Name: injections of aav vectors for optogenetics in anesthetized and awake behaving non-human primate brain
Uploaded: 2021-08-04T14:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain at JoVE.com

Denne studien ble støttet av WaNPRC / ITHS P51OD010425 (JTT), National Institute of Health (NIH) tilskudd EY023277 (R01 for YK), EY030441 (R01 for GH), MH114126 (RF1 til JTT, Boaz Levi, Ed Lein), MH120095 (UG3 for JTT og GH), EY028902 (R01 for RS), og muliggjort av NIH-tilskudd OD010425 (P51 for WaNPRC) og University of Washington Royalty Research Fund A148416. Forfatterne vil takke Yasmine El-Shamayleh og Victoria Omstead for histologi, Refugio Martinez for viral vektorkloning og John Mich for hjelp med NHP hjernevevsbehandling.

Alle forsøkene ble utført i samsvar med Veileder for stell og bruk av forsøksdyr og oversteg minimumskravene anbefalt av Institute of Laboratory Animal Resources og Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International. Alle prosedyrer ble evaluert og godkjent av Animal Care and Use Committee ved University of Washington (UW IACUC-protokoll # 4167-01). Fem friske makaker (2 Macaca mulatta, 3 Macaca nemestrina; mann. 4-11 år) deltok i denne studien. Sterile instrumenter og teknikk ble brukt under alle kirurgiske prosedyrer.
1. Lage en kanyle (figur 1A)
<ol><li>Forberedelse av hver del<ol><li>Stump spissen av en hypodermisk nål (30 G, 13 mm lengde) med en diskkvern.</li>
		<li>Klipp et rør i rustfritt stål (30 G, innvendig diameter = 0,16 mm, utvendig diameter = 0,31 mm) til en lengde skreddersydd for dybden av målhjerneområdet (25 mm er godt egnet til å injisere hjernebarkens dorsale overflate). Med en diskkvern, skrå den ene enden av kuttrøret og glatt den andre. Deburr innsiden av røret med en broach.</li>
		<li>Skjær polytetrafluoretylen (PFTE) slangen (innvendig diameter = 0,23 mm ± 0,02 mm, vegg = 0,23 mm ± 0,02 mm, 1 mm tilsvarer 42 nL ± 7 nL væske) til en lengde som passer for mengden vektorløsning som skal lastes (1 μL vektorløsning opptar 24 mm rør). Flare begge ender av PTFE-røret ved innsetting av den stumpe hypodermiske nålen.</li>
	</ol></li>
	<li>Stikk den butte hypodermiske nålen ca. 5 mm inn i den ene enden av PTFE-tuben. Sett den skrå enden av røret i rustfritt stål ca. 5 mm inn i den andre enden (figur 1A).</li>
	<li>Utfør testing før injeksjon. Injiser filtrert vann gjennom kanylens hypodermiske nålnav. Bekreft at vann kommer ut av det skrå røret i rustfritt stål fra spissen, og at vann ikke lekker fra noen av kryssene.</li>
</ol>2. Injeksjonsprosedyre for bedøvede dyr
<ol><li>Kirurgi forberedelse<ol><li>Steriliser kirurgiske instrumenter og forsyninger ved hjelp av prosedyrene i materialtabellen.</li>
		<li>Ta om nødvendig MR caput for å målrette dype hjernestrukturer (figur 2A).</li>
		<li>Umiddelbart før operasjonen, sedere dyrene med ketamin (10-15 mg / kg) og administrer antibiotika (cefazolin) og smertestillende midler (buprenorfin og meloksikam) med vedvarende frigivelse intramuskulært. Lever deretter propofol via intravenøst (IV) kateter i saphenøse eller cefaliske vener.</li>
		<li>Intubere dyret og overfør det til isoflurangass. Bekreft riktig bedøvelse ved stabil hjertefrekvens, blodtrykk, respirasjonsfrekvens, avslappede skjelettmuskler og fravær av palpebral eller uttaksreflekser.</li>
		<li>Barber dyrets hode. Påfør kunstig tåresalve på hornhinnen for å forhindre tørking.</li>
	</ol></li>
	<li>Forberedelse av injeksjonsområdet<ol><li>Plasser dyrets hode i stereotaksisk ramme. Påfør kirurgisk skrubbeløsning på den barberte huden med gasbind svamper, bruk forsiktig trykk for å frigjøre rusk, og skyll med isopropylalkohol. Gjenta denne prosessen tre ganger. Dekk dyret med en steril fenestrated drape. Snitt huden og reflekter muskelen. Plasser manipulatoren på den stereotaksiske armen, plasser den for å sikte mot målhjerneområdet, og merk kraniotomiposisjonen på skallen med en sterilisert penn.</li>
		<li>Fjern stereotaksisk manipulator og utfør kraniotomien. Snitt duraen om ønskelig (f.eks. for å visualisere sulkale landemerker). Sett manipulatoren tilbake til stereotaksarmen.</li>
	</ol></li>
	<li>Lasting av vektorløsninger (figur 1C)<ol><li>Overfør vektorløsningen forsiktig til et sterilisert PCR-rør med en P20-pipetter, og unngå bobler.</li>
		<li>Fest en kanyle, med den skrå spissen vendt ned, til en vertikalt orientert stereotaksisk holder. Koble en 1 ml Luer-lock sprøyte til kanylens hypodermiske nålnav.</li>
		<li>Senk den skrå spissen av kanylen i vektorløsningen. MERK: Sprøyten skal allerede være festet; å feste den på dette tidspunktet ville introdusere bobler i vektorløsningen.</li>
		<li>Fyll oppløsningen i kanylen ved å påføre forsiktig undertrykk med 1 ml sprøyten. Spor menisken visuelt mellom løsningen og luften.</li>
		<li>Når vektoroppløsningen er lastet, fortsett det milde undertrykket til oppløsningen når nålnavet. Fjern 1 ml sprøyten og injiser den fargede mineraloljen inn i navet med sprøytespiss. MERK: Oljen skal injiseres langsomt langs innsiden av nålenavet for å danne en klar menisk med vektoroppløsningen og for å unngå luftbobler.</li>
		<li>Fest hypodermisk nålnav til en av de to åpne portene på en 3-veis Luer-lock stoppekran. MERK: Hvis du fester hypodermic nålen til den lukkede porten, vil det føre til uønsket lufttrykk bak oljen.</li>
		<li>Lukk porten som er koblet til sprøytenavet, fyll en 1 ml sprøyte med luft, og fest den til en av de to andre portene. Til slutt lukker du den gjenværende porten på stoppekranen for å koble sprøyten til kanylen.</li>
		<li>Skyv sakte luft inn i kanylen. Når den fargede oljen vises på spissen av den stumpe nålen i PTFE-slangen, må du kontrollere for luft mellom løsningen og den fargede oljen.</li>
		<li>Hvis det er luft, bruk undertrykk på sprøyten for å returnere den fargede oljen inn i nålnavet. Fjern boblen og påfør positivt trykk til en dråpe vektoroppløsning er synlig ved den skrå kanylespissen.</li>
		<li>Fjern 1 ml sprøyten for å frigjøre uønsket lufttrykk bak oljen og lukk stoppekranen for å forhindre at vektoren kommer ut av kanylen ved tyngdekraften.</li>
		<li>Teip en plastlinjal til PTFE-slangen for å måle meniskens bevegelse under injeksjon (figur 1B, D, F).</li>
	</ol></li>
	<li>Kanyleinnsetting i målhjerneområdet (figur 1B)<ol><li>Fest kanylen til stereotaksisk manipulator.</li>
		<li>Overfør pumpeslangen manuelt (som avsluttes i en Luer-lock-kontakt) fra den ikke-sterile assistenten til kirurgen. Kirurgen skal gripe Luer-lock-kontakten gjennom veggen på en steril hylse, feste en annen steril stoppekran til kontakten, tape hylsen tett rundt den og deretter slippe kragen på hylsen, slik at den kan strekke seg langs røret av tyngdekraften.</li>
		<li>Koble stoppekranen som er festet til kanyleslangen til stoppekranen som er festet til luftpumpen. Sett luftpumpen på lavt trykk, slå den på og øk trykket til oljen beveger seg gjennom kanylen og en dråpe vektorløsning er synlig på kanylespissen.</li>
		<li>Juster plastlinjalposisjonen på PTFE-slangen for å måle bevegelsen til menisken under injeksjonen.</li>
		<li>Kjør kanylen ned med stereotaksmanipulatoren og registrer dybden der spissen når på overflaten (dura eller pia mater).</li>
		<li>Kjør kanylen til det dypeste stedet som skal injiseres langs sporet. Overflaten vil dimple. Hvis du injiserer overflatebarken, bekreft visuelt at kanylen har penetrert overflaten, med et kirurgisk mikroskop eller forstørrende luper hvis tilgjengelig.</li>
		<li>For å minimere feilmålretting på grunn av vevskompresjon, kjør kanylen sakte inn (1 mm/min), raskt (0,5 mm/s) med 1-5 minutters ventetid i bunnen, eller overskrid det dypeste injeksjonsstedet med 500 μm og trekk deretter inn.</li>
	</ol></li>
	<li>Innsprøytning<ol><li>Injiser 0,5 μL av vektorløsningen med den elektriske luftpumpen over 10-30 s. Bekreft injeksjonsstrømmen ved å spore menisken mellom den fargede oljen og vektoroppløsningen i PTFE-røret.</li>
		<li>Vent i 1 min og trekk kanylen tilbake til neste injeksjonssted langs sporet.</li>
		<li>Etter den siste injeksjonen, la kanylen være på plass i 10 minutter for å unngå vektorutløp.</li>
		<li>Trekk inn kanylen og kast den i en biohazard sharps beholder.</li>
		<li>Injiser eventuelt en liten mengde (≤1 μL) fluorescerende mikroperler nær vektorinjeksjonsstedet for å gjøre det lettere å identifisere injeksjonsstedet post mortem.</li>
		<li>Gjenta denne prosedyren som ønsket for de andre vektorløsningene på andre steder (figur 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>Operasjon stenger<ol><li>Sutur dura, muskel og hud.</li>
		<li>Fjern apen fra stereotaksrammen og fjern alle skjermkablene.</li>
		<li>Fjern apen fra isofluranbedøvelse og ekstuber etter retur av svelgerefleksen.</li>
		<li>Gi postoperativ behandling (3-5 dager meloksikam og 7-10 dager med cephalexin). Overvåk dyret minst en gang hvert 10. minutt til det er i stand til å opprettholde en stabil oppreist sittestilling.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kirurgi og AAV-vektorinjeksjon for dyr som oppfører seg våkent (figur 1D)
MERK: En variant av teknikken kan brukes til å lage injeksjoner i hjernen til våkne, oppførende aper, som beskrevet nedenfor.
<ol><li>Samtidig injeksjon med opptak<ol><li>For å registrere elektrisk aktivitet på injeksjonsstedet, belegg utsiden av kanylen med epoksy (nederste ~15 mm) og polyimidslange (gjenværende lengde). Avslør metallet på spissen ved å skrape epoksyen fra den (Injectrode, figur 1F)2. Alternativt kan du sette kanylen og en separat ekstracellulær elektrode, side om side, inn i et dobbeltløpet styrerør (dobbeltløpet styrerør, figur 1E).</li>
	</ol></li>
	<li>Kanyleinnsetting i målhjerneområdet.<ol><li>Plasser apen i den eksperimentelle boden, begrens bevegelsen av hodet og rengjør det kraniemonterte opptakskammeret ved hjelp av standardteknikker.</li>
		<li>Fest et føringsrør til mikrostasjonen. Sett injeksjonskanylen inn i føringsrøret.</li>
		<li>Forskjøv kanylen til spissen stikker ut fra styrerøret.</li>
		<li>Koble stoppekranen til den elektriske luftpumpen. For å bekrefte riktig systemfunksjon, skyv en dråpe vektorløsning fra spissen ved hjelp av luftpumpen og bekreft bevegelsen av oljevektorløsningen menisk.</li>
		<li>Trekk kanylen ~5 mm inn i styrerøret for å beskytte den mot skade under rørinnsetting i hjernen. Sett føringsrøret inn i hjernen.</li>
		<li>Kjør kanylen til stedet som skal injiseres ved hjelp av microdrive. Identifiser målstedet ved enten elektrisk opptak (figur 2C) eller stimulering.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig1v2.jpg"> Figur 1: Oppsett av kirurgi og apparater . (A) Injeksjonskanyle. Hver del av kanylen er angitt. Innfelt nederst til høyre: forstørret bilde av kanylespiss, skalastang: 500 μm. (B) Operasjonsoppsett for bedøvede aper. Apen er plassert i en stereotaksisk ramme under en kirurgisk drapering. Ventilator (V), intravenøs linje (IV), blodtrykksmåler (BP) og oksygenmetningsmonitor (O2) er koblet til apen. Injeksjonskanylen settes inn i målområdet ved hjelp av en stereotaksisk mikromanipulator. Vektorløsningen injiseres av en elektrisk luftpumpe (nederst til venstre innfelt, brun) koblet til en luftkompressor (nederst til venstre innfelt, blå). En plastlinjal (toppinnfelt) teipes til PTFE-slangen for å måle bevegelsen av menisken mellom farget olje (toppinnfelt, rød) og vektoroppløsning (toppinnfelt, klar) under injeksjon. (C) Oppsett for å laste vektorløsning inn i kanylen. (D) En ape under en injeksjon av vektoroppløsning i en eksperimentell messe. Dyrets hode holdes på plass av tre stabiliseringsposter, og øyeposisjonen registreres av et skleralt søkespolesystem. Injeksjonskanylen holdes og kjøres til måldybden ved hjelp av en mikroelektrodeholder/driver. Injeksjonen styres ved å overvåke menisken mellom den fargede oljen og vektorløsningen gjennom et USB-kamera (innfelt bilde). (E) Dobbelt-fat føringsrørinjeksjon. En dobbel-fat guide tube holder en injeksjon kanyle og en mikro-elektrode (se innfelt). (F) Injectrode. Metallet på spissen av kanylen, eksponert ved å skrape epoksybelegget, gir elektrisk tilgang til nevroner (innfelt, skalastang: 500 μm). (G) Oppsett av laserstimulering. En dobbel-fat guide tube holder holderen / driveren holder både en optisk fiber og en mikro-elektrode (se innfelt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig1v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig2v2.jpg"> Figur 2: Diagram over injeksjonssteder for AAV. (A) Sagittal del av hjernen MR-bilde som viser injeksjonssteder i den primære motoriske cortex og primær visuell cortex av en Macaca nemestrina. (B) Utsikt fra dorsaloverflaten på den tilsvarende Atlas-platen som viser kanyleplassering i forhold til sentral sulcus (primærmotorisk cortex) og primær visuell cortex. (C) Enhetsregistrering ved injeksjon i superior colliculus. En enhet som ble isolert før injeksjon (høyre øverst) forsvant etter injeksjonen (høyre bunn). (D) Injeksjonsspor (hvite piler). Skala bar: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig2v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
4. Behandling av hjernevev for histologi
<ol><li>Vent 6-8 uker etter injeksjon for å maksimere transgenuttrykket. MERK: Den optimale varigheten er avhengig av den nøyaktige virale vektoren som ble brukt i eksperimentet.</li>
	<li>Behandle hjernen ved hjelp av konvensjonelle histologiske teknikker for å vurdere transduksjonseffektivitet og selektivitet 5,6,7.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kojima, Y., Robinson, F. R., Soetedjo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+fastigial+nucleus+influence+on+ipsilateral+abducens+activity+during+saccades.">Cerebellar fastigial nucleus influence on ipsilateral abducens activity during saccades.</a> Journal of Neurophysiology. 111 (8), 1553-1563 (2014).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+the+error+signal+in+the+superior+colliculus+impairs+saccade+motor+learning.">Elimination of the error signal in the superior colliculus impairs saccade motor learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8987-8995 (2018).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+GABA+agonist+and+antagonist+injections+into+the+oculomotor+vermis+on+horizontal+saccades.">Effects of GABA agonist and antagonist injections into the oculomotor vermis on horizontal saccades.</a> Brain Research. 1366, 93-100 (2010).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inactivation+and+disinhibition+of+the+oculomotor+vermis+on+saccade+adaptation.">Effect of inactivation and disinhibition of the oculomotor vermis on saccade adaptation.</a> Brain Research. 1401, 30-39 (2011).</li><li>De, A., El-Shamayleh, Y., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+reversible+neural+inactivation+in+macaque+cortex+by+optogenetic+stimulation+of+GABAergic+neurons.">Fast and reversible neural inactivation in macaque cortex by optogenetic stimulation of GABAergic neurons.</a> eLife. 9, 52658 (2020).</li><li>El-Shamayleh, Y., Kojima, Y., Soetedjo, R., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+optogenetic+control+of+Purkinje+cells+in+monkey+cerebellum.">Selective optogenetic control of Purkinje cells in monkey cerebellum.</a> Neuron. 95 (1), 51-62 (2017).</li><li>Mich, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+enhancer+elements+drive+subclass-selective+expression+from+mouse+to+primate+neocortex.">Functional enhancer elements drive subclass-selective expression from mouse to primate neocortex.</a> Cell Reports. 34 (13), 108754 (2021).</li><li>Graybuck, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+viruses+for+combinatorial+cell+subclass-specific+labeling.">Enhancer viruses for combinatorial cell subclass-specific labeling.</a> Neuron. (21), 00159 (2020).</li><li>Michel, J., Benninger, D., Dietz, V., van Hedel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacle+stepping+in+patients+with+Parkinson's+disease.+Complexity+does+influence+performance.">Obstacle stepping in patients with Parkinson's disease. Complexity does influence performance.</a> Journal of Neurology. 256 (3), 457-463 (2009).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li><li>Kaku, Y., Yoshida, K., Iwamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+signals+from+the+superior+colliculus+for+adaptation+of+saccadic+eye+movements+in+the+monkey.">Learning signals from the superior colliculus for adaptation of saccadic eye movements in the monkey.</a> Journal of Neuroscience. 29 (16), 5266-5275 (2009).</li><li>Soetedjo, R., Fuchs, A. F., Kojima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subthreshold+activation+of+the+superior+colliculus+drives+saccade+motor+learning.">Subthreshold activation of the superior colliculus drives saccade motor learning.</a> Journal of Neuroscience. 29 (48), 15213-15222 (2009).</li><li>Kleinbart, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+implant+system+for+multimodal+recording+and+manipulation+of+the+primate+brain.">A modular implant system for multimodal recording and manipulation of the primate brain.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. Annual International Conference. 2018, 3362-3365 (2018).</li><li>Arieli, A., Grinvald, A., Slovin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dural+substitute+for+long-term+imaging+of+cortical+activity+in+behaving+monkeys+and+its+clinical+implications.">Dural substitute for long-term imaging of cortical activity in behaving monkeys and its clinical implications.</a> Journal of Neuroscience Methods. 114 (2), 119-133 (2002).</li><li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Fredericks, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+mechanical+delivery+of+viral+vectors+into+rhesus+monkey+brain.">Methods for mechanical delivery of viral vectors into rhesus monkey brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108730 (2020).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+labeling+of+inhibitory+and+excitatory+cortical+neurons+by+endogenous+tropism+of+adeno-associated+virus+and+lentivirus+vectors.">Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors.</a> Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Fremskritt innen NHP optogenetikk har skapt et behov for nøyaktige, pålitelige intrakranielle injeksjonsmetoder. Fordelene med metoden beskrevet i denne rapporten er at den er billig, bruker steriliserbare og engangskomponenter, og har evnen til å målrette mot ulike hjerneområder av hvilken som helst dybde. Det tillater også kontroll av injeksjonshastighet og volum i kraft av hastigheten som luftventilen kan styres med. Lufttrykket kan økes midlertidig for å løsne en tresko og deretter reduseres raskt for å unngå påfølgende overinjeksjon som vil bli produsert ved vedvarende trykk. Engangskomponenter reduserer risikoen for krysskontaminering mellom injeksjonsstedene.
Kritiske trinn i denne injeksjonsprotokollen inkluderer å konstruere kanyler av høy kvalitet, laste dem uten å introdusere bobler og velge injeksjonssteder som ikke er for nær hverandre. Injeksjoner ≥1 cm fra hverandre transduserer vanligvis ikke-overlappende regioner, men denne heuristikken er avhengig av viral serotype, titer, promotor, volum, mål og metode for deteksjon. Ved å velge injeksjonssteder som ikke er direkte tilkoblet, unngår man potensielle forstyrrelser forårsaket av opsinhandel langs aksoner og tilbøyeligheten til noen AAV-serotyper for retrograd transduksjon.
Metoden kan brukes til å injisere NHP mens de er bedøvet og i en stereotaksisk ramme (figur 3) eller våken og hodefestet (figur 4). Førstnevnte har fordelen av å tillate injeksjoner å bli målrettet i stereotaksiske koordinater, og det tillater visuell bekreftelse av kanylepenetrasjon gjennom en akutt durotomi (incising dura i en våken ape, gjennom kronisk kraniotomi, øker risikoen for infeksjon). Sistnevnte tilnærming har fordelene ved å redusere antall overlevelsesoperasjoner og dermed stresset til dyret, være kompatibelt med elektrofysiologiske opptak under oppførsel, og bruke samme koordinatramme og instrumentering som brukes til å sette inn optiske fibre for eksperimenter etter injeksjon. Injeksjonsteknikken hos våkne aper kan forbedres ytterligere ved å lage injeksjoner gjennom kunstig dura13,14,15. Dette vil gi de ekstra fordelene med direkte visualisering av injeksjonssteder og vevsfluorescens som indikerer vellykket transduksjon.
Flere andre AAV-injeksjonsteknikker har blitt brukt i NHPs. Nylig ble en flerkanals injeksjonsenhet utviklet for å levere AAV-vektorer jevnt til store NHP-kortikale regioner16. Lignende resultater kan oppnås ved bruk av konveksjonsforbedret levering17,18. Disse metodene tar sikte på å maksimere transduksjonsspredningen, som er et viktig mål, men et som er forskjellig fra den romlige presisjonen vår metode tar sikte på å oppnå.
En annen alternativ metode er å injisere AAV-vektorer gjennom borosilikatrør som er skråstilt til en skarp spiss i den ene enden og festet til en Hamilton-sprøyte på den andre 5,6. Denne metoden har mye til felles med metoden beskrevet i denne artikkelen. Den virale vektoren holdes i en lengde av rør, rommet i slangen bak viruset er fylt med farget olje, og strømmen av vektoren overvåkes via bevegelsen av oljevektormenisken. Denne alternative teknikken krever mindre utstyr og forberedelse, men det krever å trekke olje inn i borosilikatrøret gjennom den skrå spissen ved negativt trykk og lasting av vektoren via samme rute senere. Dette resulterer uunngåelig i spor av olje levert til hjernen. I tillegg, etter vår erfaring, må borosilikatslangen ha en diameter på ~ 350 μm for å trenge inn i dura selv når den er skrå og forårsaker derfor større mekanisk skade enn den tynnere metallkanylen beskrevet i dette papiret (figur 2D). 30 G-rør ble brukt fordi den kritiske knekkebelastningen er høy nok til å formidle dura-penetrasjon til tross for en lengde på 1-10 cm, fordi den passer godt til PTFE-slangen, og fordi den sjelden blir blokkert. 33 G-slangen tetter og bøyes lettere og er vanskeligere å pare med PTFE-slangen. 36 G rør er utilstrekkelig stiv til å trenge inn i NHP dura mater.
En annen alternativ injeksjonsteknikk er å mate utgangen fra luftpumpen til en bakside av en vektorbelastet, trukket glasspipette19. Vektoren tvinges fra pipettespissen ved direkte, intermitterende lufttrykk fra pumpen, noe som eliminerer behovet for olje. I likhet med enkeltrørsmetoden som er forklart ovenfor, reduserer mangelen på materielle kryss mellom menisken og kanylespissen risikoen for lekkasjer. Imidlertid hindrer de skarpe taperene og delikate spissene av glasspipetter dem i å trenge inn i NHP-dura eller målrette mot dype strukturer.

Optogenetikk i ikke-menneskelige primater (NHPs) innebærer vanligvis injeksjon av viral vektor direkte inn i hjernen. En klasse vektorer som er godt egnet for denne applikasjonen er basert på adeno-assosiert virus (AAV). Disse vektorene består av et proteinkapsid som omgir et enkeltstrenget DNA-genom som igjen består av en promotor, et opsin-gen og eventuelt andre proteinkodende og genregulerende elementer. Fremskritt innen molekylær kloning har gjort det lettere å manipulere og kombinere disse komponentene for utvikling av nye vektorer. Følgelig er samlingen av AAV-vektorer som potensielt er nyttige for NHP optogenetikk stor og vokser raskt.
For tiden krever nytten av en AAV-vektor for NHP optogenetikk testing in vivo. Dette faktum er en betydelig barriere for fremgang. Dyr må brukes sparsomt, og testing av flere vektorer i et enkelt dyr krever at injeksjonssteder plasseres fornuftig i forhold til nevral arkitektur og godt separert i forhold til viral spredning. Nøyaktig histologisk vurdering krever at injeksjonene er romlig og volumetrisk nøyaktige. En injeksjonsteknikk som tidligere ble brukt til fokal levering av farmakologiske midler 1,2,3,4 ble tilpasset og forenklet for å gjøre slike injeksjoner. Denne injeksjonsteknikken er billig, bruker engangs, steriliserbare komponenter, kan brukes i bedøvede eller våkne oppførende aper, og kan brukes til å målrette mot ulike hjerneområder av hvilken som helst dybde. Følgende protokoll beskriver trinnvise prosedyrer for fremstilling av engangskomponentene og injeksjoner i NHP-hjernen. Fordelene og ulempene ved teknikken diskuteres.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment: Stereotaxic set</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allen keys</td>
			<td>BONDHUS</td>
			<td>10936</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula holder</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1770</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier (manipulator)</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1404</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier platform</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier stand</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1449</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye, ear, mouth bars</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic base</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1210</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: Cannula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Luer-lock syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannulas*</td>
			<td>(homemade - see below)</td>
			<td>NA</td>
			<td>steam (autoclave)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colored oil**</td>
			<td>(homemade - see below)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator (for tube rack)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-08057-10</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>23-404</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microbeads</td>
			<td>Lumafluor</td>
			<td>R170</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10003M</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>22-161</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>3060004</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rack</td>
			<td>homemade</td>
			<td>NA</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector solution</td>
			<td>(homemade)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: Electric air pump set</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric air pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot pedal</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>3260</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube cover</td>
			<td>EZ Drape</td>
			<td>A400-1000</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: General surgery tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>azlon</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>277-10-235</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double pronged tissue pick</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18067-11</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drapes</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJP3004</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>6-118</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>Q9R-5400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bits</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>277-82-87</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>NON26334</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic mosquito forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>7-2, 7-4</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light handles</td>
			<td>SKYTRON</td>
			<td>Stellar XL</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle hodler</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>8-2</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periosteal elevator</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>18-1968</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>17-4800</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>BAXTER</td>
			<td>2F7122</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>372610</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>5-12, 5-114</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senn retractors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>28065</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>Triumph Micro</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction</td>
			<td>medela</td>
			<td>200-4869</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction tip</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNDFR12S</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction tube</td>
			<td>COVIDEN</td>
			<td>8888301614</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gowns</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJP2002S</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical pens &#38; ruler</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJSM03</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>COVIDEN</td>
			<td>SL-635</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>6-114</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Towel clamps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>7-504</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood swabs</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>MDS202095</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: *cannulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle</td>
			<td>EXELINT INTERNATIONAL</td>
			<td>26437</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>K-TUBE</td>
			<td>K30R</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tube</td>
			<td>ZEUS</td>
			<td>216200</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: **colored oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Candle Dye Concentrate</td>
			<td>PremiumCraft</td>
			<td>Red/Pink</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Vi-Jon</td>
			<td>S0883</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injections of aav vectors for optogenetics in anesthetized and awake behaving non-human primate brain

Optogenetiske teknikker har revolusjonert nevrovitenskapelig forskning og er klar til å gjøre det samme for nevrologisk genterapi. Den kliniske bruken av optogenetikk krever imidlertid at sikkerhet og effekt påvises i dyremodeller, ideelt sett hos ikke-humane primater (NHPs), på grunn av deres nevrologiske likhet med mennesker. Antallet kandidatvektorer som er potensielt nyttige for nevrovitenskap og medisin er stort, og ingen høy gjennomstrømningsmidler for å teste disse vektorene eksisterer ennå. Dermed er det behov for teknikker for å lage flere romlig og volumetrisk nøyaktige injeksjoner av virale vektorer i NHP-hjernen som kan identifiseres entydig gjennom postmortem histologi. Beskrevet her er en slik metode. Injeksjonskanyler er konstruert av koblede polytetrafluoretylen og rustfritt stålrør. Disse kanylene er autoklaverbare, disponible og har lave minimale belastningsvolumer, noe som gjør dem ideelle for injeksjon av dyre, høykonsentrerte virale vektorløsninger. En inert, rødfarget mineralolje fyller dødrommet og danner en synlig menisk med vektorløsningen, noe som muliggjør øyeblikkelig og nøyaktig måling av injeksjonshastigheter og volumer. Oljen lastes inn i baksiden av kanylen, noe som reduserer risikoen for samtidig injeksjon med vektoren. Kanyler kan lastes på 10 minutter, og injeksjoner kan gjøres på 20 minutter. Denne prosedyren er godt egnet for injeksjoner i våkne eller bedøvede dyr. Når den brukes til å levere virale vektorer av høy kvalitet, kan denne prosedyren produsere robust uttrykk for optogenetiske proteiner, noe som muliggjør optisk kontroll av nevral aktivitet og oppførsel i NHPs.

For å demonstrere transgenuttrykk ved in vivo stereotaksisk injeksjon i NHP-hjernen ved hjelp av den kirurgiske injeksjonsmetoden beskrevet her, ble det valgt to vektorer som inneholdt forsterkere som driver uttrykk for det supergule fluorescerende protein-2 (SYFP2) i forskjellige nevrontyper 8,9. Virale vektorer ble pakket i PHP.eB kapsid10, renset ved iodixanol sentrifugering, og deretter konsentrert til høy titer (>1E13 virale genomer / ml) målt ved qPCR. Et volum på 0,5 μL ble injisert på hver av ti dybder langs ti spor gjennom cortex for et totalt injeksjonsvolum på 5 μL/spor. Figur 3A-C viser SYFP2-ekspresjon via anti-GFP-immunfarging 113 dager etter injeksjon av PVALB-subklassespesifikk AAV-vektor, CN2045, i den primære visuelle cortex av en voksen mannlig Macaca nemestrina. SYFP2-transgenet er robust påvist i mange ikke-pyramidale nevroner spredt over kortikal dybde, og de fleste SYFP2-uttrykkende nevroner var også immunreaktive for PVALB7. Figur 3D viser innfødt SYFP2-uttrykk i den primære motoriske cortex 64 dager etter injeksjon av L5 neuron subklassespesifikk AAV-vektor, CN2251. De SYFP2-merkede nevronene har alle klar pyramidemorfologi med somata begrenset til lag 5 og karakteristiske tykke apikale dendritter. Disse dataene viser entydig presis kontroll av transgenuttrykk i utvalgte populasjoner av neokortikale nevroner i NHP-hjernen ved stereotaksisk injeksjon av celletype rettet mot AAV-vektorer.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig3v2.jpg"> Figur 3: Eksempel på celletypespesifikt SYFP2-uttrykk mediert av AAV-vektorer injisert i NHP-hjernen . (A) Epifluorescensfotomikrografi av et fast snitt fra makake primær visuell cortex 113 dager etter injeksjon av en PVALB subklassespesifikk AAV-vektor. Vektstang: 1 mm.  (B,C) Bilde med høyere forstørrelse av det boksede området som vises i A. (B) Anti-GFP-signal. (C) Anti-PVALB signal. Skalastenger: 250 μm. (D) Epifluorescensfotomikrografi av innfødt SYFP2-fluorescens i en fast seksjon fra makake primærmotorisk cortex 64 dager etter injeksjon av en lag 5 ekstratelencefalisk subklassespesifikk AAV-vektor. Skala bar: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig3v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
For å demonstrere nytten av denne injeksjonsteknikken for nevrofysiologiske og atferdsmessige optogenetiske manipulasjoner ble det utført tre eksperimenter, hver på en annen ape (Macaca mulatta). I det første eksperimentet (figur 4A-D) ble AAV-vektorer som bærer channelrhodopsin-2-transgenet (AAV1-hSyn1-ChR2-mCherry) injisert i venstre superior colliculus (SC). Vektoren ble injisert hver 250 μm på 19 dybder i totalt 12 μL. I det andre eksperimentet (figur 4E-G) ble 3 μL AAV1-hSyn-ArchT-EYFP-løsning injisert i kjernen reticularis tegmenti pontis (NRTP). I det tredje eksperimentet (figur 4H-K) ble 24 μL AAV9-L7-ChR2-mCherry-løsning injisert i hjernebarken 6. Seks til åtte uker etter hver injeksjon ble en optisk fiber og en wolframelektrode satt inn i hjernen via et dobbeltløpet styrerør (figur 1G).
Figur 4B viser responsen til et SC-nevron på blått lys (450 nm). Kontinuerlig lys (1,2 s) ved 40 mW ga en rekke påfølgende aksjonspotensialer (figur 4B, øverst). Lyspulser av 1 ms varighet klarte ikke å fremkalle aksjonspotensialer ved 40 mW (figur 4B, midten), men fremkalte handlingspotensialer pålitelig ved 160 mW, det eneste andre effektnivået som ble testet, med en latens på 2,7 ± 0,6 ms (figur 4B, nederst). Et pulstog (160 mW, frekvens: 300 Hz, driftssyklus: 15%, varighet: 300 ms) fremkalte sakkader konsekvent med en gjennomsnittlig latens på 97 ± 32 ms, en gjennomsnittlig amplitude på 10,4 ° og gjennomsnittlig vinkel på 47 ° (oppover og til høyre; Figur 4C).
I samsvar med studier som modifiserte sakkadeforsterkning ved bruk av subthreshold elektrisk stimulering av SC11,12, reduserte optisk stimulering av SC etter 15°, 18° og 20° venstre- og nedadgående (225°) sakkader gradvis sakkadeforsterkning (figur 4D). Denne reduksjonen i gevinst krevde ~ 250 forsøk (grønne sirkler) for å gå tilbake til forhåndstilpasningsgevinsten (svarte sirkler), og bekreftet grunnlaget for langsiktig plastisitet.
I det andre forsøket (figur 4E) ble den mosegrodde fiberprojeksjonen fra NRTP til den oculomotoriske vermis (OMV) i hjernebarken (lobules VIc og VII) optisk undertrykt. Figur 4F viser fluorescerende merkede mosete fibre og rosetter i OMV (innfelt). Gult laserlys (589 nm) ble levert til OMV via optisk fiber, og en nærliggende wolframelektrode ble brukt til å registrere Purkinje-celleaktivitet. Figur 4G viser enkel piggaktivitet før (grå) og etter (oransje) optogenetisk inaktivering av NRTP-projeksjoner (figur 4G, øverst). Før inaktiveringen viste Purkinje-cellen et dobbelt burstmønster for 12° høyre sakkader (figur 4G, midtre, grå). Under inaktivering ble avfyringshastigheten redusert og endret til et burst-pause-mønster (figur 4G, midt, oransje). Sammenligning av disse to responsmønstrene antyder at den mosegrodde fiberinngangen til Purkinje-celler påvirker sakkaderetardasjonsfasen ved å drive den andre sprekken (figur 4G, midt, grønn). Variabiliteten av høyre sakkader ble redusert under optogenetisk inaktivering, i samsvar med ideen om at noe av trial-to-trial-variabiliteten i sakkademålinger skyldes variabilitet i signalene som bæres av mosefibre (figur 4G, nederst, oransje).
I det tredje forsøket (figur 4H) ble purkinjecellene i OMV stimulert optogenetisk (figur 4I). Et tog med korte lyspulser (1,5 ms pulser, 65 mW, 50 Hz) økte den enkle piggaktiviteten til en isolert Purkinje-celle (figur 4J, øverst). Individuelle 1,5 ms lyspulser fremkalte ofte >1 enkel pigg (figur 4J, nederst). Optogenetisk enkel piggaktivering, tidsbestemt til å forekomme under en sakkade (10 ms lyspuls, 60 mW), økt sakkadeamplitude (figur 4K), som bekrefter den disinhibitoriske rollen til Purkinje-celler på den oculomotoriske burstgeneratoren.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig4v2.jpg"> Figur 4: Sammendrag av tre optogenetiske eksperimenter utført på våkne aper. (AD) Eksperiment 1, pannevronal eksitasjon: viral injeksjon, laserstimulering og enhetsopptak ble utført i superior colliculus (A). (B) Representativ enhetsaktivitet fremkalt ved laserstimulering. (C), Horisontale (øverste) og vertikale (midtre) komponenter av øyebevegelser og rasterplott av enhetsaktivitet (nederst) fremkalt ved laserstimulering. (D) En representativ økt med sakkadetilpasning indusert av laserstimulering. Stimulering (100 0,5 ms laserpulser) ble gitt 80 ms etter hver sakkade (innfelt). Sakadeforsterkning (sakkadeamplitude/målamplitude) avtok gradvis på tvers av studiene. (E-G) Eksperiment 2, veispesifikk inhibering: en viral vektor ble injisert i kjernen reticularis tegmenti pontis, og laserstimulering og enhetsopptak ble utført i oculomotorisk vermis (E). (F) Histologisk del av den oculomotoriske vermis som viser merkede mosegrodde fibre (skala bar: 1 mm) og deres rosetter (innfelt, skala bar: 100 μm). (G) Purkinjecelleaktivitet (øverst: raster, midt: gjennomsnittlig avfyringshastighet) og baner av visuelt guidede sakkader (nederst) med og uten laserstimulering. Grå: laser av forsøk, oransje: laser på forsøk, grønn: forskjellen mellom grå og oransje. (H-K) Eksperiment 3, celletypespesifikk aktivering: viral injeksjon, laserstimulering og enhetsopptak ble utført i oculomotorisk vermis (H). (I) Histologisk del av den oculomotoriske vermis som viser merkede Purkinje-celler. Skalastang: 100 μm. (J) Enkel piggaktivitet av en Purkinje-celle fremkalt ved laserstimulering. Øverst: rasterplott fra 14 forsøk. Bunn: spenningsspor fra en enkelt representativ prøve. (K) Baner av visuelt guidede sakkader med og uten laserstimulering. En 10 ms lyspuls under sakkader økte sakkadeamplituder. Individuelle sakkadebaner (cyan) og deres gjennomsnitt (blå) på laser-on-studier. Individuelle sakkadebaner (lysegrå) og deres gjennomsnitt (mørkegrå) på laser-off forsøk. Lysbølgelengden var 450 nm i eksperiment 1 og 3 og 589 nm i eksperiment 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig4v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain at JoVE.com

Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain

Som for tiden implementert, krever optogenetikk i ikke-menneskelige primater injeksjon av virale vektorer i hjernen. En optimal injeksjonsmetode bør være pålitelig og, for mange applikasjoner, i stand til å målrette mot individuelle steder med vilkårlig dybde som lett og entydig identifiseres i postmortem histologi. En injeksjonsmetode med disse egenskapene presenteres.

Injeksjoner av AAV-vektorer for optogenetikk i bedøvet og våken oppfører seg ikke-menneskelig primathjerne

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of ...

Mange genterapeutiske og nevrovitenskapelige studier involverer injeksjoner av AAV-vektorer i hjernen til ikke-menneskelige primater. For at disse studiene skal lykkes, må injeksjonsteknikken være pålitelig. Vår injeksjonsteknikk er øyeblikkelig og nøyaktig.Denne prosedyren fungerer bra for injeksjon i bedøvede eller våkne dyr. Vår hjemmelagde kanyle er enkel å håndtere og rimelig. Demonstrere prosedyren vil være Kevin Mai, en ingeniørtekniker fra laboratoriet mitt.For å begynne, stump en 30-gauge 13 millimeter hypodermisk nålspiss med en skivekvern. Klipp deretter et stykke rustfritt stålrør til en lengde avhengig av dybden på målhjerneområdet. Med en skivekvern, skrå den ene enden av kuttrøret og glatt den andre.Deburr innsiden av røret med en broach. Deretter kutter du et stykke PTFE-rør til en lengde som passer for vektorløsningsvolumet som skal lastes. Bluss begge ender av røret ved å sette inn den stumpe hypodermiske nålen.Sett den avstumpede hypodermiske nålen omtrent fem millimeter inn i den ene enden av PTFE-røret. Sett deretter den skrå enden av rustfritt stålrør omtrent fem millimeter inn i den andre enden. Test kanylen ved å injisere filtrert vann gjennom hypodermisk nålnav.Bekreft at vannet kommer jevnt ut av den skrå rørspissen i rustfritt stål, og at vann ikke lekker fra noen av kryssene. Etter å ha testet kanylen, legg den i en autoklavpose og steriliser den ved autoklavering. Overfør vektoroppløsningen forsiktig til et sterilisert PCR-rør med en P-20-pipetter, og unngå bobledannelse.Deretter fester du kanylen med den skrå spissen vendt ned til en vertikalt orientert stereotaksisk holder. Koble deretter en en-milliliter luer lock sprøyte til hypodermisk nålnav på kanylen. Senk den skrå spissen ned i vektorløsningen.Påfør deretter forsiktig undertrykk med en milliliter sprøyte for å laste løsningen inn i kanylen mens du visuelt sporer menisken mellom løsningen og luften. Når vektoroppløsningen er lastet, fortsett det milde undertrykket til oppløsningen når nålnavet. Fjern deretter en milliliter sprøyte og injiser sakte farget mineralolje langs innsiden av hypodermisk nålnav, og pass på å unngå luftbobler.Fest hypodermisk nålnav til en av de to åpne portene på en treveis luer lock stopcock. Lukk deretter porten. Fyll en milliliter sprøyte med luft og fest den til en av de to andre portene.Til slutt lukker du den gjenværende porten på stoppekranen for å koble sprøyten til kanylen. Ved å feste sprøyten tvinges luft inn i stoppekranen, og shunting denne luften til den ledige porten forhindrer den i å skyve vektorløsningen ned i kanylen igjen. Skyv sakte luften fra sprøyten inn i kanylen.Når den fargede oljen vises på spissen av den stumpe nålen i PTFE-slangen, må du kontrollere for luft mellom løsningen og den fargede oljen. Fortsett å bruke positivt trykk til en dråpe vektoroppløsning er synlig ved den skrå kanylespissen. Lukk deretter stoppekranen for å forhindre at vektoren går ut av kanylen ved tyngdekraften.Når vektorløsningen er lastet, fest kanylen til stereotaksmanipulatoren. Deretter, for å koble stoppekranen til den elektriske luftpumpen, ta pumpeslangen fra den ikke-sterile assistenten. Ta tak i luerlåskontakten gjennom veggen på en steril hylse.Slipp kragen på hylsen, slik at den kan strekke seg langs røret ved tyngdekraften. Fest deretter stoppekranen og teip hylsen tett rundt luerlåskontakten. Test deretter luftpumpen og kanylen ved å sette luftpumpen på lavt trykk, før du slår den på og øker trykket til oljen går gjennom kanylen og en dråpe vektorløsning er synlig på kanylespissen.Teip en plastlinjal til PTFE-slangen for å måle bevegelsen av menisken under injeksjonen. Kjør deretter kanylen ned med den stereotaksiske manipulatoren til spissen når overflaten og registrer dybden. Kjør kanylen til det dypeste stedet som skal injiseres langs sporet.Overflaten vil dimple ved kontakt. For å minimere feilmålretting på grunn av vevskompresjon, kjør kanylen ned og overskride det dypeste injeksjonsstedet med 500 mikrometer. Deretter trekker du sakte tilbake.Andre alternativer er å kjøre kanylen sakte ned eller kjøre den raskt og vente nederst i ett til fem minutter. Når kanylen er plassert på det dypeste injeksjonsstedet, bruk den elektriske luftpumpen til å injisere 0,5 mikroliter vektoroppløsning over 10 til 30 sekunder. Bekreft injeksjonsstrømmen ved å spore menisken mellom den fargede oljen og vektoroppløsningen i PTFE-røret.Etter å ha ventet i ett minutt, trekk kanylen tilbake til neste injeksjonssted langs sporet. Etter den endelige injeksjonen, la kanylen være på plass i 10 minutter for å unngå vektorutløp. Trekk deretter kanylen tilbake og kast den i en biohazard sharps beholder.Injeksjon av AAV-vektorer som bærer kanalen rhodopsin II-transgen i venstre overlegne colliculus, etterfulgt av stimulering med kontinuerlig blått lys på 40 milliwatt, ga en rekke påfølgende aksjonspotensialer. Ett millisekund lyspulser klarte ikke å fremkalle handlingspotensialer ved 40 milliwatt, men fremkalte dem pålitelig ved 160 milliwatt. Optisk stimulering av superior colliculus utløst av visuelt styrte sakkader reduserte sakkadeforsterkningen gradvis.Langsomheten i denne endringen er i samsvar med optogenetisk indusert plastisitet. Levering av gult laserlys til oculomotorisk vermis etter AAV-injeksjoner i kjernen reticularis tegmentae pontis undertrykte mosefiberaktivitet, som er en inngang til cerebellum. Denne undertrykkelsen reduserte Purkinje-celleaktiviteten, som er en utgang av cerebellumet.Under optogenetisk undertrykkelse ble avfyringshastigheten redusert og endret til et utbruddsporemønster, noe som tyder på at den hemmede mosegrodige fiberinngangen til Purkinje-celler påvirker sakkaderetardasjonsfasen ved å drive den andre utbruddet. Kanal rhodopsin ble uttrykt utelukkende i Purkinje-celler av oculomotorisk vermis. Levering av korte lyspulser økte enkel piggaktivitet av en isolert Purkinje-celle.En enkelt lyspuls på 1,5 millisekunder fremkalte ofte mer enn en enkel pigg. Optogenetisk enkel piggaktivering tidsbestemt til å forekomme under sakkaden økte sakkadeamplituden, og bekreftet den disinhibitoriske rollen som Purkinje-celler på den oculomotoriske burstgeneratoren. Luftbobler i kanylen kan forstyrre oljevektorens menisk, komplisere bestemmelsen av injeksjonsvolumer og forhindre fin kontroll av strømningshastigheten.Av disse grunner er lasting av vektorløsninger uten luftbobler avgjørende for denne prosedyren. Seks til åtte uker etter injeksjonen kan optogenetiske manipulasjoner utføres og hjernevevet kan behandles for histologisk analyse. Denne teknikken gjør det mulig for forskere å teste mange vektorer i få dyr, noe som igjen letter utviklingen og valideringen av nye vektorer.Et bestemt område av nåværende interesse er i utviklingen av vektorer som vil målrette mot bestemte nevrontyper.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

Storskala opptak av nevroner med bevegelige Silicon Sonder i oppfører Gnagere

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

En prosedyre for Implanting Organiserte Arrays av Microwires for Single-unit Recordings i Awake, Oppfører Dyr

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Samtidig Elektro Opptak og Micro-injeksjoner av hemmende midler i gnager Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Utarbeidelse av ikke-menneskelige primater hjernevev for Pre-embedding Immunohistokjemi og elektronmikroskopi

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic Entrainment av hippocampus Theta svingninger i oppfører seg mus

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Optogenetics identifikasjon av en Neuronal med et Glass Optrode i våken mus

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produksjon, rensing og kvalitetskontroll for Adeno-assosiert Virus-basert vektorer

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

In vivo Intracerebrale Stereotaxic injeksjoner for Optogenetic stimulering av langtrekkende innganger i mus Brain skiver

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo avbildning av fullt aktivt hjernevev i våken sebrafisk larver og juveniler av hodeskalle og hudfjerning

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...