Name: capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction
Uploaded: 2022-06-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

이 원고를 신중하게 편집해 주신 Heather Maughan과 Linda M. Kalikin에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH NHLBI (보조금 5R01HL136647-04)가 지원했습니다.

1. 헤드스페이스 흡착펜(HSP) 및 샘플 분석 고려 사항
참고: 흡착제 Tenax TA를 함유하는 HSP는 광범위한 휘발성 물질을 포획하기 위해 선택되었다. Tenax는 다른 흡착제에 비해 물에 대한 친화력이 낮기 때문에 수분이 높은 샘플에서 더 많은 VOC를 포획 할 수 있습니다. Tenax는 또한 불순물 수준이 낮으며 재사용을 위해 컨디셔닝 될 수 있습니다. 흡착제 선택은 또한 GC-MS에 설치된 컬럼?...

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	<li>Van Berkel, J. J. B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+profile+of+volatile+organic+compounds+in+breath+discriminates+COPD+patients+from+controls.">A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls.</a> Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).</li><li>Nakhleh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+active+pulmonary+tuberculosis+with+a+breath+test+using+nanomaterial-based+sensors.">Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors.</a> European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).</li><li>Lim, S. 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M. H. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+volatile+organic+compounds+in+cystic+fibrosis+patients+and+controls.">Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls.</a> Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).</li><li>Neerincx, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+cyanide+emission+in+the+lung+by+Staphylococcus+aureus.">Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus.</a> European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).</li><li>Goeminne, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+sputum+headspace+through+volatile+organic+compound+analysis.">Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis.</a> Respiratory Research. 13, 87 (2012).</li><li>Joensen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+breath+analysis+using+Electronic+Nose+in+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia+patients+with+chronic+pulmonary+infections.">Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections.</a> PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).</li><li>Nasir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+molecules+from+bronchoalveolar+lavage+fluid+can+'rule-in'+Pseudomonas+aeruginosa+and+'rule-out'+Staphylococcus+aureus+infections+in+cystic+fibrosis+patients.">Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients.</a> Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).</li><li>Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatiles+in+inter-specific+bacterial+interactions.">Volatiles in inter-specific bacterial interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).</li><li>Gao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+polymicrobial+metabolism+in+cystic+fibrosis+airways:+Pseudomonas+aeruginosa+metabolism+and+physiology+are+influenced+by+Rothia+mucilaginosa-derived+metabolites.">Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites.</a> mSphere. 3 (2), 00151 (2018).</li><li>Schoenheimer, R., Rittenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deuterium+as+an+indicator+in+the+study+of+intermediary+metabolism.">Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism.</a> Science. 82 (2120), 156-157 (1935).</li><li>Neubauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+application+of+microbial+lipids+as+tracers+of+Staphylococcus+aureus+growth+rates+in+cystic+fibrosis+sputum.">Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).</li><li>Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GC-MS+analysis+of+ethanol+and+other+volatile+compounds+in+micro-volume+blood+samples-quantifying+neonatal+exposure.">GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).</li><li>Mayor, A. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+sample+preparation+for+direct+SPME-GC-MS+analysis+of+murine+and+human+faecal+volatile+organic+compounds+for+metabolomic+studies.">Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies.</a> Journal of Analytical &amp; Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).</li><li>Camarasu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headspace+SPME+method+development+for+the+analysis+of+volatile+polar+residual+solvents+by+GC-MS.">Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).</li><li>Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer+volatile+analysis:+optimization+of+HS/SPME+coupled+to+GC/MS/FID.">Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID.</a> Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).</li><li>Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+headspace+solid-phase+dynamic+extraction+to+analyse+the+volatile+fraction+of+food+matrices.">Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices.</a> Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).</li><li>Trujillo-Rodr&#237;guez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. 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A., Dahab, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+algae-based+treatment+of+herbicide-contaminated+groundwater.">Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater.</a> Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).</li><li>Psillakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+vacuum:+an+emerging+experimental+parameter+to+consider+during+headspace+microextraction+sampling.">The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+daily+dynamics+of+cystic+fibrosis+airway+microbiota+during+clinical+stability+and+at+exacerbation.">The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation.</a> Microbiome. 3, 12 (2015).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Mahboubi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-based+and+culture-independent+bacteriologic+analysis+of+cystic+fibrosis+respiratory+specimens.">Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).</li></ol>

시험관내 배양 및 인간 관련 샘플에서의 휘발성 생산을 확인하기 위해, P. aeruginosa, S. aureus 및 A. baumanii의 모노- 및 공동 배양물의 휘발성 분석 및 상이한 생물학적 샘플의 안정한 동위원소 프로빙을 수행하였다. 모노- 및 공동-배양물에 대한 분석에서, 휘발성 물질은 70°C에서 1시간 동안 짧은 추출을 수행하여 검출되었다. 모노 및 공동 배양의 휘발성 분석은 개별 종에 의해 그?...

휘발성 유기 화합물 (VOCs)은 모든 유기체에서 방출되기 때문에 박테리아 검출 및 식별에 큰 약속을 가지고 있으며, 다른 미생물은 고유 한 VOC 서명을 가지고 있습니다. 휘발성 분자는 만성 폐쇄성 폐 질환1, 소변3의 결핵2, 인공호흡기 관련 폐렴4를 포함한 다양한 호흡기 감염을 검출하기 위한 비침습적 측정으로서 활용되었으며, 낭포성 섬유증(CF)을 가진 피험자를 건강한 대조군 피험자(5,6)와 구별하는 것 이외에 활용되었다. 휘발성 서명은 심지어 CF에서 특정 병원체 감염을 구별하기 위해 사용되었다 (스타필로코커스 아우레우스 7, 슈도모나스 aeruginosa 8,9, 및 S. 아우레우스 대 P. aeruginosa10). 그러나, 이러한 생물학적 샘플의 복잡성으로 인해, 특정 VOC의 공급원을 정확히 찾아내는 것은 종종 어렵다.
다수의 감염 미생물로부터 휘발성 프로파일을 분리하기 위한 하나의 전략은 모노- 및 공동-배양11 둘 다에서 미생물의 헤드스페이스 분석을 수행하는 것이다. 헤드스페이스 분석은 샘플 자체에 포함된 분석물이 아닌 샘플 위의 "헤드스페이스"로 방출되는 분석물을 검사합니다. 미생물 대사 산물은 종종 복잡한 임상 샘플에서 미생물 대사 산물의 기원을 결정하는 데 어려움이 있기 때문에 단일 배양에서 특성화되었습니다. 박테리아 모노 배양물로부터의 휘발성 물질을 프로파일링함으로써, 미생물이 시험관내에서 생성하는 휘발성 물질의 유형은 그의 휘발성 레퍼토리의 기준선을 나타낼 수 있다. 박테리아 배양물을 결합, 예를 들어, 공동 배양물을 생성하고, 생성된 휘발성 분자를 프로파일링하는 것은 박테리아(12) 사이의 상호작용 또는 교차-공급을 나타낼 수 있다.
휘발성 분자의 미생물 기원을 확인하기 위한 또 다른 전략은 안정한 동위원소로 표지되는 영양 공급원을 제공하는 것이다. 안정한 동위원소는 자연적으로 발생하며, 중성자의 수가 다른 원자의 비방사성 형태이다. 1930년대 초부터 동물(13)의 활성 대사를 추적하기 위해 활용되어 온 전략에서, 미생물은 라벨이 붙은 영양원을 떼어내고 안정적인 동위원소를 대사 경로에 통합한다. 보다 최근에, 중수 형태의 안정한 동위원소 (D2O)가 임상 CF 객담 샘플14에서 대사적으로 활성인 S. 아우레우스를 확인하기 위해 사용되었다. 또 다른 예에서, 13C표지된 글루코스는 P. aeruginosa와 Rothia mucilaginosa12의 CF 임상 단리물 사이의 대사산물의 교차 공급을 입증하는데 사용되었다.
질량 분광법 기술의 발전과 함께, 휘발성 신호를 검출하는 방법은 질적 관찰에서 더 정량적 측정으로 옮겨갔습니다. 가스 크로마토그래피 질량 분광법 (GC-MS)을 사용함으로써 생물학적 샘플의 처리는 대부분의 실험실 또는 임상 환경에서 도달 할 수있게되었습니다. 휘발성 분자를 조사하기 위한 많은 방법들이 오염을 검출하기 위해 식품, 박테리아 배양물, 및 다른 생물학적 샘플, 및 공기 및 물과 같은 샘플을 프로파일링하는데 사용되어 왔다. 그러나, 높은 처리량을 갖는 휘발성 샘플링의 몇몇 일반적인 방법은 용매를 필요로 하며, 진공 추출에 의해 제공되는 이점으로 수행되지 않는다. 또한 분석 15,16,17,18,19에 더 많은 부피 또는 양(0.5mL 초과)의 샘플링된 물질이 필요한 경우가 많지만, 이는 기판에 따라 다르며 각 샘플 유형 및 방법에 대한 최적화가 필요합니다.
여기서, GC-MS 상에서 열 탈착에 이어 진공 보조 흡착제 추출(VASE)을 사용하여 박테리아 모노 및 공동 배양물의 휘발성 프로파일을 조사하고 인간 분변, 타액, 하수 및 객담 샘플로부터 안정한 동위원소 프로빙을 갖는 활발하게 생성된 휘발성 물질을 확인했다(도 1). 제한된 샘플 수량으로, VOCs는 가래의 최소 15 μL에서 추출되었다. 인간 샘플을 이용한 동위원소 프로빙 실험은 미생물 군집의 성장을 육성하기 위해 13C글루코스와 같은 안정한 동위원소 공급원 및 배지를 첨가하는 것이 필요했습니다. 휘발성 물질의 활성 생산은 GC-MS에 의해 더 무거운 분자로 확인되었다. 정적 진공 하에서 휘발성 분자를 추출하면 감도가 증가한 휘발성 분자를 검출할 수 있었습니다20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Stg Diaph Pump</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-10-20030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL VOA vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5719110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Black Caps with hole, no septum</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-39-76044B</td>
			<td>holds lid liner in place on vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm vial liner for sorbent pens</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-L024S</td>
			<td>allows pens to make a vacuum seal at top of vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>5600-SPES</td>
			<td>5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI) media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation Stofware</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-624 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>122-1364E</td>
			<td>60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexsi sofware</td>
			<td>Dexsi (open source)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace Bundle HS-B01, 120VA</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-B01</td>
			<td>Items for running headspace extraction included in bundle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) - blank</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-T3560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53550-792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-OR-L024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Preparation Rail</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbent pen thermal conditioner</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>3801-SPTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Todd Hewitt (TH) media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1438-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction

생물학적 샘플로부터의 휘발성 유기 화합물(VOC)은 기원을 알 수 없다. VOCs는 숙주의 미생물 군집 내에서 숙주 또는 상이한 유기체로부터 기원할 수 있다. 미생물 VOCs의 기원을 분리하기 위해, 스타필로코커스 아우레우스, 슈도모나스 aeruginosa , 및 Acinetobacter baumannii의 박테리아 모노 및 공동 배양의 휘발성 헤드 스페이스 분석, 및 배설물, 타액, 하수 및 객담의 생물학적 샘플에서 안정한 동위원소 프로빙을 수행하였다. 모노- 및 공동-배양물을 사용하여 개별 박테리아 종으로부터의 휘발성 생산을 확인하거나 생물학적 샘플로부터 미생물의 활성 대사를 확인하기 위해 안정한 동위원소 프로빙과 조합하였다.
진공-보조 흡착제 추출(VASE)을 사용하여 VOCs를 추출하였다. VASE는 반휘발성 및 휘발성 화합물에 대한 사용하기 쉽고 상용화되고 무용제 헤드스페이스 추출 방법입니다. 추출 중에 사용되는 용매의 부족과 거의 진공 조건은 tert-butylation 및 고상 미세 추출과 같은 다른 추출 옵션과 비교할 때 상대적으로 쉽고 빠른 방법을 개발할 수있게합니다. 여기에 설명된 워크플로는 모노 및 공동 문화권의 특정 휘발성 서명을 식별하는 데 사용되었습니다. 또한, 인간 관련 생물학적 샘플의 안정한 동위원소 프로빙의 분석은 일반적으로 또는 고유하게 생산되는 VOC를 확인했다. 이 백서는 살아있는 미생물 배양물의 안정적인 동위원소 조사와 함께 ASE의 일반적인 워크 플로우 및 실험 고려 사항을 제시합니다.

S. aureus, P. aeruginosa, A. baumannii의 모노 및 공동 문화 모노 및 공동 배양은 박테리아 종 S. aureus, P. aeruginosa, 및 A. baumannii로 구성되었다. 이들은 인간의 상처와 만성 감염에서 발견되는 일반적인 기회 주의적 병원체입니다. 모노- 및 공동-배양물에 존재하는 휘발성 분자를 확인하기 위해, 2...

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Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

이 프로토콜은 진공 보조 흡착제 추출 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 휘발성 유기 화합물을 추출하는 방법, Entech 샘플 준비 레일을 사용한 질량 분광법과 결합 된 가스 크로마토그래피 및 데이터 분석을 설명합니다. 또한 생물학적 샘플 및 안정한 동위원소 프로빙의 배양을 기술한다.

진공 보조 흡착제 추출을 통해 인간 관련 샘플에서 활발히 생산된 미생물 휘발성 유기 화합물 포획

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

이 프로토콜을 통해 우리는 휘발성 대사 산물을 쉽게 농축하고 식별 할 수 있으며 다양한 생물학적 샘플에서 미생물 유기체에서 휘발성 물질을 적극적으로 생산할 수 있습니다. VASE는 저풍부 휘발성 물질을 집중시키는 사용자 친화적 인 방법입니다. 필요한 것은 거의 진공 상태의 샘플이며 물리학이 나머지를 수행하도록하십시오.임상 샘플의 휘발성 분석에 대한 접근은 다수의 상이한 질병 상태에서의 대사 바이오마커 발견에 중요한 함의를 갖는다. 예를 들어, 병원체 운전 및 감염 또는 항균 요법의 성공은 타액, 객담 또는 호흡 샘플의 휘발성 분석으로 검출 될 수 있습니다. 분변 샘플을 준비하려면 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에서 100 밀리그램의 분변에 1 밀리리터의 탈이온수를 넣고 3 분 동안 와류하십시오.사용하지 않을 때는 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 20 밀리몰 13C 포도당 또는 30 % 중수소의 BHI가있는 BHI 배지 485 밀리리터를 분변 및 물 혼합물 15 마이크로 리터에 첨가하여 샘플의 최종 부피가 500 마이크로 리터가되도록하십시오. 기술 삼중으로 샘플을 준비하십시오.하수 샘플을 준비하려면 1 밀리리터의 총 부피에 대해 13C 포도당 또는 30 % 중수소가있는 BHI 배지 500 마이크로 리터에 500 마이크로 리터의 하수를 첨가하십시오. 샘플을 삼중으로 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 타액 샘플을 준비하려면 50 마이크로 리터의 타액을 13C 포도당이있는 BHI 배지 500 마이크로 리터 또는 30 % 중수소에 첨가하여 총 부피 550 마이크로 리터.샘플을 삼중으로 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 가래 샘플을 준비하려면 가래 15 마이크로 리터를 바이알에 넣으십시오. 샘플을 삼중으로 준비하고 얼음 위에 보관하십시오.차가운 접시에 빈 VOA 바이알을 놓고 차가운 접시를 생물 안전 후드의 얼음 위에 놓습니다. 5600 SPEU를 켜고 필요한 온도로 조정하십시오. 샘플, 반복실험 및 HSP ID에 따라 20밀리리터 VOA 바이알에 라벨을 붙이고, 얼음 위에서 바이알 외부에 결로가 형성될 경우 물에 저항하는 내수 마커를 사용합니다.생물 안전 후드 내부에서 바이알의 흰색 캡을 풀고 신속하게 피펫 샘플을 바이알에 넣고 뚜껑 라이너, 블랙 캡 및 HSP를 조립하십시오. 샘플 및 HSP가 들어있는 바이알을 다시 차가운 플레이트 위에 놓습니다. 모든 샘플이 유리 바이알에 준비되면 진공 펌프를 켜고 바이알을 진공 아래에 놓고 진공 소스를 제거하십시오.압력 게이지를 사용하여 모든 샘플을 진공 하에 놓은 후 압력을 다시 확인하십시오. 바이알이 새는 경우 뚜껑이 단단히 조여져 있고 HSP 및 뚜껑 라이너의 흰색 O 링이 올바르게 제자리에 있는지 확인하십시오. 바이알을 200RPM에서 교반하면서 최적화된 시간과 온도를 위해 SPEU에 넣습니다.섭씨 70도에서 1시간 동안 배양물을 추출하고 섭씨 37도에서 18시간 동안 분변, 하수, 타액 및 객담 시료로 안정한 이소타입 프로빙 실험을 추출한다. 추출 기간이 완료된 후 사용하기 위해 차가운 접시를 영하 80도에 놓습니다. 추출이 완료되면 샘플을 차가운 접시에 15 분 동안 올려 HSP 및 바이알 헤드 스페이스에서 수증기를 뽑은 다음 HSP를 슬리브로 옮깁니다.Entech 소프트웨어에서 샘플 시퀀스를 설정합니다. 프로그램을 열고 계측기 드롭다운 메뉴의 오른쪽에 있는 옵션에서 5800 및 시퀀스를 선택합니다. 시퀀스 테이블을 저장하고 왼쪽에서 실행을 선택한 다음 빈 HSP가 탈솔버가 아닌 경우 Desorber에서 공백으로 시작을 선택합니다.HSP는 시퀀스의 각 샘플에 대해 SPR에 의해 처리됩니다. SPR을 예열하십시오. SPR이 모든 샘플을 자동으로 실행하도록 허용합니다.GC-MS 측의 시퀀스는 자동으로 별도의 파일에 데이터를 기록합니다. 보정을 선택한 다음 외부 표준 컴파운드 아래에서 컴파운드, 이름 및 삽입 컴파운드 편집을 선택하여 처리 방법에 피크를 추가합니다. 화합물의 이름, 체류 시간 및 양자 신호 표적 이온을 추가하십시오.75% 이상의 확률을 갖는 화합물을 포함하는 세 개의 가장 큰 피크를 추가하여 화합물의 각 식별 이온의 정렬이 피크의 중심 내에 위치하도록 합니다. 확인을 선택한 다음 방법 및 저장을 선택하여 저장합니다. 프로세스 메소드가 설정되면 정량 및 계산으로 진행한 다음 결과 보기 및 QEDIT 수량 결과로 진행하여 데이터를 정량화합니다.여기에서, 진공 보조 흡착제 추출에 이어 GC-MS에서 열 탈착하여 박테리아 모노 및 공동 배양의 휘발성 프로파일을 조사하고 인간 분변, 타액, 하수 및 객담 샘플로부터 안정한 동위원소 프로빙을 통해 활발히 생산된 휘발성 물질을 확인했다. 모노 및 공동 배양은 박테리아 종 포도상 구균, 슈도모나스 aeruginosa, 및 acinetobacter baumannii로 구성되었습니다. 43개의 주석이 달린 휘발성 분자가 24시간 및 48시간 시점에서 모노- 및 공동-배양물로부터 검출되었다.중수소에 비해 완전히 표지된 휘발성 분자에 13C가 더 많이 혼입되었다. 13C를 모든 분변, 하수 및 타액 샘플에 대해 2-부타논, 3-히드록시, 2,3-부탄디온 디아세틸, 아세트산 및 페놀에 혼입시켰다. 아세톤, 부탄산 및 프로파노산은 타액 및 하수구에서 표지된 것으로 검출되었다.반면 디메틸 트리설파이드 및 디술피드 디메틸은 분변 및 타액 샘플 둘 다에서 풍부하였다. 휘발성 물질을 1-프로판올, 2-부타논, 벤조페논, 에탄올 및 메틸티올 아세테이트는 하수에만 농축하고 타액에서 2,3-펜탄디온을 농축하였다. 중수소는 타액 또는 하수 샘플로부터 휘발성 아세트산, 벤즈알데히드, 4-메틸디메틸트리설파이드 및 페놀에 혼입되었다.아세트산, 디메틸트리설파이드, 아세톤, 및 프로판올 2-메틸은 배양되지 않은 객담 샘플보다 배양된 객담 샘플에서 더 풍부하였다. 변이체, PERMANOVA의 순열 다변량 분석을 낭포성 섬유증 객담 샘플로부터의 휘발성 풍부도의 브레이-커티스 거리 매트릭스 상에서 수행하였다. 우리는 샘플을 기증 한 피험자가 13C 표지 된 배양 객담의 변이의 51 %와 배양되지 않은 가래의 변이의 33 %를 설명한다는 것을 발견했습니다.여기에서, 낭포성 섬유증을 앓고 있는 일곱 명의 사람들로부터 수집된 배양된 객담 샘플로부터의 휘발성 물질에서 13C 글루코스로 안정한 동위원소 표지의 성공이 보여진다. 대부분의 샘플에 대해 더 높은 13C 혼입을 갖는 휘발성 물질은 패널 5A에 도시되어 있고, 대부분의 객담 샘플에서 더 낮은 퍼센트 13C 혼입을 갖는 휘발물질은 패널 5B에 있고, 가래 샘플의 소수에서 더 낮은 13C 퍼센트 변환을 갖는 분자는 패널 5C에 도시되어 있다. 항상 약 분 후에 바이알 압력을 다시 확인하십시오.깨진 진공은 VASE 방법의 감도와 속도를 무너뜨립니다. 이 절차에 따라, 안정한 동위원소 프로빙이 수행되면, DNA는 휘발성 분자의 생산에 기여했을 수 있는 미생물 유기체 또는 종을 확인하기 위해 나머지 물질로부터 추출될 수 있다. 이 방법은 동위원소 프로빙이 없는 모든 샘플 유형으로부터 휘발성 물질을 검출하는데 또한 유용하다.감도와 낮은 샘플 부피의 장점으로 많은 응용 프로그램이이 기술의 이점을 누릴 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

신호 전달 단백질의 기능을 흉내 낸 : 인공 신호 전달 요법을 향해

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

연구

생화학

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

인간 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

바이오-레이어 간섭계 분석 결과 의해 작은 분자와 이온 채널 단백질의 상호 작용 활동을 캡처

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

잎 스프레이 질량 분석: 식물 조직에서 대사를 직접 평가 하는 급속 한 대기 이온화 기술

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

헤드스페이스 고체-위상 미세 추출을 사용하여 블랙커런트 과일의 휘발성 화합물 프로파일링

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

모세관 전기영동 전기분무 이온화 질량분석법에 의한 이노시톨 피로인산염의 절대 정량

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

완전히 정제된 구성 요소로 Msp1 추출 활동의 재구성

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

대마초 바이오 매스에서 칸 나비 디올 산의 초음파 보조 추출

Industrial hemp (Cannabis spp.) has many compounds of interest with potential medical benefits. Of these compounds, cannabinoids have come to the center ...