Name: injections of aav vectors for optogenetics in anesthetized and awake behaving non-human primate brain
Uploaded: 2021-08-04T14:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי WaNPRC/ITHS P51OD010425 (JTT), מענקי המכון הלאומי לבריאות (NIH) EY023277 (R01 עבור YK), EY030441 (R01 עבור GH), MH114126 (RF1 ל-JTT, בועז לוי, אד ליין), MH120095 (UG3 עבור JTT ו-GH), EY028902 (R01 עבור RS), והתאפשר הודות למענקי NIH OD010425 (P51 עבור WaNPRC) וקרן מחקר התמלוגים של אוניברסיטת וושינגטון A148416. המחברים רוצים להודות ליסמין אל-שמאיילה וויקטוריה אומסטד על ההיסטולוגיה, לרפוחיו מרטינז על שיבוט וקטורים ויראליים, ולג'ון מיץ' על הסיוע בעיבוד רקמות המוח של NHP.

כל הניסויים בוצעו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה וחרגו מהדרישות המינימליות המומלצות על ידי המכון למשאבי חיות מעבדה והאיגוד להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה בינלאומי. כל ההליכים הוערכו ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת וושינגטון (פרוטוקול UW IACUC #4167-01). במחקר השתתפו חמישה קופי מקוק בריאים (2 מאקה מולטה, 3 מקה נמסטרינה; זכר. 4-11 שנים). מכשירים סטריליים וטכניקה שימשו בכל ההליכים הכירורגיים.
1. יצירת צינורית (איור 1A)
<ol><li>הכנת כל חלק<ol><li>קהה את הקצה של מחט היפודרמית (30 גרם, 13 מ"מ אורך) עם מטחנת דיסק.</li>
		<li>חותכים צינור נירוסטה (30 גרם, קוטר פנימי = 0.16 מ"מ, קוטר חיצוני = 0.31 מ"מ) לאורך המותאם לעומק אזור מוח המטרה (25 מ"מ מתאים היטב להזרקת המשטח הגבי של קליפת המוח). עם מטחנת דיסק, לשפוף קצה אחד של צינור לחתוך ולהחליק את השני. מנטרלים את החלק הפנימי של הצינור עם סיכה.</li>
		<li>חותכים את צינורות polytetrafluoroethylene (PFTE) (קוטר פנימי = 0.23 מ"מ ± 0.02 מ"מ, קיר = 0.23 מ"מ ± 0.02 מ"מ, 1 מ"מ מתאים 42 nL ± 7 nL של נוזל) לאורך המתאים לכמות הפתרון הווקטורי שיש לטעון (1 μL של פתרון וקטורי תופס 24 מ"מ של צינורות). התלקחות שני הקצוות של צינור PTFE על ידי החדרת מחט היפודרמית קהה.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנס את המחט ההיפודרמית הקהה כ -5 מ"מ לקצה אחד של צינור ה- PTFE. הכנס את הקצה הלא משופע של צינור הנירוסטה כ-5 מ"מ לקצה השני (איור 1A).</li>
	<li>בצע בדיקות טרום הזרקה. להזריק מים מסוננים דרך רכזת המחט ההיפודרמית של הצינורית. ודא שהמים יוצאים מצינור הנירוסטה המשופע מהקצה ושהמים אינם דולפים מאף אחד מהצמתים.</li>
</ol>2. הליך הזרקה לבעלי חיים מורדמים
<ol><li>הכנה לניתוח<ol><li>לעקר מכשירים כירורגיים ואספקה באמצעות ההליכים בטבלת החומרים.</li>
		<li>במידת הצורך, בצעו MRI ראש כדי להתמקד במבנים מוחיים עמוקים (איור 2A).</li>
		<li>מיד לפני הניתוח מרדימים את בעלי החיים בקטמין (10-15 מ"ג/ק"ג) ונותנים אנטיביוטיקה (צפזולין) ומשככי כאבים (בופרנורפין ומלוקסיקם בשחרור מושהה) באופן שרירי. לאחר מכן, יש להעביר פרופופול באמצעות קטטר תוך ורידי (IV) בוורידים הספניים או הצפליים.</li>
		<li>אינטובציה של החיה והעברתה לגז איזופלורן. אשר הרדמה נכונה על ידי קצב לב יציב, לחץ דם, קצב נשימה, שרירי שלד רפויים, והיעדר רפלקסים של פלפברל או נסיגה.</li>
		<li>לגלח את ראשה של החיה. יש למרוח משחת דמעות מלאכותית על הקרניות כדי למנוע התייבשות.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת אזור ההזרקה<ol><li>מניחים את ראש החיה במסגרת הסטריאוטקסית. יש למרוח תמיסת פילינג כירורגית על העור המגולח באמצעות ספוגי גזה, להפעיל לחץ עדין כדי לשחרר לכלוך, ולשטוף עם אלכוהול איזופרופיל. חזור על תהליך זה שלוש פעמים. מכסים את החיה עם וילון fenestrated סטרילי. חותכים את העור ומשקפים את השריר. הניחו את המניפולטור על הזרוע הסטריאוטקסית, מקמו אותה כך שתכוון לאזור מוח המטרה, וסמנו את מיקום הקרניוטומיה על הגולגולת בעט מעוקר.</li>
		<li>הסר את המניפולטור הסטריאוטקסי ובצע את הקרניוטומיה. חתוך את הדורה אם תרצה (למשל, כדי לדמיין ציוני דרך סולקליים). החזר את המניפולטור לזרוע הסטריאוטקסית.</li>
	</ol></li>
	<li>טעינת תמיסות וקטוריות (איור 1C)<ol><li>העבר בעדינות את הפתרון הווקטורי לצינור PCR מעוקר עם פיפטור P20, תוך הימנעות מבועות.</li>
		<li>חברו צינורית, כשהקצה המשופע פונה כלפי מטה, למחזיק סטריאוטקסי בכיוון אנכי. חבר מזרק Luer-lock 1 מ"ל לרכזת המחט ההיפודרמית של הצינורית.</li>
		<li>טבלו את הקצה המשופע של הצינורית בתמיסה הווקטורית. הערה: המזרק צריך להיות מחובר כבר; חיבורו בנקודה זו יכניס בועות לפתרון הווקטורי.</li>
		<li>טען את התמיסה לתוך הצינורית על ידי הפעלת לחץ שלילי עדין עם מזרק 1 מ"ל. מעקב חזותי אחר המניסקוס בין התמיסה לאוויר.</li>
		<li>לאחר טעינת התמיסה הווקטורית, המשיכו בלחץ השלילי העדין עד שהתמיסה תגיע לרכזת המחט. הסר את מזרק 1 מ"ל ולהזריק את השמן המינרלי הצבעוני לתוך רכזת מחט היפודרמית. הערה: יש להזריק את השמן באיטיות לאורך הדופן הפנימית של רכזת המחט כדי ליצור מניסקוס שקוף עם התמיסה הווקטורית ולמנוע בועות אוויר.</li>
		<li>חבר את רכזת המחט ההיפודרמית לאחת משתי היציאות הפתוחות של פקק Luer-lock תלת-כיווני. הערה: הצמדת המחט ההיפודרמית ליציאה הסגורה תיצור לחץ אוויר לא רצוי מאחורי השמן.</li>
		<li>סגור את היציאה המחוברת לרכזת המחט ההיפודרמית, מלא מזרק של 1 מ"ל באוויר, וחבר אותו לאחת משתי היציאות האחרות. לבסוף, סגור את היציאה הנותרת של stopcock כדי לחבר את המזרק לצינורית.</li>
		<li>דוחפים לאט את האוויר לתוך הצינורית. ברגע שהשמן הצבעוני מופיע בקצה המחט הבוטה בצינורות ה-PTFE, בדקו אם יש אוויר בין התמיסה לשמן הצבעוני.</li>
		<li>אם קיים אוויר, יש להפעיל לחץ שלילי על המזרק כדי להחזיר את השמן הצבעוני לרכזת המחט. מוציאים את הבועה ומפעילים לחץ חיובי עד שנראית טיפה של תמיסה וקטורית בקצה הצינורית המשופעת.</li>
		<li>הסר את מזרק 1 מ"ל כדי לשחרר לחץ אוויר לא רצוי מאחורי השמן וסגור את הפקק כדי למנוע מהווקטור לצאת מהצינורית על ידי כוח הכבידה.</li>
		<li>הדביקו סרגל פלסטיק לצינורות PTFE כדי למדוד את תנועת המניסקוס במהלך ההזרקה (איור 1B,D,F).</li>
	</ol></li>
	<li>החדרת צינורית לאזור מוח המטרה (איור 1B)<ol><li>הצמידו את הצינורית למניפולטור הסטריאוטקסי.</li>
		<li>העבר ידנית את צינורות המשאבה (המסתיימים במחבר Luer-lock) מהעוזר הלא סטרילי למנתח. על המנתח לאחוז במחבר Luer-lock דרך דופן שרוול סטרילי, להדביק פקק סטרילי שני למחבר, להדביק את השרוול בחוזקה סביבו, ולאחר מכן להפיל את צווארון השרוול, ולאפשר לו להתארך לאורך הצינור על ידי כוח הכבידה.</li>
		<li>חבר את ה-stopcock המחובר לצינור הצינורית ל-stopcock המחובר למשאבת האוויר. מכוונים את משאבת האוויר ללחץ נמוך, מפעילים אותה ומגבירים את הלחץ עד שהשמן מתקדם דרך הצינורית וניתן לראות טיפה של תמיסה וקטורית בקצה הצינורית.</li>
		<li>התאם את מיקום סרגל הפלסטיק על צינורות PTFE כדי למדוד את תנועת המניסקוס במהלך ההזרקה.</li>
		<li>להניע את הצינורית למטה עם מניפולטור סטריאוטקסי ולהקליט את העומק שבו הקצה מגיע אל פני השטח (דורה או פיה מאטר).</li>
		<li>סעו בצינורית לאתר העמוק ביותר שיש להזריק לאורך המסלול. פני השטח יהיו גושמים. אם מזריקים קליפת משטח, יש לוודא באופן חזותי שהצינורית חדרה לפני השטח, עם מיקרוסקופ כירורגי או זכוכית מגדלת אם קיימת.</li>
		<li>כדי למזער את המיקוד השגוי כתוצאה מדחיסת רקמות, דחפו את הצינורית באיטיות (1 מ"מ/דקה), במהירות (0.5 מ"מ לשנייה) עם המתנה של 1-5 דקות בתחתית, או השתלטו על אתר ההזרקה העמוק ביותר ב-500 מיקרומטר ואז נסוגו.</li>
	</ol></li>
	<li>זריקה<ol><li>הזרקת 0.5 μL של הפתרון הווקטורי עם משאבת האוויר החשמלית מעל 10-30 שניות. אשר את זרימת ההזרקה על ידי מעקב אחר המניסקוס בין השמן הצבעוני לתמיסה הווקטורית בצינור PTFE.</li>
		<li>יש להמתין דקה אחת ולהחזיר את הצינורית לאתר ההזרקה הבא לאורך המסלול.</li>
		<li>לאחר ההזרקה הסופית, השאירו את הצינורית במקומה למשך 10 דקות כדי למנוע שטף וקטורי.</li>
		<li>החזירו את הצינורית והשליכו אותה למיכל ביו-האזרד שארפ.</li>
		<li>לחלופין, יש להזריק כמות קטנה (≤1 μL) של מיקרובים פלואורסצנטיים ליד אתר ההזרקה הווקטורית כדי להקל על זיהוי אתר ההזרקה לאחר המוות.</li>
		<li>חזור על הליך זה כרצונך עבור הפתרונות הווקטוריים האחרים במיקומים אחרים (איור 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>סגירת ניתוח<ol><li>תפר את הדורה, את השריר ואת העור.</li>
		<li>הסר את הקוף מהמסגרת הסטריאוטקסית והסר את כל כבלי הצג.</li>
		<li>מוציאים את הקוף מהרדמה של איזופלוראן ומוציאים אותו לאחר חזרת רפלקס הבליעה.</li>
		<li>מתן טיפול לאחר ניתוח (3-5 ימים של meloxicam ו 7-10 ימים של cephalexin). עקוב אחר החיה לפחות פעם אחת כל 10 דקות עד שהיא מסוגלת לשמור על תנוחת ישיבה זקופה ויציבה.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ניתוח והזרקת וקטור AAV לבעלי חיים ערים שמתנהגים (איור 1D)
הערה: ניתן להשתמש בגרסה של הטכניקה כדי לבצע זריקות לתוך מוחם של קופים ערים ומתנהגים, כפי שמתואר להלן.
<ol><li>הזרקה סימולטנית עם הקלטה<ol><li>כדי לרשום פעילות חשמלית באתר ההזרקה, מצפים את החלק החיצוני של הצינורית באפוקסי (תחתון ~ 15 מ"מ) וצינורות פולימיד (אורך שנותר). חשוף את המתכת בקצה על-ידי גירוד האפוקסי ממנה (Injectrode, איור 1F)2. לחלופין, הכנס את הצינורית ואלקטרודה חוץ-תאית נפרדת, זו לצד זו, לתוך צינור מנחה בעל שני קנים (צינור מדריך דו-קני, איור 1E).</li>
	</ol></li>
	<li>החדרת צינורית לאזור מוח המטרה.<ol><li>הניחו את הקוף בתא הניסוי, הגבילו את תנועת הראש ונקו את תא ההקלטה המותקן על גולגולת בטכניקות סטנדרטיות.</li>
		<li>אבטח צינור מדריך למיקרו-דרייב. הכנס את צינורית ההזרקה לתוך צינור המנחה.</li>
		<li>מקדמים את הצינורית עד שהקצה בולט מצינור ההנחיה.</li>
		<li>חבר את ה-stopcock למשאבת האוויר החשמלית. כדי לוודא תפקוד תקין של המערכת, יש לדחוף טיפה של תמיסה וקטורית מהקצה באמצעות משאבת האוויר ולאשר את תנועת התמיסה השמן-וקטורית מניסקוס.</li>
		<li>משוך את הצינורית ~ 5 מ"מ לתוך צינור המדריך כדי להגן עליו מפני נזק במהלך החדרת הצינור למוח. הכנס את צינור ההנחיה למוח.</li>
		<li>סע את הצינורית לאתר להזרקה באמצעות המיקרו-דרייב. זהה את אתר המטרה על-ידי הקלטה חשמלית (איור 2C) או על-ידי גירוי.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig1v2.jpg"> איור 1: מערך הניתוח והמנגנון . (A) צינורית הזרקה. כל חלק של הצינורית מצוין. משובץ בצד ימין למטה: תמונה מוגדלת של קצה צינורית, סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (B) מערך ניתוח לקופים מורדמים. הקוף ממוקם במסגרת סטריאוטקסית מתחת לווילון כירורגי. מכונת הנשמה (V), קו תוך ורידי (IV), מוניטור לחץ דם (BP) ומוניטור ריווי חמצן (O2) מחוברים לקוף. צינורית ההזרקה מוחדרת לאזור המטרה באמצעות מיקרומניפולטור סטריאוטקסי. הפתרון הווקטורי מוזרק על ידי משאבת אוויר חשמלית (כניסה שמאלית תחתונה, חומה) המצומדת למדחס אוויר (כניסה שמאלית תחתונה, כחולה). סרגל פלסטיק (כניסה עליונה) מודבק לצינורות PTFE כדי למדוד את תנועת המניסקוס בין שמן צבעוני (כניסה עליונה, אדום) ותמיסה וקטורית (כניסה עליונה, שקוף) במהלך ההזרקה. (C) הגדרה לטעינת תמיסה וקטורית לתוך הצינורית. (D) קוף במהלך הזרקה של תמיסה וקטורית בתא ניסוי. ראש החיה מוחזק במקומו על ידי שלוש עמדות ייצוב, ומיקום העין נרשם על ידי מערכת סליל חיפוש סקלרלית. צינורית ההזרקה מוחזקת ומונעת לעומק המטרה באמצעות מחזיק/דרייבר מיקרו-אלקטרודה. ההזרקה נשלטת על ידי ניטור המניסקוס בין השמן הצבעוני לתמיסה הווקטורית באמצעות מצלמת USB (תמונה משובצת). (E) הזרקת צינור מדריך דו-קני. מחזיק/דרייבר של צינור מדריך בעל קנה כפול מחזיק צינורית הזרקה ומיקרו-אלקטרודה (ראו כניסה). (ו) הזרקה. המתכת בקצה הצינורית, שנחשפה על ידי גירוד שכבת האפוקסי, מספקת גישה חשמלית לנוירונים (כניסה, סרגל אבנית: 500 מיקרומטר). (G) הגדרת גירוי לייזר. מחזיק/דרייבר של צינור מדריך בעל קנה כפול מכיל גם סיב אופטי וגם מיקרו-אלקטרודה (ראו כניסה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig2v2.jpg"> איור 2: דיאגרמה של אתרי הזרקת AAV . (A) מקטע סגיטלי של תמונת MR מוחית המציג אתרי הזרקה בקליפת המוח המוטורית העיקרית ובקליפת המוח הראייתית הראשונית של נמסטרינה של מקאקה. (B) מבט מהמשטח הגבי על לוח האטלס המתאים המראה מיקום צינורית ביחס לסולקוס המרכזי (קליפת המוח המוטורית העיקרית) וקליפת המוח הראייתית הראשונית. (C) הקלטת יחידה על ידי הזרקה בקוליקולוס העליון. יחידה שבודדה לפני ההזרקה (ימין למעלה) נעלמה לאחר ההזרקה (למטה ימנית). (D) מסלול הזרקה (חצים לבנים). סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
4. עיבוד רקמת המוח להיסטולוגיה
<ol><li>יש להמתין 6-8 שבועות לאחר ההזרקה כדי למקסם את הביטוי הטרנסגני. הערה: משך הזמן האופטימלי תלוי בווקטור הוויראלי המדויק ששימש בניסוי.</li>
	<li>לעבד את המוח באמצעות טכניקות היסטולוגיות קונבנציונליות כדי להעריך את יעילות ההתמרה ואת הסלקטיביות 5,6,7.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kojima, Y., Robinson, F. R., Soetedjo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+fastigial+nucleus+influence+on+ipsilateral+abducens+activity+during+saccades.">Cerebellar fastigial nucleus influence on ipsilateral abducens activity during saccades.</a> Journal of Neurophysiology. 111 (8), 1553-1563 (2014).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+the+error+signal+in+the+superior+colliculus+impairs+saccade+motor+learning.">Elimination of the error signal in the superior colliculus impairs saccade motor learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8987-8995 (2018).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+GABA+agonist+and+antagonist+injections+into+the+oculomotor+vermis+on+horizontal+saccades.">Effects of GABA agonist and antagonist injections into the oculomotor vermis on horizontal saccades.</a> Brain Research. 1366, 93-100 (2010).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inactivation+and+disinhibition+of+the+oculomotor+vermis+on+saccade+adaptation.">Effect of inactivation and disinhibition of the oculomotor vermis on saccade adaptation.</a> Brain Research. 1401, 30-39 (2011).</li><li>De, A., El-Shamayleh, Y., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+reversible+neural+inactivation+in+macaque+cortex+by+optogenetic+stimulation+of+GABAergic+neurons.">Fast and reversible neural inactivation in macaque cortex by optogenetic stimulation of GABAergic neurons.</a> eLife. 9, 52658 (2020).</li><li>El-Shamayleh, Y., Kojima, Y., Soetedjo, R., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+optogenetic+control+of+Purkinje+cells+in+monkey+cerebellum.">Selective optogenetic control of Purkinje cells in monkey cerebellum.</a> Neuron. 95 (1), 51-62 (2017).</li><li>Mich, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+enhancer+elements+drive+subclass-selective+expression+from+mouse+to+primate+neocortex.">Functional enhancer elements drive subclass-selective expression from mouse to primate neocortex.</a> Cell Reports. 34 (13), 108754 (2021).</li><li>Graybuck, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+viruses+for+combinatorial+cell+subclass-specific+labeling.">Enhancer viruses for combinatorial cell subclass-specific labeling.</a> Neuron. (21), 00159 (2020).</li><li>Michel, J., Benninger, D., Dietz, V., van Hedel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacle+stepping+in+patients+with+Parkinson's+disease.+Complexity+does+influence+performance.">Obstacle stepping in patients with Parkinson's disease. Complexity does influence performance.</a> Journal of Neurology. 256 (3), 457-463 (2009).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li><li>Kaku, Y., Yoshida, K., Iwamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+signals+from+the+superior+colliculus+for+adaptation+of+saccadic+eye+movements+in+the+monkey.">Learning signals from the superior colliculus for adaptation of saccadic eye movements in the monkey.</a> Journal of Neuroscience. 29 (16), 5266-5275 (2009).</li><li>Soetedjo, R., Fuchs, A. F., Kojima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subthreshold+activation+of+the+superior+colliculus+drives+saccade+motor+learning.">Subthreshold activation of the superior colliculus drives saccade motor learning.</a> Journal of Neuroscience. 29 (48), 15213-15222 (2009).</li><li>Kleinbart, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+implant+system+for+multimodal+recording+and+manipulation+of+the+primate+brain.">A modular implant system for multimodal recording and manipulation of the primate brain.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. Annual International Conference. 2018, 3362-3365 (2018).</li><li>Arieli, A., Grinvald, A., Slovin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dural+substitute+for+long-term+imaging+of+cortical+activity+in+behaving+monkeys+and+its+clinical+implications.">Dural substitute for long-term imaging of cortical activity in behaving monkeys and its clinical implications.</a> Journal of Neuroscience Methods. 114 (2), 119-133 (2002).</li><li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Fredericks, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+mechanical+delivery+of+viral+vectors+into+rhesus+monkey+brain.">Methods for mechanical delivery of viral vectors into rhesus monkey brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108730 (2020).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+labeling+of+inhibitory+and+excitatory+cortical+neurons+by+endogenous+tropism+of+adeno-associated+virus+and+lentivirus+vectors.">Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors.</a> Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ההתקדמות באופטוגנטיקה של NHP יצרה צורך בשיטות הזרקה תוך גולגולתיות מדויקות ואמינות. היתרונות של השיטה המתוארת בדו"ח זה הם שהיא זולה, משתמשת ברכיבים מעוקרים וחד פעמיים, ובעלת יכולת להתמקד באזורי מוח מגוונים בכל עומק. זה גם מאפשר שליטה על מהירות ההזרקה ונפח בזכות המהירות שבה ניתן לשלוט בשסתום האוויר. ניתן להגביר את לחץ האוויר באופן חולף כדי לעקור סתימה ולאחר מכן להפחית במהירות כדי למנוע הזרקת יתר לאחר מכן שתיווצר על ידי לחץ מתמשך. רכיבים חד פעמיים מפחיתים את הסיכון לזיהום צולב בין אתרי ההזרקה.
שלבים קריטיים בפרוטוקול ההזרקה זה כוללים בניית צינוריות איכותיות, העמסתן ללא החדרת בועות ובחירת אתרי הזרקה שאינם קרובים מדי זה לזה. זריקות בהפרש של ≥1 ס"מ בדרך כלל מתמרת אזורים שאינם חופפים, אך היוריסטיקה זו תלויה בסרוטיפ ויראלי, טיטר, מקדם, נפח, מטרה ושיטת זיהוי. בחירת אתרי הזרקה שאינם מחוברים ישירות מונעת בלבולים פוטנציאליים המיוצרים על ידי סחר באופסין לאורך אקסונים ואת הנטייה של חלק מהסרוטיפים של AAV להתמרה מדרדרת.
השיטה יכולה לשמש להזרקת NHPs בזמן שהם מורדמים ובמסגרת סטריאוטקסית (איור 3) או בהתראה ובראש קבוע (איור 4). לראשון יש יתרון בכך שהוא מאפשר לזריקות להיות ממוקדות בקואורדינטות סטריאוטקסיות, והוא מאפשר אישור חזותי לחדירת צינורית דרך דורוטומיה חריפה (חיתוך הדורה בקוף ער, באמצעות קרניוטומיית כרונית, מעלה את הסיכון לזיהום). לגישה השנייה יש את היתרונות של הפחתת מספר ניתוחי ההישרדות ולכן הלחץ על החיה, להיות תואם הקלטות אלקטרופיזיולוגיות במהלך ההתנהגות, ושימוש באותה מסגרת קואורדינטות ומכשור המשמש להחדרת סיבים אופטיים לניסויים לאחר הזרקה. ניתן לשפר עוד יותר את טכניקת ההזרקה בקופים ערים על ידי ביצוע הזרקות באמצעות דורה מלאכותית13,14,15. זה יעניק את היתרונות הנוספים של הדמיה ישירה של אתרי הזרקה ואת פלואורסצנטיות הרקמה המצביעה על התמרה מוצלחת.
מספר טכניקות הזרקת AAV אחרות שימשו ב- NHPs. לאחרונה פותח מכשיר הזרקה רב-ערוצי כדי לספק וקטורים של AAV באופן אחיד לאזורים גדולים בקליפת המוח של NHP16. תוצאות דומות ניתן להשיג באמצעות הסעה משופרת משלוח17,18. שיטות אלה שואפות למקסם את התפשטות ההתמרת, שהיא מטרה חשובה אך שונה מהדיוק המרחבי שהשיטה שלנו שואפת להשיג.
שיטה חלופית נוספת היא להזריק וקטורים של AAV דרך צינורות בורוסיליקט המשופעים לקצה חד בקצה אחד ומחוברים למזרק המילטוןבקצה השני 5,6. לשיטה זו יש הרבה מן המשותף עם השיטה המתוארת במאמר זה. הווקטור הוויראלי מוחזק באורך של צינורות, החלל בצינורות שמאחורי הנגיף מלא בשמן צבוע, וזרימת הווקטור מנוטרת באמצעות תנועת המניסקוס וקטור השמן. טכניקה חלופית זו דורשת פחות ציוד והכנה, אך היא דורשת משיכת שמן לתוך צינורות הבורוסיליקט דרך הקצה המשופע בלחץ שלילי והעמסת הווקטור דרך אותו מסלול לאחר מכן. התוצאה היא בהכרח עקבות של שמן המועברים למוח. בנוסף, מניסיוננו, צינורות הבורוסיליקט חייבים להיות בקוטר של ~350 מיקרומטר כדי לחדור לדורה גם כאשר הם משופעים ולכן גורמים לנזק מכני גדול יותר מאשר צינורית המתכת הדקה יותר המתוארת במאמר זה (איור 2D). צינורות 30 G שימשו מכיוון שעומס האבזם הקריטי שלו גבוה מספיק כדי לתווך חדירת דורה למרות אורכו 1-10 ס"מ, מכיוון שהוא מתאים לצינורות PTFE בחוזקה, ומכיוון שהוא כמעט ולא נחסם. צינורות 33 G נסתמים ומתכופפים בקלות רבה יותר וקשה יותר להזדווג עם צינורות PTFE. צינורות 36 G אינם נוקשים מספיק כדי לחדור ל-NHP dura mater.
טכניקת הזרקה חלופית נוספת היא לחבר את הפלט של משאבת האוויר לחלק האחורי של פיפטה19 טעונה וקטורית, זכוכית משוכת. הווקטור נאלץ מקצה הפיפטה על ידי לחץ אוויר ישיר, לסירוגין מהמשאבה, ומבטל את הצורך בשמן. בדומה לשיטת הצינור הבודד שהוסברה לעיל, היעדר צמתים חומריים בין המניסקוס לקצה הצינורית מקטין את הסיכון לדליפות. עם זאת, הקצוות המחודדים החדים והעדינים של פיפטות הזכוכית מונעים מהם לחדור לדורת NHP או לפגוע במבנים עמוקים.

אופטוגנטיקה בפרימטים שאינם אנושיים (NHPs) כוללת בדרך כלל הזרקה של וקטור נגיפי ישירות למוח. מחלקה אחת של וקטורים המתאימה היטב ליישום זה מבוססת על וירוס הקשור לאדנו (AAV). וקטורים אלה מורכבים מקפסיד חלבוני המקיף גנום דנ"א חד-גדילי, אשר בתורו מורכב ממקדם, גן אופסין, ובאופן אופציונלי, אלמנטים אחרים של קידוד חלבונים וויסות גנים. ההתקדמות בשיבוט מולקולרי הקלה על מניפולציה ושילוב של רכיבים אלה לפיתוח וקטורים חדשים. כתוצאה מכך, אוסף וקטורי AAV שעשויים להיות שימושיים עבור אופטוגנטיקה של NHP הוא גדול וגדל במהירות.
כיום, התועלת של וקטור AAV עבור אופטוגנטיקה של NHP דורשת בדיקה in vivo. עובדה זו מהווה חסם משמעותי להתקדמות. יש להשתמש בבעלי חיים במשורה, ובדיקת וקטורים מרובים בחיה אחת דורשת שאתרי ההזרקה ימוקמו באופן מושכל יחסית לארכיטקטורה העצבית ומופרדים היטב ביחס להתפשטות הנגיף. הערכה היסטולוגית מדויקת דורשת שהזריקות יהיו מדויקות מבחינה מרחבית ונפחית. טכניקת הזרקה ששימשה בעבר למשלוח מוקדי של חומרים פרמקולוגיים 1,2,3,4 הותאמה ופשטה לביצוע זריקות כאלה. טכניקת הזרקה זו היא זולה, משתמשת ברכיבים חד פעמיים ומעוקרים, ניתן להשתמש בה בקופים מורדמים או ערים, וניתן להשתמש בה כדי להתמקד באזורי מוח מגוונים בכל עומק. הפרוטוקול הבא מתאר נהלים שלב אחר שלב לייצור הרכיבים החד פעמיים וביצוע זריקות במוח NHP. היתרונות והחסרונות של הטכניקה נדונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment: Stereotaxic set</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allen keys</td>
			<td>BONDHUS</td>
			<td>10936</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula holder</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1770</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier (manipulator)</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1404</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier platform</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier stand</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1449</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye, ear, mouth bars</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic base</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1210</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: Cannula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Luer-lock syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannulas*</td>
			<td>(homemade - see below)</td>
			<td>NA</td>
			<td>steam (autoclave)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colored oil**</td>
			<td>(homemade - see below)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator (for tube rack)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-08057-10</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>23-404</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microbeads</td>
			<td>Lumafluor</td>
			<td>R170</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10003M</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>22-161</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>3060004</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rack</td>
			<td>homemade</td>
			<td>NA</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector solution</td>
			<td>(homemade)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: Electric air pump set</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric air pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot pedal</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>3260</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube cover</td>
			<td>EZ Drape</td>
			<td>A400-1000</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: General surgery tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>azlon</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>277-10-235</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double pronged tissue pick</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18067-11</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drapes</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJP3004</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>6-118</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>Q9R-5400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bits</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>277-82-87</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>NON26334</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic mosquito forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>7-2, 7-4</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light handles</td>
			<td>SKYTRON</td>
			<td>Stellar XL</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle hodler</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>8-2</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periosteal elevator</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>18-1968</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>17-4800</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>BAXTER</td>
			<td>2F7122</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>372610</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>5-12, 5-114</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senn retractors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>28065</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>Triumph Micro</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction</td>
			<td>medela</td>
			<td>200-4869</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction tip</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNDFR12S</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction tube</td>
			<td>COVIDEN</td>
			<td>8888301614</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gowns</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJP2002S</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical pens &#38; ruler</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJSM03</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>COVIDEN</td>
			<td>SL-635</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>6-114</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Towel clamps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>7-504</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood swabs</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>MDS202095</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: *cannulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle</td>
			<td>EXELINT INTERNATIONAL</td>
			<td>26437</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>K-TUBE</td>
			<td>K30R</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tube</td>
			<td>ZEUS</td>
			<td>216200</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: **colored oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Candle Dye Concentrate</td>
			<td>PremiumCraft</td>
			<td>Red/Pink</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Vi-Jon</td>
			<td>S0883</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injections of aav vectors for optogenetics in anesthetized and awake behaving non-human primate brain

טכניקות אופטוגנטיות חוללו מהפכה במחקר במדעי המוח ועומדות לעשות את אותו הדבר עבור ריפוי גנטי נוירולוגי. השימוש הקליני באופטוגנטיקה, לעומת זאת, מחייב להדגים בטיחות ויעילות במודלים של בעלי חיים, באופן אידיאלי בפרימטים שאינם בני אדם (NHPs), בגלל הדמיון הנוירולוגי שלהם לבני אדם. מספר הווקטורים המועמדים שעשויים להיות שימושיים למדעי המוח ולרפואה הוא עצום, ועדיין לא קיים אמצעי בעל תפוקה גבוהה לבדיקת וקטורים אלה. לפיכך, יש צורך בטכניקות לביצוע הזרקות מדויקות מרחבית ונפחית של וקטורים ויראליים למוח NHP שניתן לזהות באופן חד משמעי באמצעות היסטולוגיה שלאחר המוות. המתוארת כאן היא שיטה כזו. צינוריות הזרקה בנויות מצינורות פוליטטרפלואורואתילן מצומדים וצינורות נירוסטה. צינוריות אלה הן אוטו-קלביות, חד-פעמיות ובעלות נפחי טעינה מינימליים נמוכים, מה שהופך אותן לאידיאליות להזרקת תמיסות וקטוריות ויראליות יקרות ומרוכזות מאוד. שמן מינרלי אינרטי, צבוע באדום, ממלא את החלל המת ויוצר מניסקוס נראה לעין עם התמיסה הווקטורית, המאפשר מדידה מיידית ומדויקת של קצבי ההזרקה ונפחים. השמן נטען לחלק האחורי של הצינורית, מה שמקטין את הסיכון להזרקה משותפת עם הווקטור. ניתן לטעון צינוריות תוך 10 דקות, וניתן לבצע זריקות תוך 20 דקות. הליך זה מתאים היטב להזרקות לבעלי חיים ערים או מורדמים. כאשר משתמשים בו כדי לספק וקטורים ויראליים באיכות גבוהה, הליך זה יכול לייצר ביטוי חזק של חלבונים אופטוגנטיים, ומאפשר שליטה אופטית על הפעילות וההתנהגות העצבית ב- NHPs.

כדי להדגים ביטוי טרנסגני על ידי הזרקה סטריאוטקסית in vivo למוח NHP באמצעות שיטת ההזרקה הכירורגית המתוארת כאן, נבחרו שני וקטורים שהכילו משפרים המניעים ביטוי של חלבון פלואורסצנטי צהוב-2 (SYFP2) בסוגים עצביים שונים 8,9. וקטורים נגיפיים נארזו בקפסידPHP.eB 10, טוהרו על ידי צנטריפוגה של יודיקסנול, ולאחר מכן רוכזו לטיטר גבוה (>1E13 גנום ויראלי/מ"ל) כפי שנמדד על ידי qPCR. נפח של 0.5 μL הוזרק בכל אחד מעשרה עומקים לאורך עשרה מסלולים דרך קליפת המוח לנפח הזרקה כולל של 5 μL/track. איור 3A-C מראה את ביטוי SYFP2 באמצעות חיסון אנטי-GFP 113 ימים לאחר הזרקת וקטור ה-AAV הספציפי לתת-מחלקה PVALB, CN2045, לתוך קליפת המוח הראייתית העיקרית של זכר בוגר מאקה נמסטרינה. הטרנסגן SYFP2 זוהה בחוזקה במספר נוירונים לא פירמידליים הפזורים על פני עומק קליפת המוח, ורוב תאי העצב המבטאים SYFP2 היו גם פעילים חיסונית עבור PVALB7. איור 3D מראה ביטוי SYFP2 מקורי בקליפת המוח המוטורית העיקרית 64 ימים לאחר ההזרקה של וקטור ה-AAV הספציפי לנוירון L5, CN2251. לנוירונים המסומנים ב-SYFP2 יש מורפולוגיה פירמידלית ברורה, כאשר סומאטה מוגבלת לשכבה 5 ודנדריטים אפיקליים עבים אופייניים. נתונים אלה מדגימים באופן חד משמעי שליטה מדויקת בביטוי טרנסגני באוכלוסיות נבחרות של נוירונים ניאו-קורטיקליים במוח NHP על ידי הזרקה סטריאוטקסית של וקטורים מסוג תאים המכוונים לווקטורים של AAV.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig3v2.jpg"> איור 3: דוגמה לביטוי SYFP2 ספציפי לסוג התא בתיווך וקטורים של AAV המוזרקים למוח NHP . (A) פוטומיקרוגרף אפיפלואורסצנטי של מקטע קבוע מקליפת המוח הראייתית הראשונית של המקוק 113 יום לאחר הזרקת וקטור AAV ספציפי לתת-מחלקה PVALB. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ.  (ב,ג) תמונת הגדלה גבוהה יותר של האזור המסומן בתיבות מוצגת ב-A. (B) אות אנטי-GFP. (C) אות אנטי-PVALB. פסי קנה מידה: 250 מיקרומטר. (D) פוטומיקרוגרף אפיפלואורסצנטי של פלואורסצנציה מקומית SYFP2 בקטע קבוע מקליפת המוח המוטורית העיקרית של המקוק 64 ימים לאחר הזרקת וקטור AAV תת-קרקעי חוץ-טלנצפלי משכבה 5. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
כדי להדגים את התועלת של טכניקת הזרקה זו למניפולציות אופטוגנטיות נוירופיזיולוגיות והתנהגותיות, בוצעו שלושה ניסויים, כל אחד על קוף אחר (Macaca mulatta). בניסוי הראשון (איור 4A-D), וקטורים של AAV שנשאו את הטרנסגן channelrhodopsin-2 (AAV1-hSyn1-ChR2-mCherry) הוזרקו לקוליקולוס העליון השמאלי (SC). הווקטור הוזרק כל 250 מיקרומטר ב-19 עומקים ובסך הכל 12 μL. בניסוי השני (איור 4E-G), 3 μL של תמיסת AAV1-hSyn-ArchT-EYFP הוזרקו לתוך גרעין הרשתית tegmenti pontis (NRTP). בניסוי השלישי (איור 4H-K), 24 μL של תמיסת AAV9-L7-ChR2-mCherry הוזרקו לקליפת המוח הקטן 6. שישה עד שמונה שבועות לאחר כל הזרקה, סיב אופטי ואלקטרודת טונגסטן הוכנסו למוח באמצעות צינור מנחה דו-קני (איור 1G).
איור 4B מראה את התגובה של נוירון SC לאור כחול (450 ננומטר). אור רציף (1.2 שניות) ב-40 mW יצר סדרה של פוטנציאלי פעולה עוקבים (איור 4B, למעלה). פולסים קלים באורך של אלפית שנייה אחת לא הצליחו לעורר פוטנציאל פעולה ב-40 mW (איור 4B, באמצע) אך כן עוררו פוטנציאל פעולה באופן אמין ב-160 mW, רמת ההספק הנוספת היחידה שנבדקה, עם השהיה של 2.7 ± 0.6 אלפיות השנייה (איור 4B, למטה). רכבת פולסים (160 mW, תדר: 300 הרץ, מחזור עבודה: 15%, משך: 300 אלפיות השנייה) עוררה סקאדות באופן עקבי עם השהיה ממוצעת של 97 ± 32 אלפיות השנייה, משרעת ממוצעת של 10.4° וזווית ממוצעת של 47° (כלפי מעלה וימינה; איור 4C).
בהתאם למחקרים ששינו את רווח הסקאדה באמצעות גירוי חשמלי תת-קרקעי של ה-SC11,12, גירוי אופטי של ה-SC לאחר 15°, 18° ו-20° שמאלה ומטה (225°) הפחית בהדרגה את רווח הסקאדה (איור 4D). ירידה זו ברווח דרשה ~ 250 ניסויים (עיגולים ירוקים) כדי לחזור לרווח שלפני ההסתגלות (עיגולים שחורים), ואישרה את בסיסו בפלסטיות ארוכת טווח.
בניסוי השני (איור 4E), היטל סיבי הטחב מה-NRTP אל הוורמיס האוקולומוטורי (OMV) של קליפת המוח הקטן (אונות VIc ו-VII) דוכא אופטית. איור 4F מראה סיבי טחב ורוזטות המסומנים באופן פלואורסצנטי ב-OMV (כניסה). אור לייזר צהוב (589 ננומטר) הועבר ל-OMV באמצעות סיבים אופטיים, ואלקטרודת טונגסטן סמוכה שימשה לתיעוד פעילות תאי פורקיניה. איור 4G מראה פעילות פשוטה של ספייק לפני (אפור) ואחרי (כתום) השתקה אופטוגנטית של תחזיות NRTP (איור 4G, למעלה). לפני ההשבתה, תא ה-Purkinje הציג תבנית התפרצות כפולה עבור סקאדות של 12° ימינה (איור 4G, באמצע, אפור). במהלך ההשבתה, קצב הירי ירד והשתנה לדפוס השהיית פרץ (איור 4G, באמצע, כתום). השוואה בין שתי תבניות התגובה האלה מציעה שקלט הסיבים הטחב לתאי Purkinje משפיע על שלב ההאטה של הסקאדה על-ידי הנעת הפרץ השני (איור 4G, באמצע, ירוק). השונות של סקאדות ימינה פחתה במהלך ההשבתה האופטוגנטית, בהתאם לרעיון שחלק מהשונות מניסוי לניסוי במדדי סקאדה נובעת משונות באותות הנישאים על-ידי סיבי טחב (איור 4G, למטה, כתום).
בניסוי השלישי (איור 4H), תאי Purkinje של ה-OMV היו מגורה באופן אופטיגנטי (איור 4I). רכבת של פולסים קצרים (פולסים של 1.5 מילי-שניות, 65 mW, 50 Hz) הגבירה את פעילות הספייק הפשוטה של תא Purkinje מבודד (איור 4J, למעלה). פעימות אור בודדות של 1.5 מילישניות עוררו לעתים קרובות >1 קפיצות פשוטות (איור 4J, למטה). הפעלת ספייק פשוטה אופטוגנטית, המתוזמנת להתרחש במהלך סקאדה (דופק אור של 10 אלפיות השנייה, 60 mW), משרעת סקאדה מוגברת (איור 4K), המאשרת את התפקיד הדיס-אינהיביטורי של תאי Purkinje על מחולל ההתפרצות האוקולומוטורית.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig4v2.jpg"> איור 4: סיכום של שלושה ניסויים אופטוגנטיים שבוצעו בקופים ערים. (A-D) ניסוי 1, עירור פאן-עצבי: הזרקה נגיפית, גירוי בלייזר ורישום יחידה נערכו בקוליקולוס העליון (A). (B) פעילות יחידה מייצגת המתעוררת על ידי גירוי לייזר. (C), רכיבים אופקיים (עליונים) ואנכיים (אמצעיים) של תנועות עיניים ותרשים רסטר של פעילות יחידה (למטה) המעוררת על ידי גירוי לייזר. (D) מפגש מייצג של הסתגלות סקאדה המושרה על ידי גירוי לייזר. הגירוי (100 פולסים לייזר של 0.5 אלפיות השנייה) נמסר 80 אלפיות השנייה לאחר כל סקאדה (כניסה). רווח סקאדה (משרעת סקאדה / משרעת מטרה) ירד בהדרגה בניסויים. (אי-ג) ניסוי 2, עיכוב ספציפי למסלול: וקטור נגיפי הוזרק לתוך גרעין הרשתית tegmenti pontis, וגירוי לייזר ורישום יחידה נערכו בוורמיס האוקולומוטורי (E). (F) חתך היסטולוגי של הוורמיס האוקולומוטורי המציג סיבי טחב מסומנים (סרגל קשקשים: 1 מ"מ) והרוזטות שלהם (כניסה, סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר). (G) פעילות תאי Purkinje (למעלה: רסטר, אמצע: קצב ירי ממוצע) ומסלולים של סקאדות מונחות חזותית (למטה) עם ובלי גירוי לייזר. אפור: לייזר מחוץ לניסויים, כתום: לייזר על ניסויים, ירוק: ההבדל בין אפור לכתום. (ח-ק) ניסוי 3, הפעלה ספציפית לסוג התא: הזרקה ויראלית, גירוי לייזר והקלטת יחידה נערכו בוורמיס האוקולומוטורי (H). (I) קטע היסטולוגי של הוורמיס האוקולומוטורי המציג תאי Purkinje המסומנים. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (J) פעילות ספייק פשוטה של תא Purkinje המעורר על ידי גירוי לייזר. למעלה: עלילת רסטר מ-14 ניסיונות. למטה: עקבות מתח מניסוי מייצג יחיד. (K) מסלולים של סקאדות מונחות חזותית עם ובלי גירוי לייזר. פולס אור של 10 אלפיות השנייה במהלך סקאדות הגביר את משרעת הסקאדה. מסלולי סקאדה בודדים (ציאן) והממוצע שלהם (כחול) בניסויי לייזר. מסלולי סקאדה בודדים (אפור בהיר) והממוצע שלהם (אפור כהה) בניסויים ללא לייזר. אורך גל האור היה 450 ננומטר בניסויים 1 ו-3 ו-589 ננומטר בניסוי 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig4v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain at JoVE.com

Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain

כפי שמיושם כיום, אופטוגנטיקה בפרימטים שאינם אנושיים דורשת הזרקה של וקטורים נגיפיים למוח. שיטת הזרקה אופטימלית צריכה להיות אמינה, ועבור יישומים רבים, מסוגלת להתמקד באתרים בודדים בעלי עומק שרירותי המזוהים בקלות ובאופן חד משמעי בהיסטולוגיה שלאחר המוות. שיטת הזרקה עם תכונות אלה מוצגת.

זריקות של וקטורים AAV לאופטוגנטיקה במוח פרימטים מורדם וער המתנהג באופן לא אנושי

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of ...

מחקרים טיפוליים גנטיים ומדעי המוח רבים כוללים זריקות של וקטורים של AAV למוחות של פרימטים שאינם אנושיים. כדי שמחקרים אלה יצליחו, טכניקת ההזרקה חייבת להיות אמינה. טכניקת ההזרקה שלנו היא מיידית ומדויקת.הליך זה עובד היטב להזרקה בבעלי חיים מורדמים או ערים. הצינורית הביתית שלנו קלה לטיפול ובעלות נמוכה. מי שידגים את ההליך יהיה קווין מאי, טכנאי הנדסה מהמעבדה שלי.כדי להתחיל, קהה 30 מד 13 מ"מ מחט היפודרמית עם מטחנת דיסק. לאחר מכן, חתכו חתיכת צינורות נירוסטה לאורך בהתאם לעומק אזור מוח המטרה. בעזרת משחזת דיסקים, משופעים בקצה אחד של צינור החיתוך ומחליקים את השני.מנטרלים את החלק הפנימי של הצינור עם סיכה. לאחר מכן, חתכו חתיכת צינורות PTFE לאורך המתאים לטעינת נפח הפתרון הווקטורי. התלקחות שני הקצוות של הצינור על ידי החדרת מחט היפודרמית קהה.הכנס את המחט ההיפודרמית הקהה כחמישה מילימטרים לקצה אחד של צינור ה- PTFE. לאחר מכן הכנס את הקצה הלא משופע של צינורות הנירוסטה כחמישה מילימטרים לקצה השני. בדוק את הצינורית על ידי הזרקת מים מסוננים דרך רכזת המחט ההיפודרמית.ודא שהמים יוצאים מקצה צינורות הנירוסטה המשופעים בצורה חלקה ושהמים אינם דולפים מאף אחד מהצמתים. לאחר בדיקת הצינורית, מניחים אותה בשקית אוטוקלאב ומעקרים אותה על ידי אוטוקלב. העבר בעדינות את הפתרון הווקטורי לצינור PCR מעוקר עם פיפטר P-20, תוך הימנעות מהיווצרות בועות.לאחר מכן, חברו את הצינורית כשהקצה המשופע פונה כלפי מטה למחזיק סטריאוטקסי בעל אוריינטציה אנכית. לאחר מכן חברו מזרק מנעול לואר של מיליליטר אחד לרכזת המחט ההיפודרמית של הצינורית. השקע את הקצה המשופע בפתרון הווקטורי.לאחר מכן, הפעל לחץ שלילי עדין עם מזרק של מיליליטר אחד כדי לטעון את התמיסה לתוך הצינורית תוך מעקב חזותי אחר המניסקוס בין התמיסה לאוויר. לאחר טעינת התמיסה הווקטורית, המשיכו בלחץ השלילי העדין עד שהתמיסה תגיע לרכזת המחט. לאחר מכן, הסר את המזרק של מיליליטר אחד והזריק באיטיות שמן מינרלי צבעוני לאורך הקיר הפנימי של רכזת המחט ההיפודרמית, תוך הקפדה להימנע מבועות אוויר.חבר את רכזת המחט ההיפודרמית לאחת משתי היציאות הפתוחות של פקק נעילה תלת-כיווני. לאחר מכן, סגור את היציאה. מלאו מזרק של מיליליטר אחד באוויר וחברו אותו לאחת משתי היציאות האחרות.לבסוף, סגור את היציאה הנותרת של stopcock כדי לחבר את המזרק לצינורית. הצמדת המזרק מכניסה את האוויר לתוך הפקק, והסטת האוויר ליציאה הפנויה מונעת ממנו לדחוף את התמיסה הווקטורית בחזרה במורד הצינורית. דחפו באיטיות את האוויר מהמזרק לתוך הצינורית.ברגע שהשמן הצבעוני מופיע בקצה המחט הבוטה בצינורות ה-PTFE, בדקו אם יש אוויר בין התמיסה לשמן הצבעוני. המשיכו להפעיל לחץ חיובי עד שתיראה טיפה של תמיסה וקטורית בקצה הצינורית המשופעת. לאחר מכן, סגרו את הפקק כדי למנוע מהווקטור לצאת מהצינורית על ידי כוח הכבידה.לאחר טעינת הפתרון הווקטורי, הצמידו את הצינורית למניפולטור הסטריאוטקסי. לאחר מכן, כדי לחבר את ה-stopcock למשאבת האוויר החשמלית, קח את צינור המשאבה מהעוזר הלא סטרילי. אחזו במחבר מנעול הלואר דרך דופן שרוול סטרילי.שחררו את צווארון השרוול, ואפשרו לו להתרחב לאורך הצינור בכוח הכבידה. לאחר מכן, הצמידו את הפקק והדביקו את השרוול בחוזקה סביב מחבר מנעול הלואר. לאחר מכן, בדוק את משאבת האוויר ואת הצינורית על ידי הגדרת משאבת האוויר ללחץ נמוך, לפני הפעלתה והגברת הלחץ עד שהשמן מתקדם דרך הצינורית וטיפה של תמיסה וקטורית נראית בקצה הצינורית.הדבק סרגל פלסטיק לצינורות PTFE כדי למדוד את תנועת המניסקוס במהלך ההזרקה. לאחר מכן, להניע את הצינורית למטה עם מניפולטור סטריאוטקסי עד קצה מגיע לפני השטח ולהקליט את העומק. סעו בצינורית לאתר העמוק ביותר שיש להזריק לאורך המסלול.המשטח יתנפח במגע. כדי למזער את המיקוד השגוי עקב דחיסת רקמות, יש להוריד את הצינורית ולצלם את אתר ההזרקה העמוק ביותר ב-500 מיקרומטר. לאחר מכן, נסוגו באיטיות.חלופות אחרות הן הנעת הצינורית באיטיות או נהיגה מהירה והמתנה בתחתית במשך דקה עד חמש דקות. לאחר מיקום הצינורית במקום ההזרקה העמוק ביותר, השתמש במשאבת האוויר החשמלית כדי להזריק 0.5 מיקרוליטר של התמיסה הווקטורית במשך 10 עד 30 שניות. אשר את זרימת ההזרקה על ידי מעקב אחר המניסקוס בין השמן הצבעוני לתמיסה הווקטורית בצינור PTFE.לאחר המתנה של דקה, החזירו את הצינורית למקום ההזרקה הבא לאורך המסלול. לאחר ההזרקה הסופית, השאירו את הצינורית במקומה למשך 10 דקות כדי למנוע שטף וקטורי. לאחר מכן, החזירו את הצינורית והשליכו אותה למיכל של ביוהאזרד שארפ.הזרקה של וקטורים AAV הנושאים את טרנסגן התעלה רודופסין II בקוליקולוס העליון השמאלי, ולאחר מכן גירוי עם אור כחול רציף ב 40 מילי-וואט, יצרה סדרה של פוטנציאלי פעולה עוקבים. פולסי אור של אלפית שנייה אחת לא הצליחו לעורר פוטנציאל פעולה ב-40 מילי-וואט, אך עוררו אותם באופן אמין ב-160 מילי-וואט. גירוי אופטי של הקוליקולוס העליון המופעל על ידי סקאדות מונחות חזותית הפחית את רווח הסקאדה בהדרגה.האיטיות של שינוי זה עולה בקנה אחד עם פלסטיות הנגרמת על ידי אופטיקה. העברת אור לייזר צהוב לוורמיס האוקולומוטור לאחר זריקות AAV בגרעין הרשתית tegmentae pontis דיכאה את פעילות סיבי הטחב, שהיא קלט למוח הקטן. דיכוי זה הפחית את פעילות תאי Purkinje, שהיא פלט של המוח הקטן.במהלך דיכוי אופטוגנטי, קצב הירי ירד והשתנה לדפוס נקבוביות מתפוצצות, מה שמרמז על כך שקלט סיבי הטחב המעוכבים לתאי Purkinje משפיע על שלב ההאטה של הסקאדה על ידי הנעת ההתפרצות השנייה. רודופסין ערוץ התבטא אך ורק בתאי Purkinje של vermis oculomotor. אספקה של פולסים קצרים של אור הגבירה את פעילות הספייק הפשוטה של תא Purkinje מבודד.פולס אור יחיד של 1.5 אלפיות השנייה עורר לעתים קרובות יותר מזינוקים פשוטים אחד. הפעלת ספייק פשוטה אופטוגנטית מתוזמנת להתרחש במהלך הסקאדה הגדילה את משרעת הסקאדה, ואישרה את התפקיד הדיסאינהיביטורי של תאי Purkinje על מחולל ההתפרצות האוקולומוטורית. בועות אוויר בצינורית יכולות לשבש את מניסקוס וקטור השמן, לסבך את קביעת נפחי ההזרקה ולמנוע שליטה עדינה בקצב הזרימה.מסיבות אלה, טעינת הפתרונות הווקטוריים ללא בועות אוויר היא קריטית להליך זה. שישה עד שמונה שבועות לאחר ההזרקה, מניפולציות אופטוגנטיות ניתן לבצע ואת רקמת המוח ניתן לעבד לניתוח היסטולוגי. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לבחון וקטורים רבים בבעלי חיים מעטים, אשר, בתורו, מקל על פיתוח ואימות של וקטורים חדשים.תחום עניין מסוים כיום הוא בפיתוח וקטורים שיתמקדו בסוגים עצביים ספציפיים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

בקנה מידה גדול הקלטה של ​​הנוירונים על ידי בדיקות מטלטלין סיליקון מתנהג מכרסמים

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

הליך השתלת מערכים מאורגנים של Microwires להקלטות יחידה אחת בAwake, מתנהגת בעלי חיים

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

אלקטרו הקלטה בו זמנית ומייקרו-הזרקות של סוכנים מעכבים במוח מכרסם

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic Entrainment התנודות תטא בהיפוקמפוס ב מתנהג עכברים

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Optogenetics זיהוי של סוג עצביים עם Optrode זכוכית בעכברים ער

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

הפקה, טיהור, ובקרת איכות על Adeno-הקשורים וקטורים מבוסס-וירוס

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

בזריקות Vivo גרם סטריאוטקאית לגירוי מגנטי של תשומות לטווח ארוך בפרוסות המוח של העכבר

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...