuinde canulepunt. Sluit vervolgens de stopkraan om te voorkomen dat de vector door de zwaartekracht de canule verlaat.Zodra de vectoroplossing is geladen, bevestigt u de canule op de stereotaxische manipulator. Om vervolgens de stopkraan op de elektrische luchtpomp aan te sluiten, neemt u de pompslang van de niet-steriele assistent. Pak de luer lock connector door de wand van een steriele sleeve.Laat de kraag van de mouw vallen, zodat deze door de zwaartekracht langs de buis kan worden uitgeschoven. Bevestig vervolgens de stopkraan en plak de huls stevig rond de luer lock connector. Test vervolgens de luchtpomp en canule door de luchtpomp op lage druk te zetten, voordat u deze inschakelt en de druk verhoogt totdat de olie door de canule gaat en een druppel vectoroplossing zichtbaar is aan de tip van de canule.Plak een plastic liniaal op de PTFE-buis om de beweging van de meniscus tijdens de injectie te meten. Drijf vervolgens de canule naar beneden met de stereotaxische manipulator totdat de punt het oppervlak bereikt en noteer de diepte. Rijd de canule naar de diepste plaats om langs het spoor te worden geïnjecteerd.Het oppervlak zal bij contact kuiltjes worden. Om mis-targeting als gevolg van weefselcompressie te minimaliseren, drijft u de canule naar beneden en schiet u de diepste injectieplaats met 500 micrometer. Trek je vervolgens langzaam terug.Andere alternatieven zijn de canule langzaam naar beneden rijden of snel rijden en één tot vijf minuten op de bodem wachten. Zodra de canule op de diepste injectieplaats is geplaatst, gebruikt u de elektrische luchtpomp om 0,5 microliter van de vectoroplossing gedurende 10 tot 30 seconden te injecteren. Bevestig de injectiestroom door de meniscus tussen de gekleurde olie en de vectoroplossing in de PTFE-buis te volgen.Na een minuut wachten, trekt u de canule terug naar de volgende injectieplaats langs het spoor. Laat na de laatste injectie de canule 10 minuten op zijn plaats om vectorefflux te voorkomen. Trek vervolgens de canule in en gooi deze weg in een biohazard sharps-container.Injectie van AAV-vectoren die het kanaal rhodopsine II-transgen in de linker superieure colliculus dragen, gevolgd door stimulatie met continu blauw licht bij 40 milliwatt, produceerde een reeks opeenvolgende actiepotentialen. Lichtpulsen van één milliseconde riepen bij 40 milliwatt geen actiepotentialen op, maar riepen ze betrouwbaar op bij 160 milliwatt. Optische stimulatie van de superieure colliculus veroorzaakt door visueel geleide saccades verminderde de saccadewinst geleidelijk.De traagheid van deze verandering is consistent met optogenetisch geïnduceerde plasticiteit. Levering van geel laserlicht aan de oculomotorische vermis na AAV-injecties in de nucleus reticularis tegmentae pontis onderdrukte mosachtige vezelactiviteit, die een input is voor het cerebellum. Deze onderdrukking verminderde de Purkinje-celactiviteit, die een output is van het cerebellum.Tijdens optogenetische onderdrukking nam de vuursnelheid af en veranderde in een gebarsten poriënpatroon, wat suggereert dat de geremde mosachtige vezelinvoer naar Purkinje-cellen de vertragingsfase van het saccade beïnvloedt door de tweede uitbarsting te veroorzaken. Kanaal rhodopsine kwam uitsluitend tot expressie in Purkinje-cellen van de oculomotorische vermis. Levering van korte lichtpulsen verhoogde de eenvoudige piekactiviteit van een geïsoleerde Purkinje-cel.Een enkele lichtpuls van 1,5 milliseconde riep vaak meer dan één eenvoudige piek op. Optogenetische eenvoudige spike-activering getimed om op te treden tijdens de saccade verhoogde saccade amplitude, wat de desinhibitory rol van Purkinje-cellen op de oculomotorische burstgenerator bevestigt. Luchtbellen in de canule kunnen de olievectormeniscus verstoren, de bepaling van injectievolumes bemoeilijken en een fijne regeling van het debiet voorkomen.Om deze redenen is het laden van de vectoroplossingen zonder luchtbellen van cruciaal belang voor deze procedure. Zes tot acht weken na de injectie kunnen optogenetische manipulaties worden uitgevoerd en kan het hersenweefsel worden verwerkt voor histologische analyse. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om veel vectoren in enkele dieren te testen, wat op zijn beurt de ontwikkeling en validatie van nieuwe vectoren vergemakkelijkt.Een specifiek gebied van actueel belang is de ontwikkeling van vectoren die zich richten op specifieke neuronale typen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Labeling van neuronen van de knaagdieren en niet-menselijke primaten Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

Grootschalige Opname van Neuronen door Movable Silicon Probes in Behaving Knaagdieren

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

Een procedure voor het implanteren van georganiseerde Arrays van microwires voor Single-unit Opnamen in Awake, Gedragen Dieren

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Gelijktijdig Elektrofysiologische opname en Micro-injecties van remmende middelen in de knaagdierhersenen

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

De bereiding van niet-menselijke primaten Brain Tissue voor Pre-embedding immunohistochemie en elektronenmicroscopie

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic meevoeren van Hippocampal Theta oscillaties in het gedrag van muizen

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Optogenetics identificatie van een neuronale Type met een glazen Optrode in wakker muizen

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Productie, zuivering en kwaliteitscontrole voor Adeno-associated Virus gebaseerde vectoren

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

In vivo intracerebrale Stereotaxic injecties voor Optogenetische stimulatie van lange-afstand ingangen in muis hersenen segmenten

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...