Name: capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction
Uploaded: 2022-06-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

We bedanken Heather Maughan en Linda M. Kalikin voor het zorgvuldig bewerken van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH NHLBI (subsidie 5R01HL136647-04).

1. Headspace Sorbent Pen (HSP) en overwegingen voor monsteranalyse
OPMERKING: De HSP die het sorptiemiddel Tenax TA bevat, is geselecteerd om een breed scala aan vluchtige stoffen vast te leggen. Tenax heeft een lagere affiniteit voor water in vergelijking met andere sorptiemiddelen, waardoor het meer VOC's uit monsters met een hoger vochtgehalte kan vangen. Tenax heeft ook een laag gehalte aan onzuiverheden en kan worden geconditioneerd voor hergebruik. Sorptiemiddelselectie werd ook gemaakt in...

<ol>
	<li>Van Berkel, J. J. B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+profile+of+volatile+organic+compounds+in+breath+discriminates+COPD+patients+from+controls.">A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls.</a> Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).</li><li>Nakhleh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+active+pulmonary+tuberculosis+with+a+breath+test+using+nanomaterial-based+sensors.">Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors.</a> European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).</li><li>Lim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+diagnosis+of+tuberculosis+from+analysis+of+urine+volatile+organic+compounds.">Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds.</a> ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).</li><li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+volatile+organic+compounds+in+exhaled+breath+to+diagnose+ventilator-associated+pneumonia.">Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia.</a> Scientific Reports. 5, 17179 (2015).</li><li>Paff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+molecular+profiles+in+the+assessment+of+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia.">Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).</li><li>Robroeks, C. M. H. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+volatile+organic+compounds+in+cystic+fibrosis+patients+and+controls.">Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls.</a> Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).</li><li>Neerincx, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+cyanide+emission+in+the+lung+by+Staphylococcus+aureus.">Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus.</a> European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).</li><li>Goeminne, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+sputum+headspace+through+volatile+organic+compound+analysis.">Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis.</a> Respiratory Research. 13, 87 (2012).</li><li>Joensen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+breath+analysis+using+Electronic+Nose+in+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia+patients+with+chronic+pulmonary+infections.">Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections.</a> PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).</li><li>Nasir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+molecules+from+bronchoalveolar+lavage+fluid+can+'rule-in'+Pseudomonas+aeruginosa+and+'rule-out'+Staphylococcus+aureus+infections+in+cystic+fibrosis+patients.">Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients.</a> Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).</li><li>Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatiles+in+inter-specific+bacterial+interactions.">Volatiles in inter-specific bacterial interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).</li><li>Gao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+polymicrobial+metabolism+in+cystic+fibrosis+airways:+Pseudomonas+aeruginosa+metabolism+and+physiology+are+influenced+by+Rothia+mucilaginosa-derived+metabolites.">Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites.</a> mSphere. 3 (2), 00151 (2018).</li><li>Schoenheimer, R., Rittenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deuterium+as+an+indicator+in+the+study+of+intermediary+metabolism.">Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism.</a> Science. 82 (2120), 156-157 (1935).</li><li>Neubauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+application+of+microbial+lipids+as+tracers+of+Staphylococcus+aureus+growth+rates+in+cystic+fibrosis+sputum.">Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).</li><li>Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GC-MS+analysis+of+ethanol+and+other+volatile+compounds+in+micro-volume+blood+samples-quantifying+neonatal+exposure.">GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).</li><li>Mayor, A. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+sample+preparation+for+direct+SPME-GC-MS+analysis+of+murine+and+human+faecal+volatile+organic+compounds+for+metabolomic+studies.">Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies.</a> Journal of Analytical &amp; Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).</li><li>Camarasu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headspace+SPME+method+development+for+the+analysis+of+volatile+polar+residual+solvents+by+GC-MS.">Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).</li><li>Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer+volatile+analysis:+optimization+of+HS/SPME+coupled+to+GC/MS/FID.">Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID.</a> Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).</li><li>Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+headspace+solid-phase+dynamic+extraction+to+analyse+the+volatile+fraction+of+food+matrices.">Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices.</a> Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).</li><li>Trujillo-Rodr&#237;guez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuum-assisted+sorbent+extraction:+An+analytical+methodology+for+the+determination+of+ultraviolet+filters+in+environmental+samples.">Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples.</a> Talanta. 208, 120390 (2020).</li><li>Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+algae-based+treatment+of+herbicide-contaminated+groundwater.">Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater.</a> Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).</li><li>Psillakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+vacuum:+an+emerging+experimental+parameter+to+consider+during+headspace+microextraction+sampling.">The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+daily+dynamics+of+cystic+fibrosis+airway+microbiota+during+clinical+stability+and+at+exacerbation.">The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation.</a> Microbiome. 3, 12 (2015).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Mahboubi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-based+and+culture-independent+bacteriologic+analysis+of+cystic+fibrosis+respiratory+specimens.">Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).</li></ol>

Om vluchtige productie in in vitro culturen en met de mens geassocieerde monsters te identificeren, werden vluchtige analyses van mono- en coculturen van P. aeruginosa, S. aureus en A. baumanii en stabiele isotooponderzoek van verschillende biologische monsters uitgevoerd. In de analyse voor de mono- en coculturen werden vluchtige stoffen gedetecteerd door een korte extractie gedurende 1 uur bij 70 °C uit te voeren. De vluchtige analyse van mono- en coculturen maakte het mogelijk om de verbin...

Vluchtige organische stoffen (VOS) zijn veelbelovend voor bacteriële detectie en identificatie omdat ze worden uitgestoten door alle organismen en verschillende microben unieke VOC-handtekeningen hebben. Vluchtige moleculen zijn gebruikt als een niet-invasieve meting voor het detecteren van verschillende luchtweginfecties, waaronder chronische obstructieve longziekte1, tuberculose2 in urine3 en beademingsgerelateerde pneumonie4, naast het onderscheiden van proefpersonen met cystische fibrose (CF) van gezonde controlepersonen 5,6. Vluchtige handtekeningen zijn zelfs gebruikt om specifieke pathogene infecties bij CF te onderscheiden (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 en S. aureus vs. P. aeruginosa10). Met de complexiteit van dergelijke biologische monsters is het echter vaak moeilijk om de bron van specifieke VOS te lokaliseren.
Een strategie voor het ontwarren van de vluchtige profielen van meerdere infecterende microben is het uitvoeren van headspace-analyse van micro-organismen in zowel mono- als co-cultuur11. Headspace-analyse onderzoekt de analyten die worden uitgezonden in de "headspace" boven een monster in plaats van die ingebed in het monster zelf. Microbiële metabolieten zijn vaak gekarakteriseerd in monoculturen vanwege de moeilijkheid om de oorsprong van microbiële metabolieten in complexe klinische monsters te bepalen. Door vluchtige stoffen uit bacteriële monoculturen te profileren, kunnen de soorten vluchtige stoffen die een microbe in vitro produceert een basislijn van zijn vluchtige repertoire vertegenwoordigen. Het combineren van bacterieculturen, bijvoorbeeld het creëren van coculturen, en het profileren van de geproduceerde vluchtige moleculen kan de interacties of kruisvoeding tussen de bacteriënonthullen 12.
Een andere strategie voor het identificeren van de microbiële oorsprong van vluchtige moleculen is om een voedingsbron te bieden die is gelabeld met een stabiele isotoop. Stabiele isotopen zijn van nature voorkomende, niet-radioactieve vormen van atomen met een verschillend aantal neutronen. In een strategie die sinds de vroege jaren 1930 wordt gebruikt om het actieve metabolisme bij dieren te traceren13, voedt het micro-organisme zich met de gelabelde voedingsbron en neemt het de stabiele isotoop op in zijn metabole routes. Meer recent is een stabiele isotoop in de vorm van zwaar water (D2O) gebruikt om metabolisch actieve S. aureus te identificeren in een klinisch CF-sputummonster14. In een ander voorbeeld is 13C-gelabelde glucose gebruikt om de kruising van metabolieten tussen CF klinische isolaten van P. aeruginosa en Rothia mucilaginosa aan te tonen 12 .
Met de vooruitgang van massaspectrometrietechnieken zijn methoden voor het detecteren van vluchtige signalen overgegaan van kwalitatieve waarnemingen naar meer kwantitatieve metingen. Door gebruik te maken van gaschromatografie massaspectrometrie (GC-MS) is de verwerking van biologische monsters binnen handbereik gekomen voor de meeste laboratorium- of klinische omgevingen. Veel methoden om vluchtige moleculen te onderzoeken zijn gebruikt om monsters zoals voedsel, bacterieculturen en andere biologische monsters te profileren, en lucht en water om besmetting te detecteren. Verschillende gangbare methoden voor vluchtige bemonstering met een hoge doorvoer vereisen echter oplosmiddel en worden niet uitgevoerd met de voordelen van vacuümextractie. Bovendien zijn grotere volumes of hoeveelheden (groter dan 0,5 ml) bemonsterde materialen vaak vereist voor analyse 15,16,17,18,19, hoewel dit substraatspecifiek is en optimalisatie vereist voor elk monstertype en elke methode.
Hier werd vacuümondersteunde sorptiemiddelextractie (VASE) gevolgd door thermische desorptie op een GC-MS gebruikt om de vluchtige profielen van bacteriële mono- en coculturen te onderzoeken en actief geproduceerde vluchtige stoffen te identificeren met stabiele isotoopsondering uit menselijke uitwerpselen, speeksel, rioolwater en sputummonsters (figuur 1). Met beperkte monsterhoeveelheden werden VOC's geëxtraheerd uit slechts 15 μL sputum. Isotopenonderzoeksexperimenten met menselijke monsters vereisten het toevoegen van een stabiele isotoopbron, zoals 13C glucose, en media om de groei van de microbiële gemeenschap te cultiveren. De actieve productie van vluchtige stoffen werd door GC-MS geïdentificeerd als een zwaarder molecuul. Extractie van vluchtige moleculen onder een statisch vacuüm maakte de detectie van vluchtige moleculen met verhoogde gevoeligheidmogelijk 20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Stg Diaph Pump</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-10-20030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL VOA vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5719110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Black Caps with hole, no septum</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-39-76044B</td>
			<td>holds lid liner in place on vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm vial liner for sorbent pens</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-L024S</td>
			<td>allows pens to make a vacuum seal at top of vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>5600-SPES</td>
			<td>5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI) media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation Stofware</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-624 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>122-1364E</td>
			<td>60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexsi sofware</td>
			<td>Dexsi (open source)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace Bundle HS-B01, 120VA</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-B01</td>
			<td>Items for running headspace extraction included in bundle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) - blank</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-T3560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53550-792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-OR-L024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Preparation Rail</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbent pen thermal conditioner</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>3801-SPTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Todd Hewitt (TH) media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1438-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction

Vluchtige organische stoffen (VOS) uit biologische monsters hebben een onbekende oorsprong. VOC's kunnen afkomstig zijn van de gastheer of verschillende organismen uit de microbiële gemeenschap van de gastheer. Om de oorsprong van microbiële VOC's te ontrafelen, werden vluchtige headspace-analyse van bacteriële mono- en coculturen van Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa en Acinetobacter baumannii en stabiele isotooponderzoek in biologische monsters van uitwerpselen, speeksel, rioolwater en sputum uitgevoerd. Mono- en coculturen werden gebruikt om vluchtige productie van individuele bacteriesoorten te identificeren of in combinatie met stabiele isotooponderzoek om het actieve metabolisme van microben uit de biologische monsters te identificeren.
Vacuüm-geassisteerde sorptiemiddelextractie (VASE) werd gebruikt om de VOC's te extraheren. VASE is een eenvoudig te gebruiken, gecommercialiseerde, oplosmiddelvrije headspace-extractiemethode voor semi-vluchtige en vluchtige stoffen. Het gebrek aan oplosmiddelen en de bijna-vacuümomstandigheden die tijdens de extractie worden gebruikt, maken het ontwikkelen van een methode relatief eenvoudig en snel in vergelijking met andere extractieopties zoals tert-butylatie en micro-extractie in vaste fase. De hier beschreven workflow werd gebruikt om specifieke vluchtige handtekeningen van mono- en coculturen te identificeren. Bovendien identificeerde analyse van de stabiele isotooponderzoek van menselijke geassocieerde biologische monsters VOS die algemeen of uniek werden geproduceerd. Dit artikel presenteert de algemene workflow en experimentele overwegingen van VASE in combinatie met stabiele isotooponderzoek van levende microbiële culturen.

Mono- en coculturen van S. aureus, P. aeruginosa en A. baumannii De mono- en coculturen bestonden uit de bacteriesoorten S. aureus, P. aeruginosa en A. baumannii. Dit zijn veel voorkomende opportunistische pathogenen die worden aangetroffen in menselijke wonden en chronische infecties. Om de vluchtige moleculen in de mono- en coculturen te identificeren, werd een korte extr...

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Dit protocol beschrijft de extractie van vluchtige organische stoffen uit een biologisch monster met de vacuümondersteunde sorptiemiddelextractiemethode, gaschromatografie in combinatie met massaspectrometrie met behulp van de Entech Sample Preparation Rail en data-analyse. Het beschrijft ook de kweek van biologische monsters en stabiele isotooponderzoek.

Het vastleggen van actief geproduceerde microbiële vluchtige organische stoffen uit mens-geassocieerde monsters met vacuümondersteunde sorptie-extractie

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Dit protocol stelt ons in staat om vluchtige metabolieten en actief geproduceerde vluchtige stoffen uit microbiële organismen in verschillende biologische monsters gemakkelijk te concentreren en te identificeren. VASE is een gebruiksvriendelijkere methode om vluchtige stoffen met een lage abundantie te concentreren. Het enige wat je nodig hebt is een monster onder bijna-vacuüm, en laat de natuurkunde de rest doen.Toegang tot vluchtige analyse van klinische monsters heeft belangrijke implicaties voor de ontdekking van metabole biomarkers in een aantal verschillende ziektetoestanden. De pathogene drijvende kracht en infectie of het succes van antibacteriële therapie kan bijvoorbeeld worden gedetecteerd met vluchtige analyse van speeksel-, sputum- of ademmonsters. Om fecale monsters te bereiden, voegt u gedurende drie minuten een milliliter gedeïoniseerd water toe aan 100 milligram uitwerpselen in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en vortex.Bewaar de monsters op ijs wanneer ze niet in gebruik zijn. Voeg 485 milliliter BHI-medium met 20 millimolaire 13C glucose of BHI met 30% deuterium toe aan 15 microliter fecaal en watermengsel, zodat het uiteindelijke volume van het monster 500 microliter is. Bereid monsters voor in technische drievoud.Om rioolwatermonsters te bereiden, voegt u 500 microliter rioolwater toe aan 500 microliter BHI-medium met 13C glucose of 30% deuterium voor een totaal volume van één milliliter. Bereid monsters in drievoud en bewaar ze op ijs. Om speekselmonsters te bereiden, voegt u 50 microliter speeksel toe aan 500 microliter BHI-medium met 13C glucose of 30% deuterium voor een totaal volume van 550 microliter.Bereid monsters in drievoud en bewaar ze op ijs. Om sputummonsters te bereiden, voegt u 15 microliter sputum toe aan een injectieflacon. Bereid monsters in drievoud en bewaar ze op ijs.Plaats lege VOA-injectieflacons op de koude plaat en plaats de koude plaat op ijs in de bioveiligheidskap. Schakel de 5600 SPEU in en stel deze in op de gewenste temperatuur. Label VOA-injectieflacons van 20 milliliter volgens monsters, replicaties en HSP-ID's met behulp van een waterbestendige marker die bestand is tegen water in het geval condensatie zich vormt aan de buitenkant van de injectieflacon terwijl u op ijs bent.Schroef in de bioveiligheidskap de witte dop op de injectieflacon los, pipetteer snel het monster in de injectieflacon en monteer de dekselvoering, zwarte dop en HSP. Plaats de injectieflacon met het monster en HSP terug op de koude plaat. Zodra alle monsters in de glazen injectieflacons zijn voorbereid, schakelt u de vacuümpomp in, plaatst u de injectieflacons onder vacuüm en verwijdert u de vacuümbron.Controleer de druk na het plaatsen van alle monsters onder vacuüm met behulp van de manometer. Als er een injectieflacon lekt, zorg er dan voor dat de dop goed is vastgeschroefd en dat de witte O-ringen van de HSP- en dekselvoeringen correct op hun plaats zitten. Plaats injectieflacons in de SPEU voor de geoptimaliseerde tijd en temperatuur met roeren bij 200 RPM.Extraheer culturen gedurende een uur bij 70 graden Celsius en extraheer stabiele isotype-tastende experimenten met fecale, rioolwater-, speeksel- en sputummonsters gedurende 18 uur bij 37 graden Celsius. Plaats de koude plaat op min 80 graden Celsius voor gebruik nadat de extractieperiode is voltooid. Wanneer de extractie is voltooid, plaatst u monsters gedurende 15 minuten op de koude plaat om waterdamp uit de HSP- en flaconkopruimte te halen en brengt u de HSP's vervolgens over naar hun mouwen.Stel de volgorde van monsters in op de Entech-software. Open het programma en selecteer 5800 en Volgorde in de opties rechts van het vervolgkeuzemenu Instrument. Sla de volgordetabel op, selecteer Uitvoeren aan de linkerkant en vervolgens Start met leeg in Desorber als de lege HSP niet de desorber is.Houd er rekening mee dat HSP's worden afgehandeld door de SPR voor elk monster in de reeks. Laat de SPR opwarmen. Sta de SPR toe om alle voorbeelden automatisch uit te voeren.De volgorde aan de GC-MS-kant registreert de gegevens automatisch in afzonderlijke bestanden. Voeg een piek toe aan de verwerkingsmethode door Kalibreren te selecteren, gevolgd door Compound bewerken, Naam en Compound invoegen onder Externe standaardsamenstelling. Voeg de naam van de verbindingen, retentietijd en kwantitatief signaaldoelion toe.Voeg de drie grootste pieken toe, waaronder verbindingen met een waarschijnlijkheid van meer dan 75%, zodat de uitlijning van elk identificerend ion van de verbinding in het midden van de piek ligt. Sla het op door OK te selecteren, gevolgd door Methode en Opslaan. Zodra de procesmethode is ingesteld, gaat u verder met Quantitate en Calculate en vervolgens View en QEDIT Quant Result om de gegevens te kwantificeren.Hier werd vacuümondersteunde sorptie-extractie gevolgd door thermische desorptie op een GC-MS om de vluchtige profielen van bacteriële mono- en coculturen te onderzoeken en actief geproduceerde vluchtige stoffen te identificeren met stabiele isotoop die uit menselijke uitwerpselen, speeksel, rioolwater en sputummonsters tast. De mono- en coculturen bestonden uit de bacteriesoorten staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa en acinetobacter baumannii. 43 geannoteerde vluchtige moleculen werden gedetecteerd uit de mono- en coculturen op 24- en 48-uurstijdpunten.Er was meer opname van 13C in volledig gelabelde vluchtige moleculen in vergelijking met het deuterium. 13C werd opgenomen in 2-butanone, 3-hydroxy, 2, 3-butanedione diacetyl, azijnzuur en fenol voor alle fecale, riool- en speekselmonsters. Aceton, butaanzuur en propaanzuur werden gedetecteerd als gelabeld in speeksel en rioolwater.terwijl dimethyltrisulfide en disulfidedimethyl werden verrijkt in zowel fecale als speekselmonsters. De vluchtige stoffen 1-propanol, 2-butanon, benzofenon, ethanol en methylthiolacetaat werden alleen verrijkt in rioolwater en 2, 3-pentanedion in speeksel. Deuterium werd opgenomen in de vluchtige stoffen azijnzuur, benzaldehyde, 4-methyl-dimethyltrisulfide en fenol uit speeksel- of rioolwatermonsters.Azijnzuur, dimethyltrisulfide, aceton en propanol 2-methyl waren overvloediger aanwezig in de gekweekte sputummonsters dan niet-gekweekte sputummonsters. Een gepermuteerde multivariate analyse van varianten, een PERMANOVA, werd uitgevoerd op een Bray-Curtis afstandsmatrix van de vluchtige abundanties van de cystic fibrosis sputum monsters. We ontdekten dat de proefpersoon die de steekproef doneerde 51% van de variatie in 13C-gelabeld gekweekt sputum en 33% van de variatie in ongecultiveerd sputum verklaart.Hier wordt het succes aangetoond van stabiele isotoopetikettering met 13C glucose in vluchtige stoffen uit gekweekte sputummonsters verzameld van zeven mensen met cystische fibrose. Vluchtige stoffen met een hogere 13C-opname voor de meerderheid van de monsters worden getoond in paneel 5A, die met een lager percentage 13C-opname in de meerderheid van sputummonsters bevinden zich in paneel 5B en moleculen met een lagere 13C procent conversie in een minderheid van de sputummonsters worden weergegeven in paneel 5C. Controleer altijd de druk van uw injectieflacon na ongeveer een minuut.Een gebroken vacuüm verslaat de gevoeligheid en snelheid van de VASE-methode. Na deze procedure, als stabiele isotooponderzoek is uitgevoerd, kan het DNA uit het resterende materiaal worden geëxtraheerd om microbiële organismen of soorten te identificeren die mogelijk hebben bijgedragen aan de productie van de vluchtige moleculen. Deze methode is ook nuttig bij het detecteren van vluchtige stoffen uit elk monstertype zonder isotopenonderzoek.Met voordelen van gevoeligheid en laag monstervolume kunnen veel toepassingen profiteren van deze techniek.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Nabootsen van de Functie van de signaaleiwitten: Toward Kunstmatige Signaaltransductie Therapy

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de Bio-laag interferometrie Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blad Spray massaspectrometrie: Een snelle Ambient ionisatie techniek om te beoordelen direct metabolieten van plantaardige weefsels

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Profilering van vluchtige stoffen in zwarte bessenfruit met behulp van Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Absolute kwantificering van inositolpyrosfaten door capillaire elektroforese elektrospray ionisatie massaspectrometrie

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Reconstitutie van Msp1-extractieactiviteit met volledig gezuiverde componenten

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Ultrasoon-geassisteerde extractie van cannabidiolzuur uit cannabisbiomassa

Industrial hemp (Cannabis spp.) has many compounds of interest with potential medical benefits. Of these compounds, cannabinoids have come to the center ...