Name: capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction
Uploaded: 2022-06-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

نشكر هيذر موغان وليندا م. كاليكين على التحرير الدقيق لهذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل NIH NHLBI (منحة 5R01HL136647-04).

1. القلم الماص Headspace (HSP) واعتبارات تحليل العينات
ملاحظة: تم اختيار HSP الذي يحتوي على مادة Tenax TA الماصة لالتقاط مجموعة واسعة من المواد المتطايرة. لدى Tenax تقارب أقل للمياه مقارنة بالمواد الماصة الأخرى ، مما يمكنه من احتجاز المزيد من المركبات العضوية المتطايرة من عينات الرطوبة الع...

<ol>
	<li>Van Berkel, J. J. B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+profile+of+volatile+organic+compounds+in+breath+discriminates+COPD+patients+from+controls.">A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls.</a> Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).</li><li>Nakhleh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+active+pulmonary+tuberculosis+with+a+breath+test+using+nanomaterial-based+sensors.">Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors.</a> European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).</li><li>Lim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+diagnosis+of+tuberculosis+from+analysis+of+urine+volatile+organic+compounds.">Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds.</a> ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).</li><li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+volatile+organic+compounds+in+exhaled+breath+to+diagnose+ventilator-associated+pneumonia.">Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia.</a> Scientific Reports. 5, 17179 (2015).</li><li>Paff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+molecular+profiles+in+the+assessment+of+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia.">Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).</li><li>Robroeks, C. M. H. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+volatile+organic+compounds+in+cystic+fibrosis+patients+and+controls.">Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls.</a> Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).</li><li>Neerincx, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+cyanide+emission+in+the+lung+by+Staphylococcus+aureus.">Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus.</a> European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).</li><li>Goeminne, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+sputum+headspace+through+volatile+organic+compound+analysis.">Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis.</a> Respiratory Research. 13, 87 (2012).</li><li>Joensen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+breath+analysis+using+Electronic+Nose+in+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia+patients+with+chronic+pulmonary+infections.">Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections.</a> PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).</li><li>Nasir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+molecules+from+bronchoalveolar+lavage+fluid+can+'rule-in'+Pseudomonas+aeruginosa+and+'rule-out'+Staphylococcus+aureus+infections+in+cystic+fibrosis+patients.">Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients.</a> Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).</li><li>Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatiles+in+inter-specific+bacterial+interactions.">Volatiles in inter-specific bacterial interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).</li><li>Gao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+polymicrobial+metabolism+in+cystic+fibrosis+airways:+Pseudomonas+aeruginosa+metabolism+and+physiology+are+influenced+by+Rothia+mucilaginosa-derived+metabolites.">Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites.</a> mSphere. 3 (2), 00151 (2018).</li><li>Schoenheimer, R., Rittenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deuterium+as+an+indicator+in+the+study+of+intermediary+metabolism.">Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism.</a> Science. 82 (2120), 156-157 (1935).</li><li>Neubauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+application+of+microbial+lipids+as+tracers+of+Staphylococcus+aureus+growth+rates+in+cystic+fibrosis+sputum.">Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).</li><li>Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GC-MS+analysis+of+ethanol+and+other+volatile+compounds+in+micro-volume+blood+samples-quantifying+neonatal+exposure.">GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).</li><li>Mayor, A. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+sample+preparation+for+direct+SPME-GC-MS+analysis+of+murine+and+human+faecal+volatile+organic+compounds+for+metabolomic+studies.">Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies.</a> Journal of Analytical &amp; Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).</li><li>Camarasu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headspace+SPME+method+development+for+the+analysis+of+volatile+polar+residual+solvents+by+GC-MS.">Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).</li><li>Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer+volatile+analysis:+optimization+of+HS/SPME+coupled+to+GC/MS/FID.">Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID.</a> Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).</li><li>Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+headspace+solid-phase+dynamic+extraction+to+analyse+the+volatile+fraction+of+food+matrices.">Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices.</a> Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).</li><li>Trujillo-Rodr&#237;guez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuum-assisted+sorbent+extraction:+An+analytical+methodology+for+the+determination+of+ultraviolet+filters+in+environmental+samples.">Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples.</a> Talanta. 208, 120390 (2020).</li><li>Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+algae-based+treatment+of+herbicide-contaminated+groundwater.">Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater.</a> Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).</li><li>Psillakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+vacuum:+an+emerging+experimental+parameter+to+consider+during+headspace+microextraction+sampling.">The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+daily+dynamics+of+cystic+fibrosis+airway+microbiota+during+clinical+stability+and+at+exacerbation.">The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation.</a> Microbiome. 3, 12 (2015).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Mahboubi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-based+and+culture-independent+bacteriologic+analysis+of+cystic+fibrosis+respiratory+specimens.">Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).</li></ol>

لتحديد الإنتاج المتطاير في الثقافات المخبرية والعينات المرتبطة بالإنسان ، تم إجراء تحليل متطاير للمزارع الأحادية والمشتركة من P. aeruginosa و S. aureus و A. baumanii وفحص النظائر المستقرة لعينات بيولوجية مختلفة. في تحليل الثقافات الأحادية والمشتركة ، تم الكشف عن المواد المتطايرة عن طريق...

المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) لديها وعد كبير للكشف عن البكتيريا وتحديد هويتها لأنها تنبعث من جميع الكائنات الحية ، والميكروبات المختلفة لها توقيعات فريدة من نوعها المركبات العضوية المتطايرة. تم استخدام الجزيئات المتطايرة كقياس غير جراحي للكشف عن التهابات الجهاز التنفسي المختلفة بما في ذلك مرض الانسداد الرئوي المزمن1 ، والسل2 في البول3 ، والالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الصناعي4 ، بالإضافة إلى التمييز بين الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي (CF) من مواضيع التحكم الصحية 5,6. حتى أن التوقيعات المتطايرة استخدمت للتمييز بين عدوى ممرضة محددة في التليف الكيسي (المكورات العنقودية الذهبية 7 ، والزائفة الزنجارية 8,9 ، و S. aureus مقابل P. aeruginosa10). ومع ذلك ، مع تعقيد هذه العينات البيولوجية ، غالبا ما يكون من الصعب تحديد مصدر المركبات العضوية المتطايرة المحددة.
تتمثل إحدى الاستراتيجيات لفك تشابك الملامح المتطايرة من الميكروبات المصابة المتعددة في إجراء تحليل للكائنات الحية الدقيقة في كل من الزراعة الأحادية والمشتركة11. يفحص تحليل مساحة الرأس التحليلات المنبعثة في "مساحة الرأس" فوق العينة بدلا من تلك المضمنة في العينة نفسها. غالبا ما تتميز المستقلبات الميكروبية في الثقافات الأحادية بسبب صعوبة تحديد أصل المستقلبات الميكروبية في العينات السريرية المعقدة. من خلال تنميط المواد المتطايرة من الثقافات الأحادية البكتيرية ، قد تمثل أنواع المواد المتطايرة التي ينتجها الميكروب في المختبر خط أساس لذخيرته المتطايرة. الجمع بين الثقافات البكتيرية ، على سبيل المثال ، إنشاء مزارع مشتركة ، وتوصيف الجزيئات المتطايرة المنتجة قد يكشف عن التفاعلات أو التغذية المتبادلة بين البكتيريا12.
استراتيجية أخرى لتحديد الأصل الميكروبي للجزيئات المتطايرة هي توفير مصدر غذائي يحمل نظائر مستقرة. النظائر المستقرة هي أشكال غير مشعة من الذرات التي تحدث بشكل طبيعي مع عدد مختلف من النيوترونات. في استراتيجية تم استخدامها منذ أوائل 1930s لتتبع التمثيل الغذائي النشط في الحيوانات13 ، تتغذى الكائنات الحية الدقيقة من مصدر المغذيات المسمى وتدمج النظير المستقر في مساراتها الأيضية. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام نظير مستقر في شكل ماء ثقيل (D2O) لتحديد S. aureus النشط استقلابيا في عينة بلغم CF السريرية14. في مثال آخر ، تم استخدام 13جلوكوز يحمل علامة C لإثبات التغذية المتقاطعة للمستقلبات بين العزلات السريرية CF ل P. aeruginosa و Rothia mucilaginosa12 . 
مع تقدم تقنيات قياس الطيف الكتلي ، انتقلت طرق اكتشاف الإشارات المتطايرة من الملاحظات النوعية إلى قياسات أكثر كمية. باستخدام مطياف كتلة كروماتوغرافيا الغاز (GC-MS) ، أصبحت معالجة العينات البيولوجية في متناول معظم البيئات المختبرية أو السريرية. تم استخدام العديد من الطرق لمسح الجزيئات المتطايرة لتحديد ملامح العينات مثل الطعام والثقافات البكتيرية والعينات البيولوجية الأخرى والهواء والماء للكشف عن التلوث. ومع ذلك ، فإن العديد من الطرق الشائعة لأخذ العينات المتطايرة ذات الإنتاجية العالية تتطلب مذيبا ولا يتم تنفيذها بالمزايا التي يوفرها الاستخراج الفراغي. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى كميات أو كميات أكبر (أكبر من 0.5 مل) من المواد التي تم أخذ عينات منها للتحليل15،16،17،18،19 ، على الرغم من أن هذا خاص بالركيزة ويتطلب التحسين لكل نوع عينة وطريقة.
هنا ، تم استخدام استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ (VASE) متبوعا بالامتزاز الحراري على GC-MS لمسح الملامح المتطايرة للمزارع البكتيرية الأحادية والمشتركة وتحديد المواد المتطايرة المنتجة بنشاط مع فحص النظائر المستقرة من البراز البشري واللعاب ومياه الصرف الصحي وعينات البلغم (الشكل 1). مع كميات عينات محدودة ، تم استخراج المركبات العضوية المتطايرة من أقل من 15 ميكرولتر من البلغم. تتطلب تجارب فحص النظائر مع العينات البشرية إضافة مصدر نظير مستقر ، مثل الجلوكوز 13C ، والوسائط لزراعة نمو المجتمع الميكروبي. تم تحديد الإنتاج النشط للمواد المتطايرة كجزيء أثقل بواسطة GC-MS. مكن استخراج الجزيئات المتطايرة تحت فراغ ثابت من اكتشاف الجزيئات المتطايرة مع زيادة الحساسية 20،21،22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Stg Diaph Pump</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-10-20030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL VOA vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5719110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Black Caps with hole, no septum</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-39-76044B</td>
			<td>holds lid liner in place on vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm vial liner for sorbent pens</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-L024S</td>
			<td>allows pens to make a vacuum seal at top of vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>5600-SPES</td>
			<td>5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI) media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation Stofware</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-624 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>122-1364E</td>
			<td>60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexsi sofware</td>
			<td>Dexsi (open source)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace Bundle HS-B01, 120VA</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-B01</td>
			<td>Items for running headspace extraction included in bundle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) - blank</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-T3560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53550-792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-OR-L024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Preparation Rail</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbent pen thermal conditioner</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>3801-SPTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Todd Hewitt (TH) media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1438-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction

المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) من العينات البيولوجية لها أصول غير معروفة. قد تنشأ المركبات العضوية المتطايرة من المضيف أو الكائنات الحية المختلفة من داخل المجتمع الميكروبي للمضيف. لفك تشابك أصل المركبات العضوية المتطايرة الميكروبية ، تم إجراء تحليل متطاير لمساحة الرأس للمزارع البكتيرية الأحادية والمشتركة للمكورات العنقودية الذهبية ، والزائفة الزنجارية ، و Acinetobacter baumannii ، وفحص النظائر المستقرة في العينات البيولوجية من البراز واللعاب ومياه الصرف الصحي والبلغم. تم استخدام المزارع الأحادية والمشتركة لتحديد الإنتاج المتطاير من الأنواع البكتيرية الفردية أو بالاشتراك مع فحص النظائر المستقرة لتحديد التمثيل الغذائي النشط للميكروبات من العينات البيولوجية.
تم استخدام استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ (VASE) لاستخراج المركبات العضوية المتطايرة. VASE هي طريقة سهلة الاستخدام وتجارية وخالية من المذيبات لاستخراج مساحة الرأس للمركبات شبه المتطايرة والمتطايرة. إن نقص المذيبات والظروف شبه الفراغية المستخدمة أثناء الاستخراج تجعل تطوير طريقة سهلة وسريعة نسبيا عند مقارنتها بخيارات الاستخراج الأخرى مثل tert-butylation والاستخراج الدقيق للطور الصلب. تم استخدام سير العمل الموصوف هنا لتحديد توقيعات متقلبة محددة من الثقافات الأحادية والمشتركة. وعلاوة على ذلك، حدد تحليل فحص النظائر المستقرة للعينات البيولوجية المرتبطة بالإنسان المركبات العضوية المتطايرة التي أنتجت إما بشكل شائع أو فريد. تعرض هذه الورقة سير العمل العام والاعتبارات التجريبية ل VASE بالاقتران مع فحص النظائر المستقرة للمزارع الميكروبية الحية.

الثقافات الأحادية والمشتركة ل S. aureus و P. aeruginosa و A. baumannii تألفت الثقافات الأحادية والمشتركة من الأنواع البكتيرية S. aureus و P. aeruginosa و A. baumannii. هذه هي مسببات الأمراض الانتهازية الشائعة الموجودة في الجروح البشرية وا...

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

يصف هذا البروتوكول استخراج المركبات العضوية المتطايرة من عينة بيولوجية باستخدام طريقة استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ ، وكروماتوغرافيا الغاز إلى جانب قياس الطيف الكتلي باستخدام سكة إعداد العينات Entech ، وتحليل البيانات. كما يصف استزراع العينات البيولوجية وفحص النظائر المستقرة.

التقاط المركبات العضوية المتطايرة الميكروبية المنتجة بنشاط من العينات المرتبطة بالإنسان باستخدام استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

يسمح لنا هذا البروتوكول بالتركيز بسهولة وتحديد المستقلبات المتطايرة والمتطايرة المنتجة بنشاط من الكائنات الحية الميكروبية في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية. VASE هي طريقة أكثر سهولة في الاستخدام لتركيز المواد المتطايرة منخفضة الوفرة. كل ما تحتاجه هو عينة تحت الفراغ القريب ، ودع الفيزياء تقوم بالباقي.إن الوصول إلى التحليل المتطاير للعينات السريرية له آثار مهمة على اكتشاف المؤشرات الحيوية الأيضية في عدد من الحالات المرضية المختلفة. على سبيل المثال ، يمكن الكشف عن قيادة مسببات الأمراض والعدوى أو نجاح العلاج المضاد للبكتيريا من خلال التحليل المتطاير لعينات اللعاب أو البلغم أو التنفس. لإعداد عينات من البراز ، أضف ملليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات إلى 100 ملليغرام من البراز في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر ودوامة لمدة ثلاث دقائق.احتفظ بالعينات على الجليد عندما لا تكون قيد الاستخدام. أضف 485 ملليلتر من وسط BHI مع جلوكوز 20 ملليمول 13C أو BHI مع 30٪ ديوتيريوم إلى 15 ميكرولتر من خليط البراز والماء ، مما يضمن أن الحجم النهائي للعينة هو 500 ميكرولتر. إعداد عينات في ثلاثة أضعاف التقنية.لإعداد عينات من مياه الصرف الصحي ، أضف 500 ميكرولتر من مياه الصرف الصحي إلى 500 ميكرولتر من وسط BHI مع جلوكوز 13C أو 30٪ ديوتيريوم لحجم إجمالي قدره ملليلتر واحد. تحضير العينات في ثلاثة أضعاف والاحتفاظ بها على الجليد. لإعداد عينات اللعاب ، أضف 50 ميكرولتر من اللعاب إلى 500 ميكرولتر من وسط BHI مع جلوكوز 13C أو 30٪ ديوتيريوم لحجم إجمالي قدره 550 ميكرولتر.تحضير العينات في ثلاثة أضعاف والاحتفاظ بها على الجليد. لإعداد عينات البلغم ، أضف 15 ميكرولتر من البلغم إلى قارورة. تحضير العينات في ثلاثة أضعاف والاحتفاظ بها على الجليد.ضع قوارير VOA فارغة على اللوحة الباردة وضع الصفيحة الباردة على الجليد في غطاء السلامة الأحيائية. قم بتشغيل 5600 SPEU واضبطه على درجة الحرارة المطلوبة. قم بتسمية قوارير VOA سعة 20 ملليلتر وفقا للعينات والنسخ المتماثلة ومعرفات HSP باستخدام علامة مقاومة للماء تقاوم الماء في حالة تشكل التكثيف على الأجزاء الخارجية من القارورة أثناء وجودها على الجليد.داخل غطاء السلامة الأحيائية ، قم بفك الغطاء الأبيض على القارورة ، وقم بسحب العينة بسرعة في القارورة ، وقم بتجميع بطانة الغطاء والغطاء الأسود و HSP. ضع القارورة التي تحتوي على العينة و HSP مرة أخرى على اللوحة الباردة. بمجرد إعداد جميع العينات في القوارير الزجاجية ، قم بتشغيل مضخة التفريغ ، وضع القوارير تحت الفراغ ، وإزالة مصدر الفراغ.تحقق مرة أخرى من الضغط بعد وضع جميع العينات تحت الفراغ باستخدام مقياس الضغط. إذا كانت القارورة تتسرب ، فتأكد من أن الغطاء مشدود بإحكام وأن حلقات O البيضاء لبطانات HSP والغطاء في مكانها بشكل صحيح. ضع القوارير في SPEU للحصول على الوقت ودرجة الحرارة الأمثل مع الإثارة عند 200 دورة في الدقيقة.استخراج الثقافات لمدة ساعة واحدة عند 70 درجة مئوية واستخراج تجارب فحص النمط المتماثل المستقرة مع عينات البراز والصرف الصحي واللعاب والبلغم لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية. ضع الصفيحة الباردة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها بعد اكتمال فترة الاستخراج. عند اكتمال الاستخراج ، ضع عينات على اللوحة الباردة لمدة 15 دقيقة لسحب بخار الماء من HSP ومساحة رأس القارورة ، ثم انقل HSPs إلى أكمامها.قم بإعداد تسلسل العينات على برنامج Entech. افتح البرنامج وحدد 5800 والتسلسل في الخيارات الموجودة على يمين القائمة المنسدلة أداة. احفظ جدول التسلسل، وحدد تشغيل على الجانب الأيمن، ثم ابدأ بفارغ في Desorber إذا لم يكن HSP الفارغ هو desorber.لاحظ أنه سيتم التعامل مع HSPs بواسطة SPR لكل عينة في التسلسل. دع SPR يسخن. السماح ل SPR بتشغيل كافة العينات تلقائيا.سيقوم التسلسل الموجود على جانب GC-MS بتسجيل البيانات تلقائيا في ملفات منفصلة. أضف ذروة إلى طريقة المعالجة عن طريق تحديد معايرة متبوعة بتحرير مركب واسم وإدراج مركب ضمن مركب قياسي خارجي. أضف اسم المركبات ووقت الاحتفاظ وأيون هدف الإشارة الكمية.أضف أكبر ثلاث قمم ، والتي تشمل المركبات ذات الاحتمال الأكبر من 75٪ ، مما يضمن أن محاذاة كل أيون تعريف للمركب تقع داخل مركز الذروة. احفظه عن طريق تحديد موافق ، متبوعا بالطريقة والحفظ. بمجرد إعداد طريقة العملية، انتقل إلى القياس الكمي والحساب، ثم عرض النتيجة الكمية وQEDIT لتحديد كمية البيانات.هنا ، أعقب استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ امتزاز حراري على GC-MS لمسح الملامح المتطايرة للمزارع البكتيرية الأحادية والمشتركة ، وتحديد المواد المتطايرة المنتجة بنشاط مع فحص النظائر المستقرة من البراز البشري واللعاب ومياه الصرف الصحي وعينات البلغم. تألفت الثقافات الأحادية والمشتركة من الأنواع البكتيرية المكورات العنقودية الذهبية ، والزائفة الزنجارية ، و acinetobacter baumannii. تم الكشف عن 43 جزيئا متطايرا مشروحا من الثقافات الأحادية والمشتركة في نقاط زمنية مدتها 24 و 48 ساعة.كان هناك المزيد من دمج 13C في جزيئات متطايرة تحمل علامات كاملة مقارنة بالديوتيريوم. تم دمج 13C في 2-butanone و 3-hydroxy و 2 و 3-butanedione diacetyl وحمض الخليك والفينول لجميع عينات البراز ومياه الصرف الصحي واللعاب. تم الكشف عن الأسيتون وحمض البيوتانويك وحمض البروبانويك على أنها موسومة في اللعاب ومياه الصرف الصحي.في حين تم إثراء ثنائي ميثيل ثلاثي كبريتيد وثنائي كبريتيد ثنائي ميثيل في كل من عينات البراز واللعاب. تم إثراء المواد المتطايرة 1-بروبانول ، 2-بيوتانون ، بنزوفينون ، الإيثانول ، وخلات ميثيل ثيول فقط في مياه الصرف الصحي و 2 ، 3-بنتانيديون في اللعاب. تم دمج الديوتيريوم في حمض الخليك المتطاير ، البنزالدهيد ، 4-methyl-dimethyl trisulfide ، والفينول من عينات اللعاب أو مياه الصرف الصحي.كان حمض الخليك وثنائي ميثيل ثلاثي الكبريتيد والأسيتون والبروبانول 2-ميثيل أكثر وفرة في عينات البلغم المستزرع من عينات البلغم غير المستزرعة. تم إجراء تحليل متغير متعدد المتغيرات للمتغيرات ، وهو PERMANOVA ، على مصفوفة مسافة Bray-Curtis للوفرة المتطايرة من عينات البلغم التليف الكيسي. وجدنا أن الشخص الذي تبرع بالعينة يفسر 51٪ من التباين في البلغم المستزرع المسمى 13C و 33٪ من التباين في البلغم غير المستزرع.هنا ، يظهر نجاح وضع العلامات على النظائر المستقرة مع الجلوكوز 13C في المواد المتطايرة من عينات البلغم المستزرعة التي تم جمعها من سبعة أشخاص يعانون من التليف الكيسي. تظهر المواد المتطايرة التي لديها دمج أعلى 13C لغالبية العينات في اللوحة 5A ، وتلك التي تحتوي على نسبة أقل من 13C في غالبية عينات البلغم موجودة في اللوحة 5B ، وتظهر الجزيئات ذات التحويل الأقل بنسبة 13C في أقلية من عينات البلغم في اللوحة 5C. تحقق دائما من ضغوط القارورة بعد حوالي دقيقة.الفراغ المكسور يهزم حساسية وسرعة طريقة VASE. بعد هذا الإجراء ، إذا تم إجراء فحص النظائر المستقرة ، يمكن استخراج الحمض النووي من المادة المتبقية لتحديد الكائنات الحية الميكروبية أو الأنواع التي قد تكون ساهمت في إنتاج الجزيئات المتطايرة. هذه الطريقة مفيدة أيضا في الكشف عن المواد المتطايرة من أي نوع عينة دون فحص النظائر.مع مزايا الحساسية وانخفاض حجم العينة ، يمكن للعديد من التطبيقات الاستفادة من هذه التقنية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

محاكاة وظيفة من البروتينات اشارة: نحو الاصطناعي الإشارة العلاج تنبيغ

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

متعدد القسيمات-PAGE، طريقة لالتقاط وحل البروتين المجمعات في العينات البيولوجية

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

بروتوكول محسن لاستخراج البروتينات من صمام ميترال الإنسان

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

التقاط حركية التفاعل البروتين قناة أيون مع جزيئات صغيرة بمقايسة التداخلي بيو-طبقة

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

نبات رذاذ الكتلي: أسلوب تاين المحيطة سريع مباشرة تقييم نواتج الأيض من الأنسجة النباتية

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

تنميط المركبات المتطايرة في فاكهة الكشمش الأسود باستخدام الاستخراج المجهري للمرحلة الصلبة في مساحة الرأس إلى جانب كروماتوغرافيا الغاز - قياس الطيف الكتلي

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

الكمية المطلقة للإينوزيتول بيروفوسفات بواسطة الرحلان الكهربائي الشعري الكهربائي قياس الطيف الكتلي للتأين

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

إعادة تشكيل نشاط استخراج Msp1 مع مكونات منقى بالكامل

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

استخراج بمساعدة الموجات فوق الصوتية من حمض الكانابيديول من الكتلة الحيوية للقنب

Industrial hemp (Cannabis spp.) has many compounds of interest with potential medical benefits. Of these compounds, cannabinoids have come to the center ...