Name: capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction
Uploaded: 2022-06-01T12:30:00
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Ringraziamo Heather Maughan e Linda M. Kalikin per l'attenta redazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da NIH NHLBI (sovvenzione 5R01HL136647-04).

1. Headspace Sorbent Pen (HSP) e considerazioni sull'analisi del campione
NOTA: L'HSP contenente l'assorbente Tenax TA è stato selezionato per catturare un'ampia gamma di sostanze volatili. Tenax ha un'affinità inferiore per l'acqua rispetto ad altri assorbenti, che gli consente di intrappolare più COV da campioni di umidità più elevata. Tenax ha anche un basso livello di impurità e può essere condizionato per il riutilizzo. La selezione del sorbente è stata effettuata anche in considera...

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-based+and+culture-independent+bacteriologic+analysis+of+cystic+fibrosis+respiratory+specimens.">Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).</li></ol>

Per identificare la produzione volatile in colture in vitro e campioni associati all'uomo, sono state eseguite analisi volatili di mono- e co-colture di P. aeruginosa, S. aureus e A. baumanii e sondaggi isotopici stabili di diversi campioni biologici. Nell'analisi per le mono- e co-colture, i volatili sono stati rilevati eseguendo una breve estrazione per 1 ora a 70 °C. L'analisi volatile di mono- e co-colture ha permesso l'indagine dei composti prodotti sia dalle singole specie che durante l...

I composti organici volatili (COV) sono molto promettenti per il rilevamento e l'identificazione batterica perché sono emessi da tutti gli organismi e diversi microbi hanno firme VOC uniche. Le molecole volatili sono state utilizzate come misura non invasiva per rilevare varie infezioni respiratorie tra cui la broncopneumopatia cronica ostruttiva1, la tubercolosi2 nelle urine3 e la polmonite associata al ventilatore4, oltre a distinguere i soggetti con fibrosi cistica (FC) dai soggetti di controllo sani 5,6. Le firme volatili sono state persino utilizzate per distinguere specifiche infezioni patogene nella FC (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 e S. aureus vs. P. aeruginosa10). Tuttavia, con la complessità di tali campioni biologici, è spesso difficile individuare la fonte di SPECIFICI COV.
Una strategia per districare i profili volatili da più microbi infettanti è quella di eseguire l'analisi dello spazio di testa dei microrganismi sia in mono- che in co-coltura11. L'analisi dello spazio di testa esamina gli analiti emessi nello "spazio di testa" sopra un campione piuttosto che quelli incorporati nel campione stesso. I metaboliti microbici sono stati spesso caratterizzati in monocolture a causa della difficoltà nel determinare l'origine dei metaboliti microbici in campioni clinici complessi. Profilando i volatili da monocolture batteriche, i tipi di sostanze volatili che un microbo produce in vitro possono rappresentare una linea di base del suo repertorio volatile. La combinazione di colture batteriche, ad esempio la creazione di co-colture e la profilazione delle molecole volatili prodotte possono rivelare le interazioni o l'alimentazione incrociata tra i batteri12.
Un'altra strategia per identificare l'origine microbica delle molecole volatili è quella di fornire una fonte di nutrienti etichettata con un isotopo stabile. Gli isotopi stabili sono forme naturali, non radioattive, di atomi con un diverso numero di neutroni. In una strategia che è stata utilizzata fin dai primi anni 1930 per tracciare il metabolismo attivo negli animali13, il microrganismo si nutre della fonte di nutrienti etichettata e incorpora l'isotopo stabile nelle sue vie metaboliche. Più recentemente, un isotopo stabile sotto forma di acqua pesante (D2O) è stato utilizzato per identificare S. aureus metabolicamente attivo in un campione clinico di espettorato CF14. In un altro esempio, 13glucosio marcato con C sono stati utilizzati per dimostrare l'alimentazione incrociata di metaboliti tra isolati clinici CF di P. aeruginosa e Rothia mucilaginosa12 .
Con l'avanzamento delle tecniche di spettrometria di massa, i metodi per rilevare segnali volatili si sono spostati da osservazioni qualitative a misurazioni più quantitative. Utilizzando la spettrometria di massa per gascromatografia (GC-MS), l'elaborazione di campioni biologici è diventata a portata di mano per la maggior parte dei laboratori o delle impostazioni cliniche. Molti metodi per esaminare le molecole volatili sono stati utilizzati per profilare campioni come cibo, colture batteriche e altri campioni biologici e aria e acqua per rilevare la contaminazione. Tuttavia, diversi metodi comuni di campionamento volatile ad alta produttività richiedono solvente e non vengono eseguiti con i vantaggi forniti dall'estrazione sotto vuoto. Inoltre, per l'analisi 15,16,17,18,19 sono spesso necessari volumi o quantità maggiori (superiori a 0,5 ml) di materiali campionati, sebbene ciò sia specifico del substrato e richieda un'ottimizzazione per ciascun tipo di campione e metodo.
Qui, l'estrazione assorbente assistita da vuoto (VASE) seguita dal desorbimento termico su un GC-MS è stata impiegata per esaminare i profili volatili delle mono- e co-colture batteriche e identificare i volatili prodotti attivamente con sonda isotopica stabile da feci umane, saliva, liquami e campioni di espettorato (Figura 1). Con quantità di campione limitate, i COV sono stati estratti da un minimo di 15 μL di espettorato. Gli esperimenti di indagine isotopica con campioni umani hanno richiesto l'aggiunta di una fonte isotopica stabile, come il glucosio 13C, e mezzi per coltivare la crescita della comunità microbica. La produzione attiva di sostanze volatili è stata identificata come una molecola più pesante da GC-MS. L'estrazione di molecole volatili sotto vuoto statico ha permesso la rilevazione di molecole volatili con maggiore sensibilità 20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Stg Diaph Pump</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-10-20030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL VOA vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5719110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Black Caps with hole, no septum</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-39-76044B</td>
			<td>holds lid liner in place on vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm vial liner for sorbent pens</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-L024S</td>
			<td>allows pens to make a vacuum seal at top of vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>5600-SPES</td>
			<td>5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI) media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation Stofware</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-624 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>122-1364E</td>
			<td>60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexsi sofware</td>
			<td>Dexsi (open source)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace Bundle HS-B01, 120VA</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-B01</td>
			<td>Items for running headspace extraction included in bundle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) - blank</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-T3560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53550-792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-OR-L024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Preparation Rail</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbent pen thermal conditioner</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>3801-SPTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Todd Hewitt (TH) media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1438-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction

I composti organici volatili (COV) provenienti da campioni biologici hanno origini sconosciute. I COV possono provenire dall'ospite o da organismi diversi all'interno della comunità microbica dell'ospite. Per districare l'origine dei COV microbici, sono state eseguite analisi dello spazio di testa volatile di mono- e co-colture batteriche di Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii e sondaggi isotopici stabili in campioni biologici di feci, saliva, acque reflue ed espettorato. Mono- e co-colture sono state utilizzate per identificare la produzione volatile da singole specie batteriche o in combinazione con il sondaggio isotopico stabile per identificare il metabolismo attivo dei microbi dai campioni biologici.
L'estrazione assorbente assistita da vuoto (VASE) è stata impiegata per estrarre i COV. VASE è un metodo di estrazione dello spazio di testa facile da usare, commercializzato e privo di solventi per composti semi-volatili e volatili. La mancanza di solventi e le condizioni di quasi vuoto utilizzate durante l'estrazione rendono lo sviluppo di un metodo relativamente facile e veloce rispetto ad altre opzioni di estrazione come la terz-butilazione e la microestrazione in fase solida. Il flusso di lavoro qui descritto è stato utilizzato per identificare specifiche firme volatili da mono- e co-culture. Inoltre, l'analisi del sondaggio isotopico stabile di campioni biologici associati all'uomo ha identificato COV che sono stati prodotti comunemente o in modo univoco. Questo documento presenta il flusso di lavoro generale e le considerazioni sperimentali di VASE in combinazione con il sondaggio isotopico stabile di colture microbiche vive.

Mono- e co-colture di S. aureus, P. aeruginosa e A. baumannii Le mono- e co-colture consistevano nelle specie batteriche S. aureus, P. aeruginosa e A. baumannii. Questi sono patogeni opportunistici comuni trovati nelle ferite umane e nelle infezioni croniche. Per identificare le molecole volatili presenti nelle mono- e co-colture, è stata eseguita una breve estrazione di 1...

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Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Questo protocollo descrive l'estrazione di composti organici volatili da un campione biologico con il metodo di estrazione assorbente assistita da vuoto, la gascromatografia accoppiata con la spettrometria di massa utilizzando il binario di preparazione del campione Entech e l'analisi dei dati. Descrive anche la coltura di campioni biologici e il sondaggio isotopico stabile.

Cattura di composti organici volatili microbici prodotti attivamente da campioni associati all'uomo con estrazione assorbente assistita da vuoto

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Questo protocollo ci consente di concentrare e identificare facilmente metaboliti volatili e sostanze volatili prodotte attivamente da organismi microbici in una varietà di campioni biologici. VASE è un metodo più user-friendly per concentrare volatili a bassa abbondanza. Tutto ciò di cui hai bisogno è un campione sotto quasi vuoto e lascia che la fisica faccia il resto.L'accesso all'analisi volatile di campioni clinici ha importanti implicazioni per la scoperta di biomarcatori metabolici in una serie di diversi stati patologici. Ad esempio, la guida e l'infezione dell'agente patogeno o il successo della terapia antibatterica potrebbero essere rilevati con l'analisi volatile di saliva, espettorato o campioni di respiro. Per preparare campioni fecali, aggiungere un millilitro di acqua deionizzata a 100 milligrammi di feci in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e vortice per tre minuti.Conservare i campioni su ghiaccio quando non in uso. Aggiungere 485 millilitri di mezzo BHI con glucosio 13C 20 millimolare o BHI con deuterio al 30% a 15 microlitri di miscela fecale e acqua, assicurando che il volume finale del campione sia di 500 microlitri. Preparare campioni in triplicati tecnici.Per preparare i campioni di acque reflue, aggiungere 500 microlitri di acque reflue a 500 microlitri di mezzo BHI con glucosio 13C o deuterio al 30% per un volume totale di un millilitro. Preparare i campioni in triplice copia e tenerli sul ghiaccio. Per preparare i campioni di saliva, aggiungere 50 microlitri di saliva a 500 microlitri di mezzo BHI con glucosio 13C o deuterio al 30% per un volume totale di 550 microlitri.Preparare i campioni in triplice copia e tenerli sul ghiaccio. Per preparare campioni di espettorato, aggiungere 15 microlitri di espettorato in un flaconcino. Preparare i campioni in triplice copia e tenerli sul ghiaccio.Posizionare i flaconcini VOA vuoti sulla piastra fredda e posizionare la piastra fredda sul ghiaccio nella cappa di biosicurezza. Accendere il 5600 SPEU e regolarlo alla temperatura richiesta. Etichettare i flaconcini di VOA da 20 millilitri in base a campioni, repliche e ID HSP utilizzando un marcatore resistente all'acqua che resiste all'acqua nel caso in cui si formi condensa all'esterno del flaconcino mentre si è sul ghiaccio.All'interno della cappa di biosicurezza, svitare il cappuccio bianco sulla fiala, inserire rapidamente il campione di pipetta nel flaconcino e assemblare il coperchio, il cappuccio nero e l'HSP. Riposizionare il flaconcino contenente il campione e l'HSP sulla piastra fredda. Una volta che tutti i campioni sono stati preparati nei flaconcini di vetro, accendere la pompa per vuoto, posizionare i flaconcini sotto vuoto e rimuovere la fonte di vuoto.Ricontrollare la pressione dopo aver posto tutti i campioni sotto vuoto utilizzando il manometro. Se un flaconcino perde, assicurarsi che il cappuccio sia avvitato saldamente e che gli O-ring bianchi dell'HSP e le fodere del coperchio siano correttamente in posizione. Posizionare i flaconcini nello SPEU per il tempo e la temperatura ottimizzati con agitazione a 200 RPM.Estrarre colture per un'ora a 70 gradi Celsius ed estrarre esperimenti di indagine dell'isotipo stabile con campioni fecali, fognari, saliva ed espettorato per 18 ore a 37 gradi Celsius. Posizionare la piastra fredda a meno 80 gradi Celsius per l'uso dopo il periodo di estrazione. Al termine dell'estrazione, posizionare i campioni sulla piastra fredda per 15 minuti per estrarre il vapore acqueo dall'HSP e dallo spazio di testa del flaconcino, quindi trasferire gli HSP nelle loro maniche.Impostare la sequenza di campioni sul software Entech. Apri il programma e seleziona 5800 e Sequenza nelle opzioni a destra del menu a discesa Strumento. Salvate la tabella delle sequenze, selezionate Esegui sul lato sinistro, quindi Inizia con vuoto in Desorber se l'HSP vuoto non è il desorbitore.Si noti che gli HSP verranno gestiti dall'SPR per ogni campione nella sequenza. Lasciare che l'SPR si riscaldi. Consentire all'SPR di eseguire automaticamente tutti i campioni.La sequenza sul lato GC-MS registrerà automaticamente i dati in file separati. Aggiungere un picco al metodo di elaborazione selezionando Calibra seguito da Modifica composto, Nome e Inserisci composto in Composto standard esterno. Aggiungere il nome dei composti, il tempo di ritenzione e lo ione bersaglio del segnale quantitativo.Aggiungi i tre picchi più grandi, che includono composti con una probabilità superiore al 75%, assicurando che l'allineamento di ogni ione identificativo del composto si trovi all'interno del centro del picco. Salvarlo selezionando OK, quindi Metodo e Salva. Una volta impostato il metodo di processo, procedere a Quantitate e Calculate, quindi View e QEDIT Quant Result per quantificare i dati.Qui, l'estrazione assorbente assistita da vuoto è stata seguita dal desorbimento termico su un GC-MS per esaminare i profili volatili delle mono-e-co-colture batteriche e identificare i volatili prodotti attivamente con un sondaggio isotopico stabile da feci umane, saliva, liquami e campioni di espettorato. Le mono-e co-colture consistevano nelle specie batteriche staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa e acinetobacter baumannii. 43 molecole volatili annotate sono state rilevate dalle mono-e co-colture a 24 e 48 ore di tempo.C'era più incorporazione di 13C in molecole volatili completamente etichettate rispetto al deuterio. 13C è stato incorporato in 2-butanone, 3-idrossi, 2, 3-butandione diacetile, acido acetico e fenolo per tutti i campioni fecali, fognari e salivari. L'acetone, l'acido butanoico e l'acido propanoico sono stati rilevati come etichettati nella saliva e nelle acque reflue.mentre il dimetil trisolfuro e il disolfuro dimetile sono stati arricchiti sia in campioni fecali che di saliva. I volatili 1-propanolo, 2-butanone, benzofenone, etanolo e metiltiolo acetato sono stati arricchiti solo nelle acque reflue e 2, 3-pentanedione nella saliva. Il deuterio è stato incorporato nei volatili acido acetico, benzaldeide, 4-metil-dimetil trisolfuro e fenolo da campioni di saliva o acque reflue.L'acido acetico, il dimetil trisolfuro, l'acetone e il propanolo 2-metile erano più abbondanti nei campioni di espettorato coltivati rispetto ai campioni di espettorato non coltivati. Un'analisi multivariata permutata delle varianti, un PERMANOVA, è stata eseguita su una matrice di distanza Bray-Curtis delle abbondanze volatili dai campioni di espettorato della fibrosi cistica. Abbiamo scoperto che il soggetto che ha donato il campione spiega il 51% della variazione nell'espettorato coltivato marcato con 13C e il 33% della variazione nell'espettorato non coltivato.Qui, viene mostrato il successo dell'etichettatura isotopica stabile con glucosio 13C in sostanze volatili da campioni di espettorato in coltura raccolti da sette persone con fibrosi cistica. I volatili che hanno un'incorporazione 13C più alta per la maggior parte dei campioni sono mostrati nel pannello 5A, quelli con incorporazione 13C con percentuale inferiore nella maggior parte dei campioni di espettorato sono nel pannello 5B e le molecole con una conversione percentuale inferiore di 13C in una minoranza dei campioni di espettorato sono mostrate nel pannello 5C. Ricontrolla sempre le pressioni del flaconcino dopo circa un minuto.Un vuoto rotto sconfigge la sensibilità e la velocità del metodo VASE. Seguendo questa procedura, se è stato eseguito il sondaggio isotopico stabile, il DNA può essere estratto dal materiale rimanente per identificare organismi microbici o specie che potrebbero aver contribuito alla produzione delle molecole volatili. Questo metodo è utile anche per rilevare sostanze volatili da qualsiasi tipo di campione senza sonda isotopica.Con i vantaggi della sensibilità e del basso volume del campione, molte applicazioni possono trarre vantaggio da questa tecnica.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

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Ricerca

Biochimica

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