Name: capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction
Uploaded: 2022-06-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

ヘザー・モーガンとリンダ・M・カリキンに、この原稿を慎重に編集してくれたことに感謝します。この研究はNIH NHLBIの支援を受けた(助成金5R01HL136647-04)。

1. ヘッドスペース吸着ペン(HSP)とサンプル分析の考慮事項
注:吸着剤テナックスTAを含むHSPは、広範囲の揮発性物質を捕捉するために選択された。テナックスは、他の吸着剤と比較して水に対する親和性が低いため、水分の高いサンプルからより多くのVOCを捕捉することができます。テナックスはまた、不純物のレベルが低く、再利用のために調整することができます。吸?...

<ol>
	<li>Van Berkel, J. J. B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+profile+of+volatile+organic+compounds+in+breath+discriminates+COPD+patients+from+controls.">A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls.</a> Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).</li><li>Nakhleh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+active+pulmonary+tuberculosis+with+a+breath+test+using+nanomaterial-based+sensors.">Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors.</a> European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).</li><li>Lim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+diagnosis+of+tuberculosis+from+analysis+of+urine+volatile+organic+compounds.">Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds.</a> ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).</li><li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+volatile+organic+compounds+in+exhaled+breath+to+diagnose+ventilator-associated+pneumonia.">Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia.</a> Scientific Reports. 5, 17179 (2015).</li><li>Paff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+molecular+profiles+in+the+assessment+of+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia.">Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).</li><li>Robroeks, C. M. H. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+volatile+organic+compounds+in+cystic+fibrosis+patients+and+controls.">Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls.</a> Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).</li><li>Neerincx, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+cyanide+emission+in+the+lung+by+Staphylococcus+aureus.">Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus.</a> European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).</li><li>Goeminne, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+sputum+headspace+through+volatile+organic+compound+analysis.">Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis.</a> Respiratory Research. 13, 87 (2012).</li><li>Joensen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+breath+analysis+using+Electronic+Nose+in+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia+patients+with+chronic+pulmonary+infections.">Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections.</a> PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).</li><li>Nasir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+molecules+from+bronchoalveolar+lavage+fluid+can+'rule-in'+Pseudomonas+aeruginosa+and+'rule-out'+Staphylococcus+aureus+infections+in+cystic+fibrosis+patients.">Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients.</a> Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).</li><li>Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatiles+in+inter-specific+bacterial+interactions.">Volatiles in inter-specific bacterial interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).</li><li>Gao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+polymicrobial+metabolism+in+cystic+fibrosis+airways:+Pseudomonas+aeruginosa+metabolism+and+physiology+are+influenced+by+Rothia+mucilaginosa-derived+metabolites.">Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites.</a> mSphere. 3 (2), 00151 (2018).</li><li>Schoenheimer, R., Rittenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deuterium+as+an+indicator+in+the+study+of+intermediary+metabolism.">Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism.</a> Science. 82 (2120), 156-157 (1935).</li><li>Neubauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+application+of+microbial+lipids+as+tracers+of+Staphylococcus+aureus+growth+rates+in+cystic+fibrosis+sputum.">Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).</li><li>Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GC-MS+analysis+of+ethanol+and+other+volatile+compounds+in+micro-volume+blood+samples-quantifying+neonatal+exposure.">GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).</li><li>Mayor, A. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+sample+preparation+for+direct+SPME-GC-MS+analysis+of+murine+and+human+faecal+volatile+organic+compounds+for+metabolomic+studies.">Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies.</a> Journal of Analytical &amp; Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).</li><li>Camarasu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headspace+SPME+method+development+for+the+analysis+of+volatile+polar+residual+solvents+by+GC-MS.">Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).</li><li>Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer+volatile+analysis:+optimization+of+HS/SPME+coupled+to+GC/MS/FID.">Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID.</a> Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).</li><li>Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+headspace+solid-phase+dynamic+extraction+to+analyse+the+volatile+fraction+of+food+matrices.">Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices.</a> Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).</li><li>Trujillo-Rodr&#237;guez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuum-assisted+sorbent+extraction:+An+analytical+methodology+for+the+determination+of+ultraviolet+filters+in+environmental+samples.">Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples.</a> Talanta. 208, 120390 (2020).</li><li>Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+algae-based+treatment+of+herbicide-contaminated+groundwater.">Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater.</a> Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).</li><li>Psillakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+vacuum:+an+emerging+experimental+parameter+to+consider+during+headspace+microextraction+sampling.">The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+daily+dynamics+of+cystic+fibrosis+airway+microbiota+during+clinical+stability+and+at+exacerbation.">The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation.</a> Microbiome. 3, 12 (2015).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Mahboubi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-based+and+culture-independent+bacteriologic+analysis+of+cystic+fibrosis+respiratory+specimens.">Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).</li></ol>

インビトロ培養物およびヒト関連サンプルにおける揮発性産生を同定するために、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、およびA.バウマニイの単一および共培養物の揮発性分析、ならびに異なる生物学的サンプルの安定同位体プロービングが行われた。モノ培養および共培養についての分析において、揮発分は、70°Cで1時間の短い抽出を行うことにより検出された。 単一および共培?...

揮発性有機化合物(VOC)は、すべての生物から放出され、異なる微生物が固有のVOCシグネチャを有するため、細菌の検出と同定に大きな期待を寄せています。揮発性分子は、嚢胞性線維症(CF)を有する被験者と健常対照者5,6を区別することに加えて、慢性閉塞性肺疾患1、尿中結核2、人工呼吸器関連肺炎4を含む様々な呼吸器感染症を検出するための非侵襲的測定として利用されている。揮発性シグネチャは、CFにおける特定の病原体感染(黄色ブドウ球菌7、緑膿菌8、9、および黄色ブドウ球菌対緑膿菌10)を区別するためにも使用されている。 しかし、このような生物学的サンプルの複雑さにより、特定のVOCの発生源を特定することはしばしば困難である。
複数の感染微生物から揮発性プロファイルを解きほぐすための1つの戦略は、単一培養および共培養11の両方において微生物のヘッドスペース分析を行うことである。ヘッドスペース分析は、サンプル自体に埋め込まれた分析物ではなく、サンプルの上の「ヘッドスペース」に放出される分析種を調べます。微生物代謝産物は、複雑な臨床サンプル中の微生物代謝産物の起源を決定することが困難であるため、単一培養においてしばしば特徴付けられてきた。細菌単一培養物から揮発性物質をプロファイリングすることにより、微生物が インビトロで 産生する揮発性物質の種類は、その揮発性レパトアのベースラインを表し得る。細菌培養物を組み合わせること、 例えば、共培養物を作成し、産生される揮発性分子をプロファイリングすることは、細菌12間の相互作用または交配を明らかにし得る。
揮発性分子の微生物起源を同定するための別の戦略は、安定同位体で標識された栄養源を提供することである。安定同位体は、中性子の数が異なる天然に存在する非放射性の原子です。動物13の活性代謝を追跡するために1930年代初頭から利用されてきた戦略では、微生物は標識された栄養源から摂食し、安定同位体を代謝経路に組み込んでいる。より最近では、重水(D2O)の形態の安定同位体が、臨床CF喀痰試料14において代謝的に活性な黄色ブドウ球菌を同定するために使用されている。別の例では、13C標識グルコースが、緑膿菌のCF臨床分離株とRothia mucilaginosaとの間の代謝産物の交差摂食を実証するために用いられている12。
質量分析技術の進歩に伴い、揮発性の手がかりを検出する方法は、定性的な観察からより定量的な測定に移行しました。ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)を使用することにより、生物学的サンプルの処理は、ほとんどの実験室または臨床現場で手の届くところにあります。揮発性分子を調査する多くの方法は、汚染を検出するために、食品、細菌培養物、およびその他の生物学的サンプル、および空気および水などのサンプルをプロファイルするために使用されてきた。しかし、ハイスループットで揮発性サンプリングを行ういくつかの一般的な方法は、溶媒を必要とし、真空抽出によって提供される利点では実行されません。さらに、分析には、より大きな量または量(0.5mLを超える)のサンプリングされた材料がしばしば必要とされますが、これは基質固有であり、サンプルタイプおよび方法ごとに最適化する必要があります。
ここでは、真空支援吸着剤抽出(VASE)とそれに続くGC-MSでの熱脱着を用いて、細菌の単一培養物および共培養物の揮発性プロファイルを調査し、ヒト糞便、唾液、下水、および喀痰サンプルから安定同位体プロービングで積極的に産生された揮発性物質を同定した(図1)。限られたサンプル量で、VOCはわずか15μLの喀痰から抽出されました。ヒト試料を用いた同位体プロービング実験では、微生物群集の増殖を培養するために、13Cグルコースなどの安定同位体源と培地を添加する必要があった。揮発分の活性産生は、GC−MSによってより重い分子として同定された。静的真空下での揮発性分子の抽出により、揮発性分子の検出が感度が向上しました20,21,22。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Stg Diaph Pump</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-10-20030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL VOA vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5719110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Black Caps with hole, no septum</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-39-76044B</td>
			<td>holds lid liner in place on vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm vial liner for sorbent pens</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-L024S</td>
			<td>allows pens to make a vacuum seal at top of vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>5600-SPES</td>
			<td>5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI) media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation Stofware</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-624 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>122-1364E</td>
			<td>60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexsi sofware</td>
			<td>Dexsi (open source)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace Bundle HS-B01, 120VA</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-B01</td>
			<td>Items for running headspace extraction included in bundle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) - blank</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-T3560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53550-792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-OR-L024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Preparation Rail</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbent pen thermal conditioner</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>3801-SPTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Todd Hewitt (TH) media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1438-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction

生体試料由来の揮発性有機化合物(VOC)は起源不明です。VOCは、宿主または宿主の微生物群集内からの異なる生物に由来する可能性がある。微生物VOCの起源を解きほぐすために、 黄色ブドウ球菌、緑膿菌 、および アシネトバクター・バウマンニの細菌単培養および共培養物の揮発性ヘッドスペース分析、ならびに糞便、唾液、下水、および痰の生物学的サンプルにおける安定同位体プロービングが行われた。単一培養および共培養物を使用して、個々の細菌種からの揮発性産生を同定するか、または安定同位体プロービングと組み合わせて、生物学的サンプルからの微生物の活性代謝を同定した。
VOCsを抽出するために真空支援吸着剤抽出(VASE)が用いられた。VASEは、半揮発性および揮発性化合物用の使いやすく、商業化された無溶媒ヘッドスペース抽出法です。抽出時に使用される溶媒の不足および真空に近い条件により、 tert-ブチル化および固相マイクロ抽出などの他の抽出オプションと比較して、方法の開発が比較的容易かつ迅速に行われる。ここで説明するワークフローは、単一および共同カルチャからの特定の揮発性シグネチャを識別するために使用されました。さらに、ヒト関連生物試料の安定同位体プロービングの分析により、一般的または一意に産生されたVOCが同定された。本稿では、VASEの一般的なワークフローと実験的考察を、生きた微生物培養物の安定同位体プロービングと併せて提示する。

黄色ブドウ球菌、緑膿菌、A.バウマンニの単一および共培養 単一および共培養は、細菌種 S. aureus、P. aeruginosa、 および A. baumanniiで構成されていた。これらは、ヒトの創傷および慢性感染症に見られる一般的な日和見病原体である。モノカルチャーおよび共培養物中に存在する揮?...

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

このプロトコルは、真空支援吸着剤抽出法、Entechサンプル調製レールを使用した質量分析と組み合わせたガスクロマトグラフィー、およびデータ分析による生体サンプルからの揮発性有機化合物の抽出を記述しています。また、生物学的サンプルの培養および安定同位体プロービングについても記載する。

真空支援吸着剤抽出によるヒト関連サンプルからの活発に生産された微生物揮発性有機化合物の捕捉

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

このプロトコルにより、さまざまな生物学的サンプル中の微生物生物から揮発性代謝産物および積極的に産生された揮発性物質を容易に濃縮および同定することができます。VASEは、低存在量の揮発性物質を濃縮するよりユーザーフレンドリーな方法です。必要なのは、ほぼ真空下のサンプルだけで、残りは物理学に任せてください。臨床サンプルの揮発性分析へのアクセスは、多くの異なる疾患状態における代謝バイオマーカーの発見に重要な意味を持ちます。例えば、病原体の運転と感染、または抗菌療法の成功は、唾液、喀痰、または呼気サンプルの揮発性分析によって検出することができます。糞便サンプルを調製するには、1.5ミリリットルの微量遠心管内の100ミリグラムの糞便に1ミリリットルの脱イオン水を加え、3分間渦巻きます。使用しないときは、サンプルを氷の上に保管してください。20ミリモルの13Cグルコースを含む485ミリリットルのBHI培地または30%重水素を含むBHI培地を15マイクロリットルの糞便および水の混合物に加え、サンプルの最終体積が500マイクロリットルになるようにする。技術的な3連でサンプルを準備します。下水サンプルを調製するには、13Cグルコースまたは30%重水素を含む500マイクロリットルのBHI培地に500マイクロリットルの下水を加え、総容量を1ミリリットルにする。サンプルを3連で準備し、氷の上に保管します。唾液サンプルを調製するには、500マイクロリットルの唾液を13Cグルコースまたは30%重水素を含む500マイクロリットルのBHI培地に加え、総容量550マイクロリットルにする。サンプルを3連で準備し、氷の上に保管します。喀痰サンプルを調製するには、15マイクロリットルの喀痰をバイアルに加える。サンプルを3連で準備し、氷の上に保管します。空のVOAバイアルをコールドプレートの上に置き、コールドプレートをバイオセーフティフードの氷の上に置きます。5600 SPEU の電源をオンにし、必要な温度に調整します。20ミリリットルのVOAバイアルに、氷上でバイアルの外側に結露が生じた場合に備えて水に抵抗する耐水性マーカーを使用して、サンプル、複製、およびHSP IDに従ってラベルを付けます。バイオセーフティフードの内側で、バイアルの白いキャップを緩め、サンプルをバイアルに素早くピペットし、蓋ライナー、ブラックキャップ、HSPを組み立てます。サンプルとHSPを含むバイアルをコールドプレートに戻します。すべてのサンプルをガラスバイアルに調製したら、真空ポンプをオンにし、バイアルを真空下に置き、真空源を取り外します。圧力計を使用してすべてのサンプルを真空下に置いた後、圧力を再確認してください。バイアルが漏れている場合は、キャップがしっかりとねじ込まれていること、およびHSPライナーと蓋ライナーの白いOリングが正しく固定されていることを確認してください。バイアルをSPEUに入れ、200RPMでの攪拌で時間と温度を最適化します。培養物を摂氏70度で1時間抽出し、糞便、下水、唾液、および喀痰サンプルを用いて37°Cで18時間安定アイソタイププロービング実験を抽出する。コールドプレートをマイナス80°Cに置き、抽出期間が完了した後に使用します。抽出が完了したら、サンプルをコールドプレート上に15分間置いてHSPとバイアルのヘッドスペースから水蒸気を引き出し、HSPをスリーブに移します。Entechソフトウェアでサンプルのシーケンスを設定します。プログラムを開き、[計測器]ドロップダウンメニューの右側にあるオプションで[5800]と[シーケンス]を選択します。シーケンス テーブルを保存し、左側の [実行] を選択し、空の HSP がデソーバーでない場合は、[デソーバーで空白から開始] を選択します。HSPは、シーケンス内の各サンプルについてSPRによって処理されることに注意してください。SPR をウォームアップさせます。SPR がすべてのサンプルを自動的に実行できるようにします。GC-MS側のシーケンスは、自動的にデータを別々のファイルに記録します。処理方法にピークを追加するには、[キャリブレーション]を選択し、[外部標準化合物]の下にある[化合物の編集]、[名前]、[化合物の挿入]を選択します。化合物の名前、保持時間、および量子シグナルターゲットイオンを追加します。75%を超える確率を持つ化合物を含む3つの最大のピークを追加し、化合物の各識別イオンのアライメントがピークの中心内にあることを確認します。[OK] を選択して保存し、[方法] と [保存] を選択します。プロセスメソッドを設定したら、定量化と計算に進み、次に定量結果の表示とQEDITに進み、データを定量化します。ここでは、真空支援吸着剤抽出に続いてGC-MS上で熱脱着を行い、細菌の単一および共培養物の揮発性プロファイルを調査し、ヒト糞便、唾液、下水、および喀痰サンプルから安定同位体プロービングで積極的に産生された揮発性物質を同定した。単一および共培養は、細菌種黄色ブドウ球菌、緑膿菌、およびアシネトバクターバウマンニからなっていた。43個の注釈付き揮発性分子が、24時間および48時間の時点でモノ培養および共培養物から検出された。重水素と比較して、完全に標識された揮発性分子への13Cの取り込みが多かった。13Cは、すべての糞便、下水、および唾液サンプルの2-ブタノン、3-ヒドロキシ、2,3-ブタンジオンジアセチル、酢酸、およびフェノールに取り込まれた。アセトン、ブタン酸、およびプロパン酸は、唾液および下水中で標識として検出された。一方、ジメチルトリスルフィドおよびジメチルジスルフィドは、糞便および唾液サンプルの両方で富化されていた。揮発分1−プロパノール、2−ブタノン、ベンゾフェノン、エタノール、および酢酸メチルチオールは下水中にのみ富化され、2,3−ペンタンジオンは唾液中に富化された。重水素は、唾液または下水サンプルのいずれかから揮発性酢酸、ベンズアルデヒド、4-メチルジメチルトリスルフィド、およびフェノールに取り込まれた。酢酸、三硫化ジメチル、アセトン、およびプロパノール2-メチルは、培養喀痰サンプルよりも培養喀痰サンプル中に多く含まれていた。変異体であるPERMANOVAの順列多変量解析を、嚢胞性線維症喀痰サンプルからの揮発性存在量のBray-Curtis距離行列について実施した。サンプルを寄贈した被験者は、13C標識培養喀痰の変動の51%、未培養喀痰の変動の33%を説明していることがわかりました。ここでは、嚢胞性線維症を有する7人から採取した培養喀痰試料からの揮発分中の13Cグルコースによる安定同位体標識の成功が示される。大多数のサンプルについてより高い13Cの取り込みを有する揮発性物質をパネル5Aに示し、大多数の喀痰サンプルにおいてより低いパーセントの13Cの取り込みを有するものをパネル5Bに示し、そして少数の喀痰サンプルにおいてより低い13Cパーセントの変換を有する分子をパネル5Cに示す。常に約1分後にバイアルの圧力を再確認してください。真空が壊れると、VASE法の感度と速度が損なわれます。この手順に続いて、安定同位体プロービングが実施された場合、残りの材料からDNAを抽出して、揮発性分子の産生に寄与した可能性のある微生物生物または種を同定することができる。この方法は、同位体プロービングなしで任意のサンプルタイプから揮発性物質を検出する場合にも有用である。感度とサンプル量が少ないという利点により、多くのアプリケーションがこの手法の恩恵を受けることができます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

シグナル伝達タンパク質の機能を模倣：人工シグナル伝達療法に向けて

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

多量-PAGE：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

ヒト僧帽弁からのタンパク質抽出のための最適化プロトコル

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

バイオ層干渉法による小分子とイオン チャネル蛋白質の相互作用の動力学をキャプチャ

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

リーフ スプレー質量分析: 植物組織由来の代謝産物を直接評価するの急速な周囲のイオン化法

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

ヘッドスペース固相微小抽出を用いたブラックカラントフルーツの揮発性化合物のガスクロマトグラフィー-質量分析法のプロファイリング

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

キャピラリー電気泳動エレクトロスプレーイオン化質量分析によるイノシトールピロリン酸の絶対定量(英語)

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

完全精製成分を用いたMsp1抽出活性の再構成

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

大麻バイオマスからのカンナビジオール酸の超音波支援抽出

Industrial hemp (Cannabis spp.) has many compounds of interest with potential medical benefits. Of these compounds, cannabinoids have come to the center ...