Name: capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction
Uploaded: 2022-06-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

Vi takker Heather Maughan og Linda M. Kalikin for omhyggelig redigering af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af NIH NHLBI (tilskud 5R01HL136647-04).

1. Headspace Sorbent Pen (HSP) og overvejelser om prøveanalyse
BEMÆRK: HSP'en, der indeholder sorbent tenax TA, blev valgt til at fange en bred vifte af flygtige stoffer. Tenax har en lavere affinitet for vand sammenlignet med andre sorbenter, hvilket gør det muligt at fange flere VOC'er fra prøver med højere fugtighed. Tenax har også et lavt niveau af urenheder og kan konditioneres til genbrug. Sorbentvalg blev også foretaget i betragtning med kolonnen installeret i GC-MS (se mat...

<ol>
	<li>Van Berkel, J. J. B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+profile+of+volatile+organic+compounds+in+breath+discriminates+COPD+patients+from+controls.">A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls.</a> Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).</li><li>Nakhleh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+active+pulmonary+tuberculosis+with+a+breath+test+using+nanomaterial-based+sensors.">Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors.</a> European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).</li><li>Lim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+diagnosis+of+tuberculosis+from+analysis+of+urine+volatile+organic+compounds.">Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds.</a> ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).</li><li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+volatile+organic+compounds+in+exhaled+breath+to+diagnose+ventilator-associated+pneumonia.">Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia.</a> Scientific Reports. 5, 17179 (2015).</li><li>Paff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+molecular+profiles+in+the+assessment+of+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia.">Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).</li><li>Robroeks, C. M. H. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+volatile+organic+compounds+in+cystic+fibrosis+patients+and+controls.">Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls.</a> Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).</li><li>Neerincx, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+cyanide+emission+in+the+lung+by+Staphylococcus+aureus.">Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus.</a> European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).</li><li>Goeminne, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+sputum+headspace+through+volatile+organic+compound+analysis.">Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis.</a> Respiratory Research. 13, 87 (2012).</li><li>Joensen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+breath+analysis+using+Electronic+Nose+in+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia+patients+with+chronic+pulmonary+infections.">Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections.</a> PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).</li><li>Nasir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+molecules+from+bronchoalveolar+lavage+fluid+can+'rule-in'+Pseudomonas+aeruginosa+and+'rule-out'+Staphylococcus+aureus+infections+in+cystic+fibrosis+patients.">Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients.</a> Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).</li><li>Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatiles+in+inter-specific+bacterial+interactions.">Volatiles in inter-specific bacterial interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).</li><li>Gao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+polymicrobial+metabolism+in+cystic+fibrosis+airways:+Pseudomonas+aeruginosa+metabolism+and+physiology+are+influenced+by+Rothia+mucilaginosa-derived+metabolites.">Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites.</a> mSphere. 3 (2), 00151 (2018).</li><li>Schoenheimer, R., Rittenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deuterium+as+an+indicator+in+the+study+of+intermediary+metabolism.">Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism.</a> Science. 82 (2120), 156-157 (1935).</li><li>Neubauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+application+of+microbial+lipids+as+tracers+of+Staphylococcus+aureus+growth+rates+in+cystic+fibrosis+sputum.">Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).</li><li>Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GC-MS+analysis+of+ethanol+and+other+volatile+compounds+in+micro-volume+blood+samples-quantifying+neonatal+exposure.">GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).</li><li>Mayor, A. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+sample+preparation+for+direct+SPME-GC-MS+analysis+of+murine+and+human+faecal+volatile+organic+compounds+for+metabolomic+studies.">Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies.</a> Journal of Analytical &amp; Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).</li><li>Camarasu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headspace+SPME+method+development+for+the+analysis+of+volatile+polar+residual+solvents+by+GC-MS.">Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).</li><li>Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer+volatile+analysis:+optimization+of+HS/SPME+coupled+to+GC/MS/FID.">Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID.</a> Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).</li><li>Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+headspace+solid-phase+dynamic+extraction+to+analyse+the+volatile+fraction+of+food+matrices.">Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices.</a> Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).</li><li>Trujillo-Rodr&#237;guez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuum-assisted+sorbent+extraction:+An+analytical+methodology+for+the+determination+of+ultraviolet+filters+in+environmental+samples.">Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples.</a> Talanta. 208, 120390 (2020).</li><li>Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+algae-based+treatment+of+herbicide-contaminated+groundwater.">Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater.</a> Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).</li><li>Psillakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+vacuum:+an+emerging+experimental+parameter+to+consider+during+headspace+microextraction+sampling.">The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+daily+dynamics+of+cystic+fibrosis+airway+microbiota+during+clinical+stability+and+at+exacerbation.">The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation.</a> Microbiome. 3, 12 (2015).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Mahboubi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-based+and+culture-independent+bacteriologic+analysis+of+cystic+fibrosis+respiratory+specimens.">Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).</li></ol>

For at identificere flygtig produktion i in vitro-kulturer og humant associerede prøver blev der udført flygtig analyse af mono- og co-kulturer af P. aeruginosa, S. aureus og A. baumanii og stabil isotop-sondering af forskellige biologiske prøver. I analysen for mono- og co-kulturer blev der påvist flygtige stoffer ved at udføre en kort ekstraktion i 1 time ved 70 °C. Den flygtige analyse af mono- og co-kulturer tillod undersøgelsen af de forbindelser, der produceres både af individuel...

Flygtige organiske forbindelser (VOC'er) har et stort løfte om bakteriel påvisning og identifikation, fordi de udsendes fra alle organismer, og forskellige mikrober har unikke VOC-signaturer. Flygtige molekyler er blevet anvendt som en ikke-invasiv måling til påvisning af forskellige luftvejsinfektioner, herunder kronisk obstruktiv lungesygdom1, tuberkulose2 i urin3 og respiratorassocieret lungebetændelse4, ud over at skelne forsøgspersoner med cystisk fibrose (CF) fra raske kontrolpersoner 5,6. Flygtige signaturer er endda blevet brugt til at skelne mellem specifikke patogeninfektioner i CF (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 og S. aureus vs. P. aeruginosa10). Men med kompleksiteten af sådanne biologiske prøver er det ofte vanskeligt at lokalisere kilden til specifikke VOC'er.
En strategi til at adskille de flygtige profiler fra flere inficerende mikrober er at udføre headspace-analyse af mikroorganismer i både mono- og co-kultur11. Headspace-analyse undersøger de analytter, der udsendes i "headspace" over en prøve i stedet for dem, der er indlejret i selve prøven. Mikrobielle metabolitter er ofte blevet karakteriseret i monokulturer på grund af vanskeligheden ved at bestemme oprindelsen af mikrobielle metabolitter i komplekse kliniske prøver. Ved at profilere flygtige stoffer fra bakterielle monokulturer kan de typer flygtige stoffer, som en mikrobe producerer in vitro , udgøre en basislinje for dens flygtige repertoire. Kombination af bakteriekulturer, f.eks. skabelse af co-kulturer og profilering af de flygtige molekyler, der produceres, kan afsløre interaktionerne eller krydsfodring mellem bakterierne12.
En anden strategi til identifikation af flygtige molekylers mikrobielle oprindelse er at tilvejebringe en næringskilde, der er mærket med en stabil isotop. Stabile isotoper er naturligt forekommende, ikke-radioaktive former for atomer med et andet antal neutroner. I en strategi, der er blevet brugt siden begyndelsen af 1930'erne til at spore aktiv metabolisme hos dyr13, føder mikroorganismen ud af den mærkede næringskilde og inkorporerer den stabile isotop i sine metaboliske veje. For nylig er en stabil isotop i form af tungt vand (D2O) blevet anvendt til at identificere metabolisk aktiv S. aureus i en klinisk CF-sputumprøve14. I et andet eksempel er 13C-mærket glucose blevet anvendt til at demonstrere krydsfodring af metabolitter mellem CF kliniske isolater af P. aeruginosa og Rothia mucilaginosa12 .
Med udviklingen af massespektrometriteknikker har metoder til påvisning af flygtige signaler flyttet sig fra kvalitative observationer til mere kvantitative målinger. Ved at anvende gaskromatografi massespektrometri (GC-MS) er behandling af biologiske prøver blevet inden for rækkevidde for de fleste laboratorie- eller kliniske indstillinger. Mange metoder til at undersøge flygtige molekyler er blevet brugt til at profilere prøver som mad, bakteriekulturer og andre biologiske prøver og luft og vand til at detektere forurening. Imidlertid kræver flere almindelige metoder til flygtig prøveudtagning med høj gennemstrømning opløsningsmiddel og udføres ikke med de fordele, der tilvejebringes ved vakuumekstraktion. Derudover kræves der ofte større mængder eller mængder (større end 0,5 ml) af udtagne materialer til analyse 15,16,17,18,19, selv om dette er substratspecifikt og kræver optimering for hver prøvetype og metode.
Her blev vakuumassisteret sorbentekstraktion (VASE) efterfulgt af termisk desorption på en GC-MS anvendt til at undersøge de flygtige profiler af bakterielle mono- og co-kulturer og identificere aktivt producerede flygtige stoffer med stabil isotopundersøgelse fra humane afføring, spyt, spildevand og sputumprøver (figur 1). Med begrænsede prøvemængder blev VOC'er ekstraheret fra så lidt som 15 μL sputum. Isotopundersøgelsesforsøg med humane prøver krævede tilsætning af en stabil isotopkilde, såsom 13C glucose, og medier til at dyrke væksten i det mikrobielle samfund. Den aktive produktion af flygtige stoffer blev identificeret som et tungere molekyle af GC-MS. Ekstraktion af flygtige molekyler under et statisk vakuum muliggjorde påvisning af flygtige molekyler med øget følsomhed 20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Stg Diaph Pump</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-10-20030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL VOA vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5719110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Black Caps with hole, no septum</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-39-76044B</td>
			<td>holds lid liner in place on vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm vial liner for sorbent pens</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-L024S</td>
			<td>allows pens to make a vacuum seal at top of vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>5600-SPES</td>
			<td>5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI) media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation Stofware</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-624 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>122-1364E</td>
			<td>60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexsi sofware</td>
			<td>Dexsi (open source)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace Bundle HS-B01, 120VA</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-B01</td>
			<td>Items for running headspace extraction included in bundle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) - blank</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-T3560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53550-792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-OR-L024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Preparation Rail</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbent pen thermal conditioner</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>3801-SPTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Todd Hewitt (TH) media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1438-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction

Flygtige organiske forbindelser (VOC'er) fra biologiske prøver har ukendt oprindelse. VOC'er kan stamme fra værten eller forskellige organismer fra værtslandets mikrobielle samfund. For at adskille oprindelsen af mikrobielle VOC'er blev der udført flygtig headspace-analyse af bakterielle mono- og co-kulturer af Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa og Acinetobacter baumannii og stabil isotopundersøgelse i biologiske prøver af afføring, spyt, spildevand og sputum. Mono- og co-kulturer blev brugt til at identificere flygtig produktion fra individuelle bakteriearter eller i kombination med stabil isotop-sondering for at identificere mikrobernes aktive metabolisme fra de biologiske prøver.
Vakuumassisteret sorbentekstraktion (VASE) blev anvendt til at udvinde VOC'erne. VASE er en brugervenlig, kommercialiseret, opløsningsmiddelfri headspace-ekstraktionsmetode til halvflygtelige og flygtige forbindelser. Manglen på opløsningsmidler og de nærvakuumbetingelser, der anvendes under ekstraktionen, gør det relativt let og hurtigt at udvikle en metode sammenlignet med andre ekstraktionsmuligheder såsom tert-butylering og mikroekstraktion i fast fase. Den arbejdsgang, der er beskrevet her, blev brugt til at identificere specifikke flygtige signaturer fra mono- og co-kulturer. Desuden identificerede analyse af den stabile isotopsondering af humane associerede biologiske prøver VOC'er, der enten var almindeligt eller unikt produceret. Dette papir præsenterer den generelle arbejdsgang og eksperimentelle overvejelser af VASE i forbindelse med stabil isotop sondering af levende mikrobielle kulturer.

Mono- og co-kulturer af S. aureus, P. aeruginosa og A. baumannii Mono- og samkulturerne bestod af bakteriearterne S. aureus, P. aeruginosa og A. baumannii. Disse er almindelige opportunistiske patogener, der findes i menneskelige sår og kroniske infektioner. For at identificere de flygtige molekyler, der er til stede i mono- og co-kulturerne, blev der udført en kort 1-tim...

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Denne protokol beskriver ekstraktionen af flygtige organiske forbindelser fra en biologisk prøve med den vakuumassisterede sorbentekstraktionsmetode, gaskromatografi kombineret med massespektrometri ved hjælp af Entech Sample Preparation Rail og dataanalyse. Det beskriver også dyrkning af biologiske prøver og stabil isotopsondering.

Indfangning af aktivt producerede mikrobielle flygtige organiske forbindelser fra humant associerede prøver med vakuumassisteret sorbentekstraktion

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Denne protokol giver os mulighed for let at koncentrere og identificere flygtige metabolitter og aktivt producerede flygtige stoffer fra mikrobielle organismer i en række biologiske prøver. VASE er en mere brugervenlig metode til at koncentrere flygtige stoffer med lav overflod. Alt hvad du behøver er en prøve under næsten vakuum, og lad fysikken gøre resten.Adgang til flygtig analyse af kliniske prøver har vigtige konsekvenser for opdagelsen af metaboliske biomarkører i en række forskellige sygdomstilstande. For eksempel kan patogenkørsel og infektion eller succesen med antibakteriel terapi påvises med flygtig analyse af spyt, sputum eller åndedrætsprøver. For at forberede fækale prøver tilsættes en milliliter deioniseret vand til 100 mg afføring i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og hvirvel i tre minutter.Opbevar prøverne på is, når de ikke er i brug. Der tilsættes 485 ml BHI-medium med 20 millimolær 13C-glucose eller BHI med 30 % deuterium til 15 mikroliter fækal og vandblanding, hvilket sikrer, at prøvens endelige volumen er 500 mikroliter. Forbered prøver i tekniske triplikater.For at forberede spildevandsprøver tilsættes 500 mikroliter spildevand til 500 mikroliter BHI-medium med 13C glucose eller 30% deuterium for et samlet volumen på en milliliter. Forbered prøver i triplikater og opbevar dem på is. For at forberede spytprøver tilsættes 50 mikroliter spyt til 500 mikroliter BHI-medium med 13C glucose eller 30% deuterium til et samlet volumen på 550 mikroliter.Forbered prøver i triplikater og opbevar dem på is. For at forberede sputumprøver tilsættes 15 mikroliter sputum i et hætteglas. Forbered prøver i tre eksemplarer og opbevar dem på is.Læg tomme VOA-hætteglas på den kolde plade, og læg den kolde plade på is i biosikkerhedshætten. Tænd for 5600 SPEU, og juster den til den ønskede temperatur. Mærk 20 milliliter VOA-hætteglas i henhold til prøver, replikater og HSP-id'er ved hjælp af en vandafvisende markør, der modstår vand, hvis der dannes kondens på ydersiden af hætteglasset, mens du er på is.Inde i biosikkerhedshætten skrues den hvide hætte på hætteglasset af, pipetteprøven hurtigt i hætteglasset, og saml lågforingen, den sorte hætte og HSP. Anbring hætteglasset, der indeholder prøven og HSP, tilbage på den kolde plade. Når alle prøver er fremstillet i glashætteglassene, skal du tænde vakuumpumpen, placere hætteglassene under vakuum og fjerne vakuumkilden.Dobbelttjek trykket efter at have placeret alle prøver under vakuum ved hjælp af manometeret. Hvis der lækker et hætteglas, skal du sørge for, at hætten er skruet godt på, og at de hvide O-ringe på HSP og lågforinger er korrekt på plads. Anbring hætteglas i SPEU'en for den optimerede tid og temperatur med omrøring ved 200 o / min.Uddrag kulturer i en time ved 70 grader Celsius og ekstrakt stabile isotype sonderende eksperimenter med fækale, spildevand, spyt og sputumprøver i 18 timer ved 37 grader Celsius. Anbring den kolde plade ved minus 80 grader Celsius til brug, når ekstraktionsperioden er afsluttet. Når ekstraktionen er afsluttet, skal du placere prøver på den kolde plade i 15 minutter for at trække vanddamp ud af HSP- og hætteglashovedrummet og derefter overføre HSP'erne til deres ærmer.Konfigurer sekvensen af prøver på Entech-softwaren. Åbn programmet, og vælg 5800 og Sequence i indstillingerne til højre for rullemenuen Instrument. Gem sekvenstabellen, vælg Kør i venstre side, og start derefter med tom i Desorber, hvis den tomme HSP ikke er desorberen.Bemærk, at HSP'er håndteres af SPR for hver prøve i sekvensen. Lad SPR varme op. Tillad SPR at køre alle prøver automatisk.Sekvensen på GC-MS-siden registrerer automatisk dataene i separate filer. Føj en top til behandlingsmetoden ved at vælge Kalibrer efterfulgt af Rediger forbindelse, Navn og Indsæt forbindelse under Ekstern standardforbindelse. Tilføj navnet på forbindelserne, retentionstiden og den kvantitative signalmålion.Tilføj de tre største toppe, som omfatter forbindelser med større end 75% sandsynlighed, hvilket sikrer, at justeringen af hver identificerende ion af forbindelsen ligger inden for midten af toppen. Gem det ved at vælge OK efterfulgt af Metode og Gem. Når procesmetoden er konfigureret, skal du fortsætte til Quantitate and Calculate, derefter View and QEDIT Quant Result for at kvantificere dataene.Her blev vakuumassisteret sorbentekstraktion efterfulgt af termisk desorption på en GC-MS for at undersøge de flygtige profiler af bakterielle mono- og co-kulturer og identificere aktivt producerede flygtige stoffer med stabil isotopundersøgelse fra human afføring, spyt, spildevand og sputumprøver. Mono- og samkulturerne bestod af bakteriearterne staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa og acinetobacter baumannii. 43 kommenterede flygtige molekyler blev påvist fra mono- og co-kulturerne på 24- og 48-timers tidspunkter.Der var mere inkorporering af 13C i fuldt mærkede flygtige molekyler i forhold til deuterium. 13C blev inkorporeret i 2-butanon, 3-hydroxy, 2, 3-butanedion diacetyl, eddikesyre og phenol til alle fækale, spildevand og spytprøver. Acetone, butansyre og propansyre blev påvist som mærket i spyt og spildevand.der henviser til, at dimethyltrisulfid og disulfiddimethyl blev beriget i både fækale og spytprøver. De flygtige stoffer 1-propanol, 2-butanon, benzophenon, ethanol og methylthiolacetat blev kun beriget i spildevand og 2, 3-pentanedion i spyt. Deuterium blev inkorporeret i flygtige stoffer eddikesyre, benzaldehyd, 4-methyl-dimethyltrisulfid og phenol fra enten spyt- eller spildevandsprøver.Eddikesyre, dimethyltrisulfid, acetone og propanol 2-methyl var mere rigelige i de dyrkede sputumprøver end ukultiverede sputumprøver. En permuteret multi-variat analyse af varianter, en PERMANOVA, blev udført på en Bray-Curtis afstandsmatrix af de flygtige overflod fra cystisk fibrose sputumprøver. Vi fandt ud af, at emnet, der donerede prøven, forklarer 51% af variationen i 13C-mærket dyrket sputum og 33% af variationen i ukultiveret sputum.Her vises succesen med stabil isotopmærkning med 13C glucose i flygtige stoffer fra dyrkede sputumprøver indsamlet fra syv personer med cystisk fibrose. Flygtige stoffer, der har højere 13C inkorporering for de fleste prøver, er vist i panel 5A, dem med lavere procent 13C inkorporering i størstedelen af sputumprøverne er i panel 5B, og molekyler med lavere 13C procent konvertering i et mindretal af sputumprøverne er vist i panel 5C. Dobbelttjek altid dit hætteglastryk efter ca. et minut.Et brudt vakuum besejrer VASE-metodens følsomhed og hastighed. Efter denne procedure, hvis stabil isotopsondering blev udført, kan DNA'et ekstraheres fra det resterende materiale for at identificere mikrobielle organismer eller arter, der kan have bidraget til produktionen af de flygtige molekyler. Denne metode er også nyttig til påvisning af flygtige stoffer fra enhver prøvetype uden isotopsondering.Med fordele ved følsomhed og lav prøvevolumen kan mange applikationer drage fordel af denne teknik.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Efterligning af funktion signalproteiner: Mod Artificial Signal transduktion Therapy

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-PAGE: A Fremgangsmåde til registrering og Løsning proteinkomplekser i biologiske prøver

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Optimeret protokol til ekstraktion af proteiner fra humanmitralventilen

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Indfange interaktion kinetik af en Ion-kanal Protein med små molekyler af Bio-lag interferometri Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Leaf Spray massespektrometri: En hurtig omgivende ionisering teknik til direkte vurdere metabolitter fra plantevæv

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Profilering flygtige forbindelser i solbærfrugt ved hjælp af Headspace Solid-Phase Microextraction Koblet til Gaskromatografi-Mass Spektrometri

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Absolut kvantificering af inositolpyrophosphater ved kapillær elektroforese elektrosprayionisering massespektrometri

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Rekonstitution af Msp1 udvindingsaktivitet med fuldt rensede komponenter

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Ultralyd-assisteret ekstraktion af cannabidiolsyre fra cannabis biomasse

Industrial hemp (Cannabis spp.) has many compounds of interest with potential medical benefits. Of these compounds, cannabinoids have come to the center ...