Name: injections of aav vectors for optogenetics in anesthetized and awake behaving non-human primate brain
Uploaded: 2021-08-04T14:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантами WaNPRC/ITHS P51OD010425 (JTT), Национальным институтом здравоохранения (NIH) EY023277 (R01 для YK), EY030441 (R01 для GH), MH114126 (RF1 для JTT, Boaz Levi, Ed Lein), MH120095 (UG3 для JTT и GH), EY028902 (R01 для RS) и стало возможным благодаря грантам NIH OD010425 (P51 для WaNPRC) и Исследовательскому фонду A148416 Вашингтонского университета. Авторы хотели бы поблагодарить Ясмин Эль-Шамайле и Викторию Омстед за гистологию, Рефуджио Мартинеса за клонирование вирусных векторов и Джона Мича за помощь в обработке тканей мозга NHP.

<ol>
	<li>Kojima, Y., Robinson, F. R., Soetedjo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+fastigial+nucleus+influence+on+ipsilateral+abducens+activity+during+saccades.">Cerebellar fastigial nucleus influence on ipsilateral abducens activity during saccades.</a> Journal of Neurophysiology. 111 (8), 1553-1563 (2014).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+the+error+signal+in+the+superior+colliculus+impairs+saccade+motor+learning.">Elimination of the error signal in the superior colliculus impairs saccade motor learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8987-8995 (2018).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+GABA+agonist+and+antagonist+injections+into+the+oculomotor+vermis+on+horizontal+saccades.">Effects of GABA agonist and antagonist injections into the oculomotor vermis on horizontal saccades.</a> Brain Research. 1366, 93-100 (2010).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inactivation+and+disinhibition+of+the+oculomotor+vermis+on+saccade+adaptation.">Effect of inactivation and disinhibition of the oculomotor vermis on saccade adaptation.</a> Brain Research. 1401, 30-39 (2011).</li><li>De, A., El-Shamayleh, Y., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+reversible+neural+inactivation+in+macaque+cortex+by+optogenetic+stimulation+of+GABAergic+neurons.">Fast and reversible neural inactivation in macaque cortex by optogenetic stimulation of GABAergic neurons.</a> eLife. 9, 52658 (2020).</li><li>El-Shamayleh, Y., Kojima, Y., Soetedjo, R., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+optogenetic+control+of+Purkinje+cells+in+monkey+cerebellum.">Selective optogenetic control of Purkinje cells in monkey cerebellum.</a> Neuron. 95 (1), 51-62 (2017).</li><li>Mich, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+enhancer+elements+drive+subclass-selective+expression+from+mouse+to+primate+neocortex.">Functional enhancer elements drive subclass-selective expression from mouse to primate neocortex.</a> Cell Reports. 34 (13), 108754 (2021).</li><li>Graybuck, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+viruses+for+combinatorial+cell+subclass-specific+labeling.">Enhancer viruses for combinatorial cell subclass-specific labeling.</a> Neuron. (21), 00159 (2020).</li><li>Michel, J., Benninger, D., Dietz, V., van Hedel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacle+stepping+in+patients+with+Parkinson's+disease.+Complexity+does+influence+performance.">Obstacle stepping in patients with Parkinson's disease. Complexity does influence performance.</a> Journal of Neurology. 256 (3), 457-463 (2009).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li><li>Kaku, Y., Yoshida, K., Iwamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+signals+from+the+superior+colliculus+for+adaptation+of+saccadic+eye+movements+in+the+monkey.">Learning signals from the superior colliculus for adaptation of saccadic eye movements in the monkey.</a> Journal of Neuroscience. 29 (16), 5266-5275 (2009).</li><li>Soetedjo, R., Fuchs, A. F., Kojima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subthreshold+activation+of+the+superior+colliculus+drives+saccade+motor+learning.">Subthreshold activation of the superior colliculus drives saccade motor learning.</a> Journal of Neuroscience. 29 (48), 15213-15222 (2009).</li><li>Kleinbart, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+implant+system+for+multimodal+recording+and+manipulation+of+the+primate+brain.">A modular implant system for multimodal recording and manipulation of the primate brain.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. Annual International Conference. 2018, 3362-3365 (2018).</li><li>Arieli, A., Grinvald, A., Slovin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dural+substitute+for+long-term+imaging+of+cortical+activity+in+behaving+monkeys+and+its+clinical+implications.">Dural substitute for long-term imaging of cortical activity in behaving monkeys and its clinical implications.</a> Journal of Neuroscience Methods. 114 (2), 119-133 (2002).</li><li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Fredericks, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+mechanical+delivery+of+viral+vectors+into+rhesus+monkey+brain.">Methods for mechanical delivery of viral vectors into rhesus monkey brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108730 (2020).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+labeling+of+inhibitory+and+excitatory+cortical+neurons+by+endogenous+tropism+of+adeno-associated+virus+and+lentivirus+vectors.">Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors.</a> Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Достижения в области оптогенетики NHP создали потребность в точных, надежных методах внутричерепной инъекции. Преимущества метода, описанного в этом отчете, заключаются в том, что он недорог, использует стерилизуемые и одноразовые компоненты и обладает способностью нацеливаться на различные области мозга любой глубины. Он также позволяет контролировать скорость и объем впрыска в силу скорости, с которой можно управлять воздушным клапаном. Давление воздуха может быть увеличено временно, чтобы выбить засор, а затем быстро уменьшено, чтобы избежать последующего перенапрыска, который будет вызван устойчивым давлением. Одноразовые компоненты снижают риск перекрестного загрязнения между местами инъекций.
Критические шаги в этом протоколе инъекции включают в себя строительство высококачественных канюль, загрузку их без введения пузырьков и выбор мест инъекции, которые не слишком близко друг к другу. Инъекции ≥1 см друг от друга обычно трансдуцируют непересекающиеся области, но эта эвристика зависит от вирусного серотипа, титра, промотора, объема, мишени и метода обнаружения. Выбор мест инъекций, которые не связаны напрямую, позволяет избежать потенциальных путаниц, возникающих в результате незаконного оборота опсина вдоль аксонов, и склонности некоторых серотипов AAV к ретроградной трансдукции.
Метод может быть использован для введения NHP во время анестезии и в стереотаксической рамке (рисунок 3) или предупредительной и фиксированной головой (рисунок 4). Преимущество первого заключается в том, что он позволяет направлять инъекции в стереотаксических координатах, и он позволяет визуально подтвердить проникновение канюли через острую дуротомию (разрезание твердой мозговой оболочки у бодрствующей обезьяны через хроническую трепанацию черепа повышает риск заражения). Последний подход имеет преимущества в уменьшении количества операций по выживанию и, следовательно, стресса для животного, будучи совместимым с электрофизиологическими записями во время поведения и используя ту же координатную рамку и приборы, используемые для вставки оптических волокон для экспериментов после инъекций. Техника инъекций у бодрствующих обезьян может быть дополнительно улучшена путем инъекций через искусственную твердую мозговую оболочку 13,14,15. Это даст дополнительные преимущества прямой визуализации мест инъекций и флуоресценции тканей, что указывает на успешную трансдукцию.
Несколько других методов инъекции AAV были использованы в NHP. Недавно было разработано многоканальное инъекционное устройство для равномерной доставки векторов AAV в большие корковые области NHP16. Аналогичные результаты можно получить, используя конвекционно-усиленную доставку17,18. Эти методы направлены на максимизацию распространения трансдукции, что является важной целью, но отличается от пространственной точности, которую стремится достичь наш метод.
Другим альтернативным методом является введение векторов AAV через боросиликатную трубку, которая скошена до острого наконечника на одном конце и прикреплена к шприцу Гамильтона на другом 5,6. Этот метод имеет много общего с методом, описанным в данной статье. Вирусный вектор удерживается в длине трубки, пространство в трубке за вирусом заполняется окрашенным маслом, а поток вектора контролируется через движение мениска масляного вектора. Этот альтернативный метод требует меньшего оборудования и подготовки, но он требует втягивания масла в боросиликатную трубку через скошенный наконечник под отрицательным давлением и последующей загрузки вектора по тому же маршруту. Это неизбежно приводит к следам масла, доставляемого в мозг. Кроме того, по нашему опыту, боросиликатная трубка должна иметь диаметр ~ 350 мкм, чтобы проникать в твердую мозговую оболочку даже при скошенном состоянии и, следовательно, наносить большие механические повреждения, чем более тонкая металлическая канюля, описанная в этой статье (рисунок 2D). Трубка 30 G была использована, потому что ее критическая нагрузка на изгиб достаточно высока, чтобы опосредовать проникновение твердой мозговой оболочки, несмотря на длину 1-10 см, потому что она плотно прилегает к трубке из PTFE и потому что она редко становится затрудненной. Трубка 33 G засоряется и изгибается легче и ее труднее соединить с трубкой из PTFE. Трубка 36 G недостаточно жесткая, чтобы проникнуть в тяжелую оболочку NHP.
Другой альтернативный метод впрыска заключается в сопряжении выхода воздушного насоса с задней частью векторной стеклянной пипетки19. Вектор выталкивается из наконечника пипетки прямым, прерывистым давлением воздуха из насоса, устраняя необходимость в масле. Подобно однотрубному методу, описанному выше, отсутствие каких-либо материальных соединений между мениском и кончиком канюли снижает риск утечек. Однако острый конус и тонкие кончики стеклянных пипеток не позволяют им проникать в твердую мозговую оболочку NHP или нацеливаться на глубокие структуры.

Оптогенетика у нечеловеческих приматов (NHP) обычно включает в себя инъекцию вирусного вектора непосредственно в мозг. Один класс векторов, который хорошо подходит для этого приложения, основан на аденоассоциированном вирусе (AAV). Эти векторы состоят из белкового капсида, окружающего одноцепочечный геном ДНК, который, в свою очередь, состоит из промотора, гена опсина и, необязательно, других белково-кодирующих и генно-регуляторных элементов. Достижения в области молекулярного клонирования облегчили манипулирование и сочетание этих компонентов для разработки новых векторов. Следовательно, коллекция векторов AAV, которая потенциально полезна для оптогенетики NHP, велика и быстро растет.
В настоящее время полезность вектора AAV для оптогенетики NHP требует тестирования in vivo. Этот факт является существенным препятствием на пути прогресса. Животные должны использоваться экономно, и тестирование нескольких векторов на одном животном требует, чтобы места инъекций были расположены разумно относительно нейронной архитектуры и хорошо разделены относительно распространения вируса. Точная гистологическая оценка требует, чтобы инъекции были пространственно и объемно точными. Метод инъекций, ранее использовавшийся для фокальной доставки фармакологических средств 1,2,3,4, был адаптирован и упрощен для совершения таких инъекций. Этот метод инъекции является недорогим, использует одноразовые, стерилизуемые компоненты, может использоваться у анестезируемых или бодрствующих обезьян и может быть использован для нацеливания на различные области мозга любой глубины. Следующий протокол описывает пошаговые процедуры изготовления одноразовых компонентов и инъекций в мозг NHP. Обсуждаются преимущества и недостатки методики.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment: Stereotaxic set</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allen keys</td>
			<td>BONDHUS</td>
			<td>10936</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula holder</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1770</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier (manipulator)</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1404</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier platform</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier stand</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1449</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye, ear, mouth bars</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic base</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1210</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: Cannula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Luer-lock syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannulas*</td>
			<td>(homemade - see below)</td>
			<td>NA</td>
			<td>steam (autoclave)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colored oil**</td>
			<td>(homemade - see below)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator (for tube rack)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-08057-10</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>23-404</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microbeads</td>
			<td>Lumafluor</td>
			<td>R170</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10003M</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>22-161</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>3060004</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rack</td>
			<td>homemade</td>
			<td>NA</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector solution</td>
			<td>(homemade)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: Electric air pump set</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric air pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot pedal</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>3260</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube cover</td>
			<td>EZ Drape</td>
			<td>A400-1000</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: General surgery tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>azlon</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>277-10-235</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double pronged tissue pick</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18067-11</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drapes</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJP3004</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>6-118</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>Q9R-5400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bits</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>277-82-87</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>NON26334</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic mosquito forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>7-2, 7-4</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light handles</td>
			<td>SKYTRON</td>
			<td>Stellar XL</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle hodler</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>8-2</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periosteal elevator</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>18-1968</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>17-4800</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>BAXTER</td>
			<td>2F7122</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>372610</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>5-12, 5-114</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senn retractors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>28065</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>Triumph Micro</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction</td>
			<td>medela</td>
			<td>200-4869</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction tip</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNDFR12S</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction tube</td>
			<td>COVIDEN</td>
			<td>8888301614</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gowns</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJP2002S</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical pens &#38; ruler</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJSM03</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>COVIDEN</td>
			<td>SL-635</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>6-114</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Towel clamps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>7-504</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood swabs</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>MDS202095</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: *cannulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle</td>
			<td>EXELINT INTERNATIONAL</td>
			<td>26437</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>K-TUBE</td>
			<td>K30R</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tube</td>
			<td>ZEUS</td>
			<td>216200</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: **colored oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Candle Dye Concentrate</td>
			<td>PremiumCraft</td>
			<td>Red/Pink</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Vi-Jon</td>
			<td>S0883</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injections of aav vectors for optogenetics in anesthetized and awake behaving non-human primate brain

Оптогенетические методы произвели революцию в исследованиях в области неврологии и готовы сделать то же самое для неврологической генной терапии. Клиническое использование оптогенетики, однако, требует, чтобы безопасность и эффективность были продемонстрированы на животных моделях, в идеале у нечеловеческих приматов (NHP), из-за их неврологического сходства с людьми. Количество векторов-кандидатов, которые потенциально полезны для нейробиологии и медицины, огромно, и никаких высокопроизводительных средств для проверки этих векторов пока не существует. Таким образом, существует потребность в методах, позволяющих сделать множественные пространственно и объемно точные инъекции вирусных векторов в мозг NHP, которые могут быть однозначно идентифицированы с помощью посмертной гистологии. Описанным здесь является такой способ. Инжекционные канюли изготовлены из связанных политетрафторэтиленовых и нержавеющих труб. Эти канюли являются автоклавируемыми, одноразовыми и имеют низкие минимальные объемы нагрузки, что делает их идеальными для инъекций дорогих, высококонцентрированных вирусных векторных растворов. Инертное минеральное масло, окрашенное в красный цвет, заполняет мертвое пространство и образует видимый мениск с векторным раствором, позволяя мгновенно и точно измерять скорость и объемы инъекций. Масло загружается в заднюю часть канюли, снижая риск совместной инъекции с вектором. Канюли могут быть загружены за 10 минут, а инъекции могут быть сделаны за 20 минут. Эта процедура хорошо подходит для инъекций бодрствующим или обезболенным животным. При использовании для доставки высококачественных вирусных векторов эта процедура может производить надежную экспрессию оптогенетических белков, что позволяет оптически контролировать нейронную активность и поведение в НХЛ.

Чтобы продемонстрировать трансгенную экспрессию путем стереотаксической инъекции in vivo в мозг NHP с использованием метода хирургической инъекции, описанного здесь, были выбраны два вектора, которые содержали энхансеры, управляющие экспрессией супержелтого флуоресцентного белка-2 (SYFP2) в различных нейронных типах 8,9. Вирусные векторы упаковывали в капсид PHP.eB10, очищали центрифугированием йодиксанола, а затем концентрировали до высокого титра (вирусные геномы >1E13 / мл), измеренного qPCR. Объем 0,5 мкл вводили на каждую из десяти глубин вдоль десяти дорожек через кору головного мозга для общего объема инъекции 5 мкл / дорожка. На рисунке 3A-C показана экспрессия SYFP2 через иммуноокрашивание анти-GFP через 113 дней после инъекции вектора AAV, специфичного для подкласса PVALB, CN2045, в первичную зрительную кору взрослого мужчины Macaca nemestrina. Трансген SYFP2 надежно обнаруживается в многочисленных непирамидных нейронах, разбросанных по глубине коры, и большинство нейронов, экспрессирующих SYFP2, также были иммунореактивными для PVALB7. На рисунке 3D показана нативная экспрессия SYFP2 в первичной моторной коре через 64 дня после инъекции вектора AAV, специфичного для подкласса нейронов L5, CN2251. Все нейроны, меченые SYFP2, имеют четкую пирамидальную морфологию с соматами, ограниченными слоем 5, и характерными толстыми апикальными дендритами. Эти данные однозначно демонстрируют точный контроль экспрессии трансгенов в отдельных популяциях неокортикальных нейронов в мозге NHP путем стереотаксической инъекции векторов AAV клеточного типа.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig3v2.jpg"> Рисунок 3: Пример специфической для типа клетки экспрессии SYFP2, опосредованной векторами AAV, введенными в мозг NHP. (A) Эпифлуоресцентная микрофотография фиксированного участка первичной зрительной коры макак через 113 дней после инъекции вектора AAV, специфичного для подкласса PVALB. Шкала: 1 мм.  (В,С) Изображение с более высоким увеличением области в коробке, отображаемое в A. (B) Сигнал анти-GFP. (C) Анти-PVALB сигнал. Шкала баров: 250 мкм. (D) Эпифлуоресцентная микрофотография нативной флуоресценции SYFP2 в фиксированном срезе первичной моторной коры макак через 64 дня после инъекции экстрателенцецефального подклассового вектора AAV слоя 5. Шкала: 500 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig3v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Чтобы продемонстрировать полезность этой инъекционной техники для нейрофизиологических и поведенческих оптогенетических манипуляций, были проведены три эксперимента, каждый на отдельной обезьяне (Macaca mulatta). В первом эксперименте (рисунок 4A-D) векторы AAV, несущие трансген каналродопсин-2 (AAV1-hSyn1-ChR2-mCherry), вводили в левый верхний колликулус (SC). Вектор вводили каждые 250 мкм на 19 глубинах в общей сложности 12 мкл. Во втором эксперименте (рисунок 4E-G) 3 мкл раствора AAV1-hSyn-ArchT-EYFP вводили в ядро reticularis tegmenti pontis (NRTP). В третьем эксперименте (рисунок 4H-K) 24 мкл раствора AAV9-L7-ChR2-mCherry вводили в кору мозжечка6. Через шесть-восемь недель после каждой инъекции оптическое волокно и вольфрамовый электрод вводились в мозг через двуствольную направляющую трубку (рисунок 1G).
На рисунке 4B показан ответ нейрона SC на синий свет (450 нм). Непрерывный свет (1,2 с) при 40 мВт создавал серию последовательных потенциалов действия (рисунок 4B, вверху). Световые импульсы длительностью 1 мс не смогли вызвать потенциалы действия при 40 мВт (рисунок 4B, середина), но надежно вызывали потенциалы действия при 160 мВт, единственном другом проверенном уровне мощности, с задержкой 2,7 ± 0,6 мс (рисунок 4B, внизу). Импульсная передача (160 мВт, частота: 300 Гц, рабочий цикл: 15%, длительность: 300 мс) вызывала саккады последовательно со средней задержкой 97 ± 32 мс, средней амплитудой 10,4° и средним углом 47° (вверх и вправо; Рисунок 4C).
В соответствии с исследованиями, которые модифицировали усиление саккады с использованием подпороговой электрической стимуляции SC 11,12, оптическая стимуляция SC после 15°, 18° и 20° влево и вниз (225°) саккад постепенно уменьшала усиление саккады (рисунок 4D). Это снижение прироста потребовало ~ 250 испытаний (зеленые круги), чтобы вернуться к предадаптационному усилению (черные круги), подтверждая его основу в долгосрочной пластичности.
Во втором эксперименте (рисунок 4E) проекция мшистого волокна от NRTP к глазодвигательной вермисе (OMV) коры мозжечка (дольки VIc и VII) была оптически подавлена. На рисунке 4F показаны флуоресцентно меченые мшистые волокна и розетки в OMV (вставка). Желтый лазерный свет (589 нм) доставлялся в OMV через оптическое волокно, а близлежащий вольфрамовый электрод использовался для записи активности клеток Purkinje. На рисунке 4G показана простая пиковая активность до (серый) и после (оранжевый) оптогенетической инактивации проекций NRTP (рисунок 4G, вверху). Перед инактивацией клетка Пуркинье демонстрировала двойной паттерн всплеска для 12° правых саккад (рисунок 4G, средний, серый). Во время инактивации скорость стрельбы уменьшалась и изменялась на паттерн очередей-пауз (рисунок 4G, средний, оранжевый). Сравнение этих двух паттернов ответа предполагает, что вход мшистого волокна в клетки Пуркинье влияет на фазу замедления саккады, приводя во второй всплеск (рисунок 4G, средний, зеленый). Изменчивость саккад вправо была снижена во время оптогенетической инактивации, что согласуется с идеей о том, что некоторая изменчивость метрик саккады от испытания к испытанию обусловлена изменчивостью сигналов, переносимых мшистыми волокнами (рисунок 4G, дно, оранжевый).
В третьем эксперименте (рисунок 4H) клетки Пуркинье OMV стимулировали оптогенетически (рисунок 4I). Шлейф коротких световых импульсов (импульсы 1,5 мс, 65 мВт, 50 Гц) увеличивал простую пиковую активность изолированной ячейки Пуркинье (рисунок 4J, вверху). Отдельные световые импульсы 1,5 мс часто вызывали простой всплеск >1 (рисунок 4J, внизу). Оптогенетическая простая активация шипов, приуроченная к саккаде (световой импульс 10 мс, 60 мВт), увеличение амплитуды саккады (рисунок 4K), подтверждающая дезингибиторную роль клеток Пуркинье в генераторе глазодвигательных всплесков.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig4v2.jpg"> Рисунок 4: Краткое изложение трех оптогенетических экспериментов, выполненных на бодрствующих обезьянах. (A-D) Эксперимент 1, паннейрональное возбуждение: вирусная инъекция, лазерная стимуляция и запись единиц были проведены в верхнем колликуле (A). (B) Репрезентативная активность единицы, вызванная лазерной стимуляцией. (C), Горизонтальный (вверху) и вертикальный (средний) компоненты движений глаз и растровый график единичной активности (внизу), вызванный лазерной стимуляцией. (D) Репрезентативный сеанс адаптации саккады, индуцированный лазерной стимуляцией. Стимуляция (100 0,5-мс лазерных импульсов) доставлялась через 80 мс после каждой саккады (вставки). Усиление саккады (амплитуда саккады / амплитуда мишени) постепенно уменьшалось на протяжении всех испытаний. (Е-Г) Эксперимент 2, путь-специфическое ингибирование: вирусный вектор вводили в ядро reticularis tegmenti pontis, а лазерную стимуляцию и регистрацию единиц проводили в глазодвигательном вермисе (E). (F) Гистологический участок глазодвигательного вермиса, показывающий меченые мшистые волокна (шкала: 1 мм) и их розетки (вставка, шкала: 100 мкм). (G) Активность клеток Пуркинье (вверху: растр, середина: средняя скорость стрельбы) и траектории визуально управляемых саккад (внизу) с лазерной стимуляцией и без нее. Серый: лазер вне испытаний, оранжевый: лазер на испытаниях, зеленый: разница между серым и оранжевым. (Н-К) Эксперимент 3, клеточная типоспецифическая активация: вирусная инъекция, лазерная стимуляция и запись единиц были проведены в глазодвигательной вермисе (H). (I) Гистологический участок глазодвигательного вермиса, показывающий меченые клетки Пуркинье. Шкала: 100 мкм. (J) Простая пиковая активность клетки Пуркинье, вызванная лазерной стимуляцией. Вверху: растровый график из 14 испытаний. Внизу: трассировка напряжения из одного репрезентативного испытания. (K) Траектории визуально управляемых саккад с лазерной стимуляцией и без нее. Световой импульс 10 мс во время саккад увеличивал амплитуды саккады. Индивидуальные траектории саккады (голубой) и их средние (синие) на лазерных испытаниях. Отдельные траектории саккад (светло-серый) и их средние (темно-серые) на испытаниях с лазерным выключением. Длина волны света составляла 450 нм в экспериментах 1 и 3 и составляла 589 нм в эксперименте 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig4v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain at JoVE.com

Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain

В настоящее время оптогенетика у нечеловеческих приматов требует инъекции вирусных векторов в мозг. Оптимальный метод инъекции должен быть надежным и, для многих применений, способным нацеливаться на отдельные участки произвольной глубины, которые легко и однозначно идентифицируются в посмертной гистологии. Представлен инъекционный метод с этими свойствами.

Инъекции векторов AAV для оптогенетики в обезболенном и бодрствующем мозге нечеловеческих приматов

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of ...

Многие геннотерапевтические и нейронаучные исследования включают инъекции векторов AAV в мозг нечеловеческих приматов. Чтобы эти исследования были успешными, техника инъекций должна быть надежной. Наша техника инъекций мгновенна и точна.Эта процедура хорошо работает для инъекций анестезированным или бодрствующим животным. Наша домашняя канюля проста в обращении и недорога. Продемонстрировать процедуру будет Кевин Май, инженер-техник из моей лаборатории.Для начала притупить 13-миллиметровый наконечник подкожной иглы 30-миллиметрового калибра дисковой шлифовальной машиной. Затем вырежьте кусок трубки из нержавеющей стали на длину в зависимости от глубины целевой области мозга. С помощью дисковой шлифовальной машины скосите один конец разрезанной трубки и сгладьте другой.Снимите заусенцы с внутренней части трубки с помощью протяжки. Затем нарежьте кусок трубки из PTFE на длину, соответствующую объему векторного раствора, подлежащего загрузке. Вспыхните оба конца трубки, вставив притупленную подкожную иглу.Вставьте притупленную подкожную иглу примерно на пять миллиметров в один конец трубки из PTFE. Затем вставьте скошенный конец трубки из нержавеющей стали примерно на пять миллиметров в другой конец. Проверьте канюлю, введя фильтрованную воду через подкожную иглу.Убедитесь, что вода выходит из скошенного наконечника трубки из нержавеющей стали плавно и что вода не вытекает ни из одного соединения. После тестирования канюли поместите ее в автоклавный мешок и стерилизуйте автоклавом. Аккуратно переложите векторный раствор в стерилизованную ПЦР-трубку с пипеткой Р-20, избегая образования пузырьков.Затем прикрепите канюлю скошенным наконечником, обращенным вниз, к вертикально ориентированному стереотаксическому держателю. Затем подключите одномиллилитровой шприц luer lock к подкожной игольчатой ступице канюли. Погрузите скошенный наконечник в векторный раствор.Затем нанесите мягкое отрицательное давление с помощью одномиллилитрового шприца, чтобы загрузить раствор в канюлю, визуально отслеживая мениск между раствором и воздухом. После того, как векторный раствор был загружен, продолжайте мягкое отрицательное давление до тех пор, пока раствор не достигнет ступицы иглы. Затем снимите шприц в один миллилитр и медленно введите цветное минеральное масло вдоль внутренней стенки подкожной иглы, заботясь о том, чтобы избежать пузырьков воздуха.Прикрепите ступичку иглы для подкожных инъекций к одному из двух открытых портов трехходового стопорного крана luer lock. Затем закройте порт. Наполните одномиллилитровой шприц воздухом и прикрепите его к любому из двух других портов.Наконец, закройте оставшийся порт запорного крана, чтобы соединить шприц с канюлей. Прикрепление шприца вдавливает воздух в запорный кран и шунтирование этого воздуха в незанятый порт не позволяет ему толкать векторный раствор обратно вниз по канюле. Медленно выталкивайте воздух из шприца в канюлю.Как только окрашенное масло появится на кончике тупой иглы в трубке из PTFE, проверьте наличие воздуха между раствором и цветным маслом. Продолжайте оказывать положительное давление до тех пор, пока капля векторного раствора не будет видна на кончике скошенной канюли. Затем закройте запорный кран, чтобы предотвратить выход вектора из канюли под действием силы тяжести.После загрузки векторного решения прикрепите канюлю к стереотаксическому манипулятору. Затем, чтобы подключить запорный кран к электрическому воздушному насосу, возьмите трубку насоса у нестерильного помощника. Прохватите разъем замка luer через стенку стерильной втулки.Опустите воротник рукава, позволив ему простираться вдоль трубки под действием силы тяжести. Затем прикрепите стопор и плотно заклейте втулку вокруг разъема замка luer. Затем протестируйте воздушный насос и канюлю, установив воздушный насос на низкое давление, прежде чем включить его и увеличить давление, пока масло не пройдет через канюлю и капля векторного раствора не будет видна на кончике канюли.Прикрепите пластиковую линейку к трубке из PTFE для измерения движения мениска во время инъекции. Затем опустите канюлю вниз с помощью стереотаксического манипулятора, пока наконечник не достигнет поверхности, и запишите глубину. Отведите канюлю к самому глубокому месту, которое будет введено вдоль дорожки.Поверхность будет ямочиться при контакте. Чтобы свести к минимуму неправильное нацеливание из-за сжатия тканей, опустите канюлю вниз и превысите самое глубокое место инъекции на 500 микрометров. Затем медленно втягивайтесь.Другими альтернативами являются медленное движение канюли вниз или быстрое вождение и ожидание внизу от одной до пяти минут. Как только канюля будет расположена в самом глубоком месте инъекции, используйте электрический воздушный насос для впрыска 0,5 микролитра векторного раствора в течение 10-30 секунд. Подтвердите поток инъекции, отслеживая мениск между цветным маслом и векторным раствором в трубке PTFE.Подождав одну минуту, втяните канюлю к следующему месту инъекции по дорожке. После последней инъекции оставьте канюлю на месте в течение 10 минут, чтобы избежать векторного эффлюкса. Затем втяните канюлю и выбросьте ее в контейнер с биологической опасностью.Инъекция векторов AAV, несущих трансген канала родопсина II в левый верхний колликулус, с последующей стимуляцией непрерывным синим светом в 40 милливатт, произвела серию последовательных потенциалов действия. Световые импульсы в одну миллисекунду не смогли вызвать потенциалы действия в 40 милливатт, но надежно вызывали их при 160 милливаттах. Оптическая стимуляция верхнего колликулуса, вызванная визуально управляемыми саккадами, постепенно уменьшала прирост саккады.Медленность этого изменения согласуется с оптогенетически индуцированной пластичностью. Доставка желтого лазерного света к глазодвигательному вермису после инъекций AAV в ядро reticularis tegmentae pontis подавляет активность мшистого волокна, которое является входом в мозжечок. Это подавление снижало активность клеток Пуркинье, которые являются выходом мозжечка.Во время оптогенетического подавления скорость срабатывания уменьшалась и изменялась на паттерн разрыва пор, предполагая, что ингибированное мшистое волокно, входящее в клетки Пуркинье, влияет на фазу замедления саккады, приводя во второй всплеск. Канальный родопсин экспрессировался исключительно в клетках Пуркинье глазодвигательного вермиса. Доставка коротких световых импульсов увеличивала простую пиковую активность изолированной клетки Пуркинье.Один световой импульс в 1,5 миллисекунды часто вызывал более одного простого всплеска. Оптогенетическая простая активация шипов, приуроченная к возникновению во время саккады, увеличивает амплитуду саккады, подтверждая дезингибиторную роль клеток Пуркинье в генераторе глазодвигательных всплесков. Пузырьки воздуха в канюле могут нарушить работу масляного вектора мениска, усложнить определение объемов впрыска и предотвратить тонкий контроль скорости потока.По этим причинам загрузка векторных растворов без пузырьков воздуха имеет решающее значение для этой процедуры. Через шесть-восемь недель после инъекции могут быть выполнены оптогенетические манипуляции и ткань мозга может быть обработана для гистологического анализа. Этот метод позволяет исследователям тестировать множество векторов на нескольких животных, что, в свою очередь, облегчает разработку и валидацию новых векторов.Особая область, представляющая интерес в настоящее время, заключается в разработке векторов, которые будут нацелены на конкретные типы нейронов.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Маркировка нейроны от грызунов и не-человека Предстоятель фрагменты мозга

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

Крупномасштабные Запись нейронов Зонды Движимое кремния в Поведение грызунов

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

Порядок Имплантация с организованной Массивы Микропровода с одноместным-единицы Recordings в Пробудитесь, Ведя Животные

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Одновременное Электрофизиологические Запись и Micro-инъекции агенты, ингибирующие в мозге грызунов

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Получение нечеловеческих приматов ткани головного мозга для предварительного внедрения иммуногистохимии и электронной микроскопии

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic ГРЭС гиппокампа тета колебаний в себя мышей

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Оптогенетика идентификация типа нейронов с Optrode стекла в бодрствовать мышей

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Производства, очистки и контроля качества для аденоассоциированный вирус основе векторов

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

В Vivo интрацеребральные стереотаксические инъекции для оптогенетической стимуляции дальнобойных входов в mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Визуализация in vivo полностью активной мозговой ткани у бодрствующих личинок рыбок данио и молоди путем удаления черепа и кожи

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...