Name: injections of aav vectors for optogenetics in anesthetized and awake behaving non-human primate brain
Uploaded: 2021-08-04T14:00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain at JoVE.com

Denna studie stöddes av WaNPRC/ITHS P51OD010425 (JTT), National Institute of Health (NIH) bidrag EY023277 (R01 för YK), EY030441 (R01 för GH), MH114126 (RF1 till JTT, Boaz Levi, Ed Lein), MH120095 (UG3 för JTT och GH), EY028902 (R01 för RS), och möjliggjordes av NIH-bidrag OD010425 (P51 för WaNPRC) och University of Washington Royalty Research Fund A148416. Författarna vill tacka Yasmine El-Shamayleh och Victoria Omstead för histologi, Refugio Martinez för viral vektorkloning och John Mich för hjälp med NHP-hjärnvävnadsbehandling.

Alla försök utfördes i enlighet med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och överskred de minimikrav som rekommenderas av Institute of Laboratory Animal Resources och Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International. Alla procedurer utvärderades och godkändes av djurvårds- och användningskommittén vid University of Washington (UW IACUC-protokoll #4167-01). Fem friska makaker (2 Macaca mulatta, 3 Macaca nemestrina; man. 4-11 år gammal) deltog i denna studie. Sterila instrument och teknik användes under alla kirurgiska ingrepp.
1. Göra en kanyl (figur 1A)
<ol><li>Förberedelse av varje del<ol><li>Trubba spetsen på en hypodermisk nål (30 G, 13 mm längd) med en skivkvarn.</li>
		<li>Skär ett rör av rostfritt stål (30 G, innerdiameter = 0,16 mm, ytterdiameter = 0,31 mm) till en längd som är skräddarsydd för djupet på målhjärnområdet (25 mm är väl lämpat för att injicera hjärnbarkens dorsala yta). Med en skivkvarn, fasa ena änden av det skurna röret och släta ut den andra. Avgrada rörets insida med en broach.</li>
		<li>Skär polytetrafluoretylenröret (PFTE) (innerdiameter = 0,23 mm ± 0,02 mm, vägg = 0,23 mm ± 0,02 mm, 1 mm motsvarar 42 nL ± 7 nL vätska) till en längd som är lämplig för mängden vektorlösning som ska laddas (1 μL vektorlösning upptar 24 mm slang). Blossa båda ändarna av PTFE-röret genom införande av den trubbiga hypodermiska nålen.</li>
	</ol></li>
	<li>För in den trubbiga hypodermiska nålen ca 5 mm i ena änden av PTFE-röret. För in den avfasade änden av röret av rostfritt stål ca 5 mm i den andra änden (figur 1A).</li>
	<li>Utför testning före injektion. Injicera filtrerat vatten genom kanylens hypodermiska nålnav. Bekräfta att vatten lämnar det avfasade röret i rostfritt stål från spetsen och att vatten inte läcker från någon av korsningarna.</li>
</ol>2. Injektionsförfarande för bedövade djur
<ol><li>Förberedelse av kirurgi<ol><li>Sterilisera kirurgiska instrument och förnödenheter med hjälp av procedurerna i materialförteckningen.</li>
		<li>Om det behövs, ta en huvud-MR för att rikta in sig på djupa hjärnstrukturer (figur 2A).</li>
		<li>Omedelbart före operationen, lugna djuren med ketamin (10-15 mg/kg) och administrera antibiotika (cefazolin) och smärtstillande medel (buprenorfin och meloxikam) med fördröjd frisättning intramuskulärt. Leverera sedan propofol via intravenös (IV) kateter i saphenösa eller cephalic vener.</li>
		<li>Intubera djuret och överför det till isoflurangas. Bekräfta korrekt bedövning genom stabil hjärtfrekvens, blodtryck, andningsfrekvens, avslappnade skelettmuskler och frånvaron av palpebrala eller abstinensreflexer.</li>
		<li>Raka djurets huvud. Applicera konstgjord tårsalva på hornhinnorna för att förhindra torkning.</li>
	</ol></li>
	<li>Förberedelse av injektionsområdet<ol><li>Placera djurets huvud i den stereotaxiska ramen. Applicera kirurgisk skrubblösning på den rakade huden med gasbindsvampar, applicera försiktigt tryck för att släppa ut skräp och skölj med isopropylalkohol. Upprepa denna process tre gånger. Täck djuret med en steril fenestrated draperi. Incise huden och reflektera muskeln. Placera manipulatorn på den stereotaxiska armen, placera den för att sikta mot målhjärnområdet och markera kraniotomipositionen på skallen med en steriliserad penna.</li>
		<li>Ta bort den stereotaxiska manipulatorn och utför kraniotomin. Snitta dura om så önskas (t.ex. för att visualisera sulkala landmärken). Sätt tillbaka manipulatorn i stereotaxarmen.</li>
	</ol></li>
	<li>Laddning av vektorlösning (figur 1C)<ol><li>Överför försiktigt vektorlösningen till ett steriliserat PCR-rör med en P20-pipettor och undvik bubblor.</li>
		<li>Fäst en kanyl, med den avfasade spetsen nedåt, på en vertikalt orienterad stereotaxisk hållare. Anslut en 1 ml Luer-lock-spruta till kanylens hypodermiska nålnav.</li>
		<li>Sänk ner kanylens avfasade spets i vektorlösningen. OBS: Sprutan ska redan vara fastsatt; Att fästa den vid denna tidpunkt skulle införa bubblor i vektorlösningen.</li>
		<li>Fyll lösningen i kanylen genom att applicera försiktigt undertryck med 1 ml spruta. Visuellt spåra menisken mellan lösningen och luften.</li>
		<li>När vektorlösningen har laddats, fortsätt det mjuka undertrycket tills lösningen når nålnavet. Ta bort sprutan på 1 ml och injicera den färgade mineraloljan i det hypodermiska nålnavet. OBS: Oljan ska injiceras långsamt längs nålnavets innervägg för att bilda en tydlig menisk med vektorlösningen och för att undvika luftbubblor.</li>
		<li>Fäst det hypodermiska nålnavet på en av de två öppna portarna på en 3-vägs Luer-lock-stoppkran. OBS: Att fästa den hypodermiska nålen på den stängda porten kommer att införa oönskat lufttryck bakom oljan.</li>
		<li>Stäng porten som är ansluten till det hypodermiska nålnavet, fyll en 1 ml spruta med luft och fäst den på någon av de andra två portarna. Slutligen stäng den återstående porten på stoppkranen för att ansluta sprutan till kanylen.</li>
		<li>Tryck långsamt in luft i kanylen. När den färgade oljan dyker upp vid spetsen av den trubbiga nålen i PTFE-slangen, kontrollera om det finns luft mellan lösningen och den färgade oljan.</li>
		<li>Om det finns luft, applicera undertryck på sprutan för att återföra den färgade oljan till nålnavet. Ta bort bubblan och applicera positivt tryck tills en droppe vektorlösning är synlig vid den fasade kanylspetsen.</li>
		<li>Ta bort sprutan på 1 ml för att frigöra oönskat lufttryck bakom oljan och stäng stoppkranen för att förhindra att vektorn lämnar kanylen genom tyngdkraften.</li>
		<li>Tejpa fast en plastlinjal på PTFE-slangen för att mäta meniskens rörelse under injektionen (figur 1B,D,F).</li>
	</ol></li>
	<li>Kanylinsättning i målhjärnområdet (figur 1B)<ol><li>Fäst kanylen på den stereotaxiska manipulatorn.</li>
		<li>Överför pumpslangen manuellt (som avslutas i en Luer-lock-kontakt) från den icke-sterila assistenten till kirurgen. Kirurgen ska ta tag i Luer-lock-kontakten genom väggen i en steril hylsa, fästa en andra steril stoppkran på kontakten, tejpa hylsan tätt runt den och sedan släppa kragen på hylsan, så att den kan sträcka sig längs röret genom tyngdkraften.</li>
		<li>Anslut stoppkranen som är fäst vid kanylslangen till stoppkranen som är fäst vid luftpumpen. Ställ luftpumpen på lågt tryck, slå på den och öka trycket tills oljan går framåt genom kanylen och en droppe vektorlösning är synlig vid kanylspetsen.</li>
		<li>Justera plastlinjalens läge på PTFE-slangen för att mäta meniskens rörelse under injektionen.</li>
		<li>Kör ner kanylen med stereotaxisk manipulator och registrera djupet vid vilket spetsen når vid ytan (dura eller pia mater).</li>
		<li>Kör kanylen till den djupaste platsen för att injiceras längs spåret. Ytan kommer att dimple. Om du injicerar ytbarken, bekräfta visuellt att kanylen har trängt in i ytan, med ett kirurgiskt mikroskop eller förstoringslober om sådana finns.</li>
		<li>För att minimera felinriktning på grund av vävnadskompression, kör in kanylen långsamt (1 mm/min), snabbt (0,5 mm/s) med en väntetid på 1-5 min längst ner, eller överskrid det djupaste injektionsstället med 500 μm och dra sedan tillbaka.</li>
	</ol></li>
	<li>Injektion<ol><li>Injicera 0,5 μL av vektorlösningen med den elektriska luftpumpen över 10-30 s. Bekräfta injektionsflödet genom att spåra menisken mellan den färgade oljan och vektorlösningen i PTFE-röret.</li>
		<li>Vänta i 1 min och dra tillbaka kanylen till nästa injektionsställe längs spåret.</li>
		<li>Efter den sista injektionen, låt kanylen vara på plats i 10 minuter för att undvika vektorefflux.</li>
		<li>Dra tillbaka kanylen och kasta den i en behållare för vassa föremål för biohazard.</li>
		<li>Injicera eventuellt en liten mängd (≤1 μl) fluorescerande mikrober nära vektorinjektionsstället för att underlätta identifiering av injektionsstället post mortem.</li>
		<li>Upprepa proceduren efter önskemål för de andra vektorlösningarna på andra platser (figur 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>Operationen avslutas<ol><li>Suturera dura, muskeln och huden.</li>
		<li>Ta bort apan från den stereotaxiska ramen och ta bort alla bildskärmskablar.</li>
		<li>Ta bort apan från isoflurananestesi och extubera efter att sväljningsreflexen har återvänt.</li>
		<li>Ge postkirurgisk behandling (3-5 dagar meloxikam och 7-10 dagar av cefalexin). Övervaka djuret minst en gång var 10: e minut tills det kan upprätthålla en stabil upprätt sittställning.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kirurgi och AAV-vektorinjektion för vakna djur som beter sig (figur 1D)
OBS: En variant av tekniken kan användas för att göra injektioner i hjärnan hos vakna, beteendenande apor, som beskrivs nedan.
<ol><li>Samtidig injektion med inspelning<ol><li>För att registrera elektrisk aktivitet på injektionsstället, täck utsidan av kanylen med epoxi (botten ~ 15 mm) och polyimidslang (återstående längd). Avslöja metallen vid spetsen genom att skrapa epoxin från den (injektrod, figur 1F)2. Alternativt kan du sätta in kanylen och en separat extracellulär elektrod, sida vid sida, i ett styrrör med dubbla pipor (styrrör med dubbla pipor, figur 1E).</li>
	</ol></li>
	<li>Kanylinsättning i målhjärnområdet.<ol><li>Placera apan i experimentbåset, begränsa huvudets rörelse och rengör den kraniummonterade inspelningskammaren med standardtekniker.</li>
		<li>Fäst ett styrrör på mikroenheten. Sätt i injektionskanylen i styrröret.</li>
		<li>Flytta fram kanylen tills spetsen sticker ut från styrröret.</li>
		<li>Anslut stoppkranen till den elektriska luftpumpen. För att bekräfta korrekt systemfunktion, tryck en droppe vektorlösning från spetsen med hjälp av luftpumpen och bekräfta rörelsen hos oljevektorlösningens menisk.</li>
		<li>Dra ut kanylen ~ 5 mm i styrröret för att skydda den från skador under rörets införande i hjärnan. Sätt in styrröret i hjärnan.</li>
		<li>Kör kanylen till platsen som ska injiceras med mikroenheten. Identifiera målplatsen genom antingen elektrisk inspelning (figur 2C) eller stimulering.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig1v2.jpg"> Figur 1: Inställning av kirurgi och apparatur . (A) Injektionskanyl. Varje del av kanylen anges. Infällt längst ner till höger: förstorad bild av kanylspets, skalstreck: 500 μm. (B) Operationsinställning för bedövade apor. Apan placeras i en stereotaxisk ram under ett kirurgiskt draperi. Ventilator (V), intravenös linje (IV), blodtrycksmätare (BP) och syremättnadsmonitor (O2) är anslutna till apan. Injektionskanilan sätts in i målområdet med hjälp av en stereotaxisk mikromanipulator. Vektorlösningen injiceras av en elektrisk luftpump (nedre vänstra insatsen, brun) kopplad till en luftkompressor (nedre vänstra insatsen, blå). En plastlinjal (övre insats) tejpas fast på PTFE-slangen för att mäta meniskens rörelse mellan färgad olja (övre insats, röd) och vektorlösning (övre infälld, klar) under injektionen. (C) Inställning för att ladda vektorlösning i kanylen. (D) En apa under en injektion av vektorlösning i en experimentbås. Djurets huvud hålls på plats av tre stabiliseringsstolpar, och ögonpositionen registreras av ett skleralt sökspolesystem. Insprutningskanulern hålls och drivs till måldjupet med hjälp av en mikroelektrodhållare/drivare. Injektionen styrs genom att övervaka menisken mellan den färgade oljan och vektorlösningen via en USB-kamera (infälld bild). (E) Inmatning av styrrör med dubbla pipor. En styrrörshållare/drivare med dubbla pipor rymmer en injektionskanyl och en mikroelektrod (se insats). (F) Injektrod. Metallen vid spetsen av kanylen, exponerad genom att skrapa epoxibeläggningen, ger elektrisk åtkomst till neuroner (insats, skalstång: 500 μm). (G) Inställning av laserstimulering. En styrrörshållare/drivare med dubbla pipor rymmer både en optisk fiber och en mikroelektrod (se insats). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig2v2.jpg"> Figur 2: Diagram över aav-injektionsställen . (A) Sagittal sektion av hjärnans MR-bild som visar injektionsställen i den primära motorcortexen och den primära visuella cortexen i en Macaca nemestrina. (B) Vy från dorsalytan på motsvarande Atlas-platta som visar kanylplacering i förhållande till central sulcus (primär motorcortex) och primär visuell cortex. (C) Enhetsregistrering med injestrod i den överlägsna colliculus. En enhet som isolerades före injektionen (höger ovansida) försvann efter injektionen (höger botten). (D) Insprutningsspår (vita pilar). Skalstreck: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig2v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
4. Hjärnvävnadsbehandling för histologi
<ol><li>Vänta 6-8 veckor efter injektionen för att maximera transgenuttrycket. OBS: Den optimala varaktigheten är beroende av den exakta virusvektorn som används i experimentet.</li>
	<li>Bearbeta hjärnan med hjälp av konventionella histologiska tekniker för att bedöma transduktionseffektivitet och selektivitet 5,6,7.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kojima, Y., Robinson, F. R., Soetedjo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+fastigial+nucleus+influence+on+ipsilateral+abducens+activity+during+saccades.">Cerebellar fastigial nucleus influence on ipsilateral abducens activity during saccades.</a> Journal of Neurophysiology. 111 (8), 1553-1563 (2014).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+the+error+signal+in+the+superior+colliculus+impairs+saccade+motor+learning.">Elimination of the error signal in the superior colliculus impairs saccade motor learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8987-8995 (2018).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+GABA+agonist+and+antagonist+injections+into+the+oculomotor+vermis+on+horizontal+saccades.">Effects of GABA agonist and antagonist injections into the oculomotor vermis on horizontal saccades.</a> Brain Research. 1366, 93-100 (2010).</li><li>Kojima, Y., Soetedjo, R., Fuchs, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+inactivation+and+disinhibition+of+the+oculomotor+vermis+on+saccade+adaptation.">Effect of inactivation and disinhibition of the oculomotor vermis on saccade adaptation.</a> Brain Research. 1401, 30-39 (2011).</li><li>De, A., El-Shamayleh, Y., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+reversible+neural+inactivation+in+macaque+cortex+by+optogenetic+stimulation+of+GABAergic+neurons.">Fast and reversible neural inactivation in macaque cortex by optogenetic stimulation of GABAergic neurons.</a> eLife. 9, 52658 (2020).</li><li>El-Shamayleh, Y., Kojima, Y., Soetedjo, R., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+optogenetic+control+of+Purkinje+cells+in+monkey+cerebellum.">Selective optogenetic control of Purkinje cells in monkey cerebellum.</a> Neuron. 95 (1), 51-62 (2017).</li><li>Mich, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+enhancer+elements+drive+subclass-selective+expression+from+mouse+to+primate+neocortex.">Functional enhancer elements drive subclass-selective expression from mouse to primate neocortex.</a> Cell Reports. 34 (13), 108754 (2021).</li><li>Graybuck, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+viruses+for+combinatorial+cell+subclass-specific+labeling.">Enhancer viruses for combinatorial cell subclass-specific labeling.</a> Neuron. (21), 00159 (2020).</li><li>Michel, J., Benninger, D., Dietz, V., van Hedel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacle+stepping+in+patients+with+Parkinson's+disease.+Complexity+does+influence+performance.">Obstacle stepping in patients with Parkinson's disease. Complexity does influence performance.</a> Journal of Neurology. 256 (3), 457-463 (2009).</li><li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems.">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li><li>Kaku, Y., Yoshida, K., Iwamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+signals+from+the+superior+colliculus+for+adaptation+of+saccadic+eye+movements+in+the+monkey.">Learning signals from the superior colliculus for adaptation of saccadic eye movements in the monkey.</a> Journal of Neuroscience. 29 (16), 5266-5275 (2009).</li><li>Soetedjo, R., Fuchs, A. F., Kojima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subthreshold+activation+of+the+superior+colliculus+drives+saccade+motor+learning.">Subthreshold activation of the superior colliculus drives saccade motor learning.</a> Journal of Neuroscience. 29 (48), 15213-15222 (2009).</li><li>Kleinbart, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+implant+system+for+multimodal+recording+and+manipulation+of+the+primate+brain.">A modular implant system for multimodal recording and manipulation of the primate brain.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. Annual International Conference. 2018, 3362-3365 (2018).</li><li>Arieli, A., Grinvald, A., Slovin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dural+substitute+for+long-term+imaging+of+cortical+activity+in+behaving+monkeys+and+its+clinical+implications.">Dural substitute for long-term imaging of cortical activity in behaving monkeys and its clinical implications.</a> Journal of Neuroscience Methods. 114 (2), 119-133 (2002).</li><li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Fredericks, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+mechanical+delivery+of+viral+vectors+into+rhesus+monkey+brain.">Methods for mechanical delivery of viral vectors into rhesus monkey brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108730 (2020).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+labeling+of+inhibitory+and+excitatory+cortical+neurons+by+endogenous+tropism+of+adeno-associated+virus+and+lentivirus+vectors.">Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors.</a> Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Framsteg inom NHP-optogenetik har skapat ett behov av exakta, pålitliga intrakraniella injektionsmetoder. Fördelarna med metoden som beskrivs i denna rapport är att den är billig, använder steriliserbara och engångskomponenter och har förmågan att rikta in sig på olika hjärnområden av vilket djup som helst. Det möjliggör också kontroll av insprutningshastighet och volym på grund av den hastighet med vilken luftventilen kan styras. Lufttrycket kan ökas tillfälligt för att lossa en igensättning och sedan minskas snabbt för att undvika efterföljande överinsprutning som skulle produceras av ihållande tryck. Engångskomponenter minskar risken för korskontaminering mellan injektionsställen.
Kritiska steg i detta injektionsprotokoll inkluderar att konstruera kanyler av hög kvalitet, ladda dem utan att införa bubblor och välja injektionsställen som inte ligger för nära varandra. Injektioner ≥1 cm från varandra transducerar vanligtvis icke-överlappande regioner, men denna heuristik är beroende av viral serotyp, titer, promotor, volym, mål och detektionsmetod. Genom att välja injektionsställen som inte är direkt anslutna undviks potentiella förvirringar som orsakas av opsinhandel längs axoner och benägenheten hos vissa AAV-serotyper för retrograd transduktion.
Metoden kan användas för att injicera NHP medan de är sövda och i en stereotaxisk ram (figur 3) eller varna och fixera huvudet (figur 4). Den förstnämnda har fördelen att injektioner kan riktas in i stereotaxiska koordinater, och det möjliggör visuell bekräftelse av kanylpenetration genom en akut durotomi (snittning av dura i en vaken apa, genom en kronisk kraniotomi, höjer risken för infektion). Det senare tillvägagångssättet har fördelarna med att minska antalet överlevnadsoperationer och därmed stressen för djuret, vara kompatibel med elektrofysiologiska inspelningar under beteende och använda samma koordinatram och instrumentering som används för att infoga optiska fibrer för experiment efter injektion. Injektionstekniken hos vakna apor kan förbättras ytterligare genom att göra injektioner genom artificiell dura13,14,15. Detta skulle ge de ytterligare fördelarna med direkt visualisering av injektionsställen och vävnadsfluorescensen som indikerar framgångsrik transduktion.
Flera andra AAV-injektionstekniker har använts i NHP: er. Nyligen utvecklades en flerkanalig injektionsanordning för att leverera AAV-vektorer enhetligt till stora NHP-kortikala regioner16. Liknande resultat kan erhållas med konvektionsförbättrad leverans17,18. Dessa metoder syftar till att maximera transduktionsspridningen, vilket är ett viktigt mål men ett som skiljer sig från den rumsliga precision som vår metod syftar till att uppnå.
En annan alternativ metod är att injicera AAV-vektorer genom borosilikatrör som är avfasade till en vass spets i ena änden och fäst vid en Hamilton-spruta på den andra 5,6. Denna metod har mycket gemensamt med den metod som beskrivs i detta dokument. Virusvektorn hålls i en slanglängd, utrymmet i slangen bakom viruset är fyllt med färgad olja och vektorflödet övervakas via oljevektormeniskens rörelse. Denna alternativa teknik kräver mindre utrustning och förberedelse, men det kräver att man drar olja i borosilikatslangen genom den avfasade spetsen genom undertryck och laddar vektorn via samma rutt därefter. Detta resulterar oundvikligen i spår av olja som levereras till hjärnan. Dessutom, enligt vår erfarenhet, måste borosilikatslangen ha en diameter på ~ 350 μm för att tränga igenom dura även när den är fasad och orsakar därför större mekanisk skada än den tunnare metallkanylen som beskrivs i detta papper (figur 2D). 30 G-slang användes eftersom dess kritiska spännbelastning är tillräckligt hög för att förmedla durapenetration trots en längd på 1-10 cm, eftersom den passar PTFE-slangen tätt och eftersom den sällan blir blockerad. 33 G slangar täpper till och böjer sig lättare och är svårare att para sig med PTFE-slangen. 36 G-slangen är inte tillräckligt styv för att tränga igenom NHP dura mater.
En annan alternativ injektionsteknik är att styra luftpumpens utgång till en baksida av en vektorbelastad pipett av draget glas19. Vektorn tvingas från pipettspetsen genom direkt, intermittent lufttryck från pumpen, vilket eliminerar behovet av olja. I likhet med enrörsmetoden som förklarats ovan minskar bristen på några materiella korsningar mellan menisken och kanylspetsen risken för läckage. Den skarpa avsmalningen och känsliga spetsarna på glaspipetter hindrar dem emellertid från att tränga in i NHP dura eller rikta in sig på djupa strukturer.

Optogenetik hos icke-mänskliga primater (NHP) involverar vanligtvis injektion av viral vektor direkt i hjärnan. En klass av vektorer som är väl lämpad för denna applikation är baserad på adenoassocierat virus (AAV). Dessa vektorer består av en proteinkapsid som omger ett enkelsträngat DNA-genom som i sin tur består av en promotor, en opsingen och eventuellt andra proteinkodande och genreglerande element. Framsteg inom molekylär kloning har underlättat manipuleringen och kombinationen av dessa komponenter för utveckling av nya vektorer. Följaktligen är samlingen av AAV-vektorer som är potentiellt användbar för NHP-optogenetik stor och växer snabbt.
För närvarande kräver nyttan av en AAV-vektor för NHP-optogenetik testning in vivo. Detta faktum är ett betydande hinder för framsteg. Djur måste användas sparsamt, och testning av flera vektorer i ett enda djur kräver att injektionsställena placeras omdömesgillt i förhållande till neural arkitektur och väl separerade i förhållande till viral spridning. Noggrann histologisk bedömning kräver att injektionerna är rumsligt och volymetriskt korrekta. En injektionsteknik som tidigare använts för fokal tillförsel av farmakologiska medel 1,2,3,4 anpassades och förenklades för att göra sådana injektioner. Denna injektionsteknik är billig, använder engångskomponenter, steriliserbara komponenter, kan användas i bedövade eller vakna bete apor och kan användas för att rikta in sig på olika hjärnområden på vilket djup som helst. Följande protokoll beskriver steg-för-steg-procedurer för att tillverka engångskomponenterna och göra injektioner i NHP-hjärnan. Fördelarna och nackdelarna med tekniken diskuteras.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment: Stereotaxic set</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allen keys</td>
			<td>BONDHUS</td>
			<td>10936</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula holder</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1770</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier (manipulator)</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1404</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier platform</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier stand</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1449</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye, ear, mouth bars</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic base</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1210</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: Cannula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Luer-lock syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannulas*</td>
			<td>(homemade - see below)</td>
			<td>NA</td>
			<td>steam (autoclave)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colored oil**</td>
			<td>(homemade - see below)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator (for tube rack)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-08057-10</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>23-404</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microbeads</td>
			<td>Lumafluor</td>
			<td>R170</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipetman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10003M</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>22-161</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>3060004</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rack</td>
			<td>homemade</td>
			<td>NA</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector solution</td>
			<td>(homemade)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: Electric air pump set</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric air pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PV830</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot pedal</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>3260</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube cover</td>
			<td>EZ Drape</td>
			<td>A400-1000</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: General surgery tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>azlon</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burrs</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>277-10-235</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double pronged tissue pick</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18067-11</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drapes</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJP3004</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>6-118</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>Q9R-5400</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bits</td>
			<td>STRYKER</td>
			<td>277-82-87</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>NON26334</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic mosquito forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>7-2, 7-4</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light handles</td>
			<td>SKYTRON</td>
			<td>Stellar XL</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle hodler</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>8-2</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periosteal elevator</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>18-1968</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rongeurs</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>17-4800</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>BAXTER</td>
			<td>2F7122</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>372610</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>5-12, 5-114</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senn retractors</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>28065</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>Triumph Micro</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction</td>
			<td>medela</td>
			<td>200-4869</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction tip</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNDFR12S</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction tube</td>
			<td>COVIDEN</td>
			<td>8888301614</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gowns</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJP2002S</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical pens &#38; ruler</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>DYNJSM03</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>COVIDEN</td>
			<td>SL-635</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>6-114</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Towel clamps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>7-504</td>
			<td>STERRAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood swabs</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>MDS202095</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: *cannulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle</td>
			<td>EXELINT INTERNATIONAL</td>
			<td>26437</td>
			<td>NA (sterilized package)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel tube</td>
			<td>K-TUBE</td>
			<td>K30R</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE tube</td>
			<td>ZEUS</td>
			<td>216200</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment: **colored oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Candle Dye Concentrate</td>
			<td>PremiumCraft</td>
			<td>Red/Pink</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Vi-Jon</td>
			<td>S0883</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

injections of aav vectors for optogenetics in anesthetized and awake behaving non-human primate brain

Optogenetiska tekniker har revolutionerat neurovetenskaplig forskning och är redo att göra detsamma för neurologisk genterapi. Den kliniska användningen av optogenetik kräver dock att säkerhet och effekt påvisas i djurmodeller, helst hos icke-mänskliga primater (NHP), på grund av deras neurologiska likhet med människor. Antalet kandidatvektorer som är potentiellt användbara för neurovetenskap och medicin är stort, och det finns ännu inga avancerade medel för att testa dessa vektorer. Således finns det ett behov av tekniker för att göra flera rumsligt och volymetriskt exakta injektioner av virala vektorer i NHP-hjärnan som kan identifieras entydigt genom postmortemhistologi. Häri beskrivs en sådan metod. Injektionskanyler är konstruerade av kopplade polytetrafluoretylen och rostfria rör. Dessa kanyler är autoklaverbara, engångsbruk och har låga minimala belastningsvolymer, vilket gör dem idealiska för injektion av dyra, högkoncentrerade virala vektorlösningar. En inert, rödfärgad mineralolja fyller det döda utrymmet och bildar en synlig menisk med vektorlösningen, vilket möjliggör omedelbar och noggrann mätning av injektionshastigheter och volymer. Oljan laddas in på baksidan av kanylen, vilket minskar risken för saminjektion med vektorn. Kanyler kan laddas på 10 minuter och injektioner kan göras på 20 min. Denna procedur är väl lämpad för injektioner i vakna eller bedövade djur. När den används för att leverera högkvalitativa virala vektorer kan denna procedur producera robust uttryck av optogenetiska proteiner, vilket möjliggör optisk kontroll av neural aktivitet och beteende i NHP.

För att demonstrera transgenuttryck genom stereotaxisk injektion in vivo i NHP-hjärnan med hjälp av den kirurgiska injektionsmetoden som beskrivs här, valdes två vektorer som innehöll förstärkare som driver uttryck av det supergula fluorescerande proteinet-2 (SYFP2) i distinkta neuronala typer 8,9. Virala vektorer förpackades i PHP.eB-kapsid10, renades genom jodoxanolcentrifugering och koncentrerades sedan till hög titer (>1E13 virala genom / ml) mätt med qPCR. En volym på 0,5 μL injicerades vid vart och ett av tio djup längs tio spår genom cortex för en total injektionsvolym på 5 μL/spår. Figur 3A-C visar SYFP2-uttryck via anti-GFP-immunfärgning 113 dagar efter injektion av PVALB-underklassspecifik AAV-vektor, CN2045, i den primära visuella cortexen hos en vuxen manlig Macaca-nemestrina. SYFP2-transgenen detekteras robust i många icke-pyramidala neuroner spridda över det kortikala djupet, och de flesta SYFP2-uttryckande neuroner var också immunreaktiva för PVALB7. Figur 3D visar inbyggt SYFP2-uttryck i den primära motorcortexen 64 dagar efter injektion av L5-neuronens underklassspecifika AAV-vektor, CN2251. De SYFP2-märkta neuronerna har alla tydlig pyramidal morfologi med somata begränsad till lager 5 och karakteristiska tjocka apikala dendriter. Dessa data visar entydigt exakt kontroll av transgenuttryck i utvalda populationer av neokortikala neuroner i NHP-hjärnan genom stereotaxisk injektion av celltyp riktad mot AAV-vektorer.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig3v2.jpg"> Figur 3: Exempel på celltypspecifikt SYFP2-uttryck medierat av AAV-vektorer injicerade i NHP-hjärnan . (A) Epifluorescensfotomikrograf av en fast sektion från makak primär visuell cortex 113 dagar efter injektion av en PVALB-underklassspecifik AAV-vektor. Skala stång: 1 mm.  (B,C) Bild med högre förstoring av det rutade området som visas i A. B) Anti-GFP-signal. C) Anti-PVALB-signal. Skalstänger: 250 μm. (D) Epifluorescensfotomikrograf av infödd SYFP2-fluorescens i en fast sektion från makak primärmotorisk cortex 64 dagar efter injektion av en skikt 5 extratelencefalisk underklassspecifik AAV-vektor. Skalstreck: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig3v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
För att demonstrera nyttan av denna injektionsteknik för neurofysiologiska och beteendemässiga optogenetiska manipuleringar utfördes tre experiment, var och en på en annan apa (Macaca mulatta). I det första experimentet (figur 4A-D) injicerades AAV-vektorer som bär channelrhodopsin-2-transgenen (AAV1-hSyn1-ChR2-mCherry) i vänster överlägsen colliculus (SC). Vektorn injicerades var 250:e μm vid 19 djup under totalt 12 μl. I det andra experimentet (figur 4E-G) injicerades 3 μL AAV1-hSyn-ArchT-EYFP-lösning i kärnan reticularis tegmenti pontis (NRTP). I det tredje experimentet (figur 4H-K) injicerades 24 μL AAV9-L7-ChR2-mCherry-lösning i cerebellär cortex 6. Sex till åtta veckor efter varje injektion sattes en optisk fiber och en volframelektrod in i hjärnan via ett dubbelpipigt styrrör (figur 1G).
Figur 4B visar svaret från en SC-neuron på blått ljus (450 nm). Kontinuerligt ljus (1,2 s) vid 40 mW gav en serie på varandra följande åtgärdspotentialer (figur 4B, överst). Ljuspulser med en varaktighet på 1 ms kunde inte framkalla åtgärdspotentialer vid 40 mW (figur 4B, mitten) men framkallade åtgärdspotentialer på ett tillförlitligt sätt vid 160 mW, den enda andra testade effektnivån, med en latens på 2,7 ± 0,6 ms (figur 4B, botten). Ett pulståg (160 mW, frekvens: 300 Hz, arbetscykel: 15 %, varaktighet: 300 ms) framkallade sackader konsekvent med en genomsnittlig latens på 97 ± 32 ms, en medelamplitud på 10,4 ° och en medelvinkel på 47 ° (uppåt och till höger; Figur 4C).
I överensstämmelse med studier som modifierade saccadeförstärkning med hjälp av subtröskel elektrisk stimulering av SC11,12, optisk stimulering av SC efter 15 °, 18 ° och 20 ° vänster och nedåt (225 °) sackader minskade gradvis saccadeförstärkningen (figur 4D). Denna minskning av vinsten krävde ~ 250 försök (gröna cirklar) för att återgå till förstärkningen före anpassningen (svarta cirklar), vilket bekräftar dess grund i långsiktig plasticitet.
I det andra experimentet (figur 4E) undertrycktes den mossiga fiberprojektionen från NRTP till den oculomotoriska vermis (OMV) i cerebellär cortex (lobules VIc och VII) optiskt. Figur 4F visar fluorescerande märkta mossiga fibrer och rosetter i OMV (infälld). Gult laserljus (589 nm) levererades till OMV via optisk fiber, och en närliggande volframelektrod användes för att registrera Purkinje-cellaktivitet. Figur 4G visar enkel spikaktivitet före (grå) och efter (orange) optogenetisk inaktivering av NRTP-projektioner (figur 4G, överst). Före inaktiveringen uppvisade Purkinje-cellen ett dubbelt burst-mönster för 12 ° höger sackader (figur 4G, mitten, grå). Under inaktiveringen minskade avfyrningshastigheten och ändrades till ett burst-pausmönster (figur 4G, mitten, orange). Att jämföra dessa två svarsmönster tyder på att den mossiga fiberinmatningen till Purkinje-celler påverkar saccade-retardationsfasen genom att driva den andra bursten (figur 4G, mitten, grön). Variationen av höger sackader minskade under optogenetisk inaktivering, i överensstämmelse med tanken att en del av variationen från prövning till försök i saccade-mätvärden beror på variation i signalerna som bärs av mossiga fibrer (Figur 4G, botten, orange).
I det tredje experimentet (figur 4H) stimulerades Purkinje-celler i OMV optogenetiskt (figur 4I). Ett tåg med korta ljuspulser (1,5 ms pulser, 65 mW, 50 Hz) ökade den enkla spikaktiviteten hos en isolerad Purkinje-cell (figur 4J, överst). Individuella 1,5 ms ljuspulser framkallade ofta >1 enkel spik (figur 4J, botten). Optogenetisk enkel spikaktivering, tidsbestämd att inträffa under en saccade (10 ms ljuspuls, 60 mW), ökad saccadeamplitud (figur 4K), vilket bekräftar Purkinje-cellernas disinhibitoriska roll på den oculomotoriska burstgeneratorn.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig4v2.jpg"> Figur 4: Sammanfattning av tre optogenetiska experiment utförda på vakna apor. (A-D) Experiment 1, pan-neuronal excitation: viral injektion, laserstimulering och enhetsregistrering utfördes i överlägsen colliculus (A). (B) Representativ enhetsaktivitet som framkallas av laserstimulering. (C), Horisontella (övre) och vertikala (mellersta) komponenter i ögonrörelser och rasterdiagram över enhetsaktivitet (botten) framkallade av laserstimulering. (D) En representativ session av saccadeanpassning inducerad av laserstimulering. Stimulering (100 0,5 ms laserpulser) levererades 80 ms efter varje saccade (infälld). Saccade-förstärkning (saccadeamplitud / målamplitud) minskade gradvis över försök. (E-G) Experiment 2, vägspecifik hämning: en viral vektor injicerades i kärnan reticularis tegmenti pontis, och laserstimulering och enhetsinspelning utfördes i oculomotorisk vermis (E). (F) Histologisk del av den oculomotoriska vermis som visar märkta mossiga fibrer (skalstreck: 1 mm) och deras rosetter (insats, skalstång: 100 μm). (G) Purkinje-cellaktivitet (överst: raster, mitten: genomsnittlig avfyrningshastighet) och banor för visuellt styrda sackader (botten) med och utan laserstimulering. Grå: laser av försök, orange: laser på försök, grön: skillnad mellan grått och orange. (H-K) Experiment 3, celltypspecifik aktivering: viral injektion, laserstimulering och enhetsinspelning utfördes i oculomotor vermis (H). (I) Histologisk del av den oculomotoriska vermis som visar märkta Purkinje-celler. Skalstång: 100 μm. (J) Enkel spikaktivitet hos en Purkinje-cell framkallad av laserstimulering. Överst: rasterplott från 14 försök. Botten: spänningsspår från en enda representativ prövning. (K) Banor för visuellt styrda sackader med och utan laserstimulering. En 10 ms ljuspuls under sackader ökade saccadeamplituderna. Individuella saccadebanor (cyan) och deras genomsnitt (blå) på laser-on-försök. Individuella saccadebanor (ljusgrå) och deras genomsnittliga (mörkgrå) på laser-off-försök. Ljusvåglängden var 450 nm i experiment 1 och 3 och var 589 nm i experiment 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig4v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain at JoVE.com

Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain

Som för närvarande implementeras kräver optogenetik hos icke-mänskliga primater injektion av virala vektorer i hjärnan. En optimal injektionsmetod bör vara tillförlitlig och, för många tillämpningar, kunna rikta in sig på enskilda platser med godtyckligt djup som lätt och entydigt identifieras i postmortemhistologi. En injektionsmetod med dessa egenskaper presenteras.

Injektioner av AAV-vektorer för optogenetik i bedövad och vaken beteende icke-mänsklig primathjärna

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of ...

Många genterapeutiska och neurovetenskapliga studier involverar injektioner av AAV-vektorer i hjärnan hos icke-mänskliga primater. För att dessa studier ska lyckas måste injektionstekniken vara tillförlitlig. Vår injektionsteknik är omedelbar och exakt.Denna procedur fungerar bra för injektion i bedövade eller vakna djur. Vår hemlagade kanyl är lätt att hantera och billig. Demonstrerar proceduren kommer att vara Kevin Mai, en ingenjörstekniker från mitt laboratorium.För att börja, trubba en 30-gauge 13-millimeter hypodermisk nålspets med en skivkvarn. Skär sedan en bit rostfritt stålrör till en längd beroende på djupet på målhjärnområdet. Med en skivkvarn, fasa ena änden av det skurna röret och släta ut den andra.Avgrada rörets insida med en broach. Skär sedan en bit PTFE-slang till en längd som är lämplig för vektorlösningsvolymen som ska laddas. Blossa båda ändarna av röret genom att sätta in den trubbiga hypodermiska nålen.För in den trubbiga hypodermiska nålen cirka fem millimeter i ena änden av PTFE-röret. Sätt sedan in den avfasade änden av röret i rostfritt stål cirka fem millimeter i den andra änden. Testa kanylen genom att injicera filtrerat vatten genom det hypodermiska nålnavet.Kontrollera att vatten släpper ut den avfasade rörspetsen i rostfritt stål smidigt och att vatten inte läcker från någon av korsningarna. Efter att ha testat kanylen, placera den i en autoklavpåse och sterilisera den genom autoklavering. Överför försiktigt vektorlösningen till ett steriliserat PCR-rör med en P-20-pipetter, undvik bubbelbildning.Fäst sedan kanylen med den avfasade spetsen nedåt mot en vertikalt orienterad stereotaxisk hållare. Anslut sedan en en-milliliters luerlåsspruta till kanylens hypodermiska nålnav. Sänk ner den avfasade spetsen i vektorlösningen.Applicera sedan försiktigt undertryck med en millilitersspruta för att ladda lösningen i kanylen medan du visuellt spårar menisken mellan lösningen och luften. När vektorlösningen har laddats, fortsätt det mjuka undertrycket tills lösningen når nålnavet. Ta sedan bort sprutan på en milliliter och injicera långsamt färgad mineralolja längs insidan av det hypodermiska nålnavet, var noga med att undvika luftbubblor.Fäst det hypodermiska nålnavet på en av de två öppna portarna på en trevägs luerlåsstopp. Stäng sedan porten. Fyll en en-milliliter spruta med luft och fäst den på någon av de andra två portarna.Slutligen stäng den återstående porten på stoppkranen för att ansluta sprutan till kanylen. Att fästa sprutan tvingar luft in i stoppkranen, och växling av denna luft till den lediga porten förhindrar att den trycker tillbaka vektorlösningen ner i kanylen. Tryck långsamt in luften från sprutan i kanylen.När den färgade oljan dyker upp vid spetsen av den trubbiga nålen i PTFE-slangen, kontrollera om det finns luft mellan lösningen och den färgade oljan. Fortsätt applicera positivt tryck tills en droppe vektorlösning är synlig vid den avfasade kanylspetsen. Stäng sedan stoppkranen för att förhindra att vektorn lämnar kanylen genom tyngdkraften.När vektorlösningen har laddats, fäst kanylen på stereotaxisk manipulator. För att ansluta stoppkranen till den elektriska luftpumpen, ta sedan pumpslangen från den icke-sterila assistenten. Ta tag i luerlåskontakten genom väggen i en steril hylsa.Släpp kragen på hylsan, så att den kan sträcka sig längs röret genom tyngdkraften. Fäst sedan stoppkranen och tejpa fast hylsan ordentligt runt luerlåskontakten. Testa sedan luftpumpen och kanylen genom att ställa in luftpumpen på lågt tryck innan du slår på den och ökar trycket tills oljan går framåt genom kanylen och en droppe vektorlösning är synlig vid kanylspetsen.Tejpa en plastlinjal på PTFE-slangen för att mäta meniskens rörelse under injektionen. Kör sedan kanylen ner med stereotaxisk manipulator tills spetsen når ytan och registrerar djupet. Kör kanylen till den djupaste platsen för att injiceras längs spåret.Ytan kommer att dimple vid kontakt. För att minimera felinriktning på grund av vävnadskompression, kör kanylen ner och överskrid det djupaste injektionsstället med 500 mikrometer. Dra sedan tillbaka långsamt.Andra alternativ är att köra ner kanylen långsamt eller köra den snabbt och vänta längst ner i en till fem minuter. När kanylen är placerad på det djupaste injektionsstället, använd den elektriska luftpumpen för att injicera 0,5 mikroliter av vektorlösningen under 10 till 30 sekunder. Bekräfta injektionsflödet genom att spåra menisken mellan den färgade oljan och vektorlösningen i PTFE-röret.Efter att ha väntat i en minut, dra tillbaka kanylen till nästa injektionsställe längs spåret. Efter den sista injektionen, lämna kanylen på plats i 10 minuter för att undvika vektorefflux. Dra sedan tillbaka kanylen och kasta den i en behållare för vassa föremål för biohazard.Injektion av AAV-vektorer som bär kanalen rhodopsin II-transgen i vänster överlägsen colliculus, följt av stimulering med kontinuerligt blått ljus vid 40 milliwatt, producerade en serie på varandra följande åtgärdspotentialer. En millisekunds ljuspulser misslyckades med att framkalla åtgärdspotentialer vid 40 milliwatt, men framkallade dem på ett tillförlitligt sätt vid 160 milliwatt. Optisk stimulering av den överlägsna colliculus som utlöses av visuellt styrda sackader minskade saccadeförstärkningen gradvis.Långsamheten i denna förändring överensstämmer med optogenetiskt inducerad plasticitet. Leverans av gult laserljus till oculomotorisk vermis efter AAV-injektioner i kärnan reticularis tegmentae pontis undertryckt mossig fiberaktivitet, vilket är en ingång till lillhjärnan. Denna undertryckning minskade Purkinje-cellaktiviteten, som är en utgång från lillhjärnan.Under optogenetisk undertryckning minskade avfyrningshastigheten och ändrades till ett burstpormönster, vilket tyder på att den hämmade mossiga fiberinmatningen till Purkinje-celler påverkar saccade-retardationsfasen genom att driva den andra bursten. Kanalrhodopsin uttrycktes uteslutande i Purkinje-celler i den oculomotoriska vermisen. Leverans av korta ljuspulser ökade enkel spikaktivitet hos en isolerad Purkinje-cell.En enda ljuspuls på 1,5 millisekunder framkallade ofta mer än en enkel spik. Optogenetisk enkel spikaktivering som är tidsbestämd att inträffa under saccade ökade saccadeamplituden, vilket bekräftar Purkinje-cellernas disinhibitoriska roll på den oculomotoriska burstgeneratorn. Luftbubblor i kanylen kan störa oljevektormenisken, komplicera bestämningen av injektionsvolymer och förhindra fin kontroll av flödeshastigheten.Av dessa skäl är det viktigt att ladda vektorlösningarna utan luftbubblor för denna procedur. Sex till åtta veckor efter injektionen kan optogenetiska manipulationer utföras och hjärnvävnaden kan bearbetas för histologisk analys. Denna teknik gör det möjligt för forskare att testa många vektorer hos få djur, vilket i sin tur underlättar utveckling och validering av nya vektorer.Ett särskilt område av aktuellt intresse är utvecklingen av vektorer som kommer att rikta in sig på specifika neuronala typer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Märkning av nervceller från gnagare och icke-mänskliga primater Slices Brain

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

Storskalig inspelning av nervceller av lös Silicon sönder i Agera Gnagare

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

Ett förfarande för Implantation Organized arrayer av Microwires för Single-enhet Inspelningar i Awake, uppför djur

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Samtidig elektrofysiologiska inspelning och Micro-injektioner av hämmande medel i Gnagare Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Framställning av icke-mänskliga primater hjärnvävnad för Pre-inbäddning Immunohistokemi och elektronmikroskopi

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic ångan av hippocampus Theta svängningar i beter sig möss

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Optogenetik identifiering av en Neuronal typ med ett glas Optrode i vaken möss

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Produktion, rening och kvalitetskontroll för Adeno-associerade Virus-baserat vektorer

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

In vivo intracerebral Stereotaxic injektioner för Optogenetisk stimulering av långväga ingångar i mushjärna skivor

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

In vivo imaging av fullt aktiv hjärnvävnad i vakna zebrafisk larver och ungdomar genom skalle och hudborttagning

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...