Name: capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction
Uploaded: 2022-06-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

Vi takker Heather Maughan og Linda M. Kalikin for nøye redigering av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NIH NHLBI (tilskudd 5R01HL136647-04).

1. Hensyn til headspace Sorbent Pen (HSP) og prøveanalyse
MERK: HSP som inneholder den sorbente Tenax TA ble valgt for å fange et bredt spekter av volatiler. Tenax har en lavere affinitet for vann sammenlignet med andre sorbenter, noe som gjør det mulig å fange flere VOCer fra prøver med høyere fuktighet. Tenax har også et lavt nivå av urenheter og kan kondisjoneres for gjenbruk. Sorbentvalg ble også tatt i betraktning med kolonnen installert i GC-MS (se materialtabellen</strong...

<ol>
	<li>Van Berkel, J. J. B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+profile+of+volatile+organic+compounds+in+breath+discriminates+COPD+patients+from+controls.">A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls.</a> Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).</li><li>Nakhleh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+active+pulmonary+tuberculosis+with+a+breath+test+using+nanomaterial-based+sensors.">Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors.</a> European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).</li><li>Lim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+diagnosis+of+tuberculosis+from+analysis+of+urine+volatile+organic+compounds.">Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds.</a> ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).</li><li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+volatile+organic+compounds+in+exhaled+breath+to+diagnose+ventilator-associated+pneumonia.">Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia.</a> Scientific Reports. 5, 17179 (2015).</li><li>Paff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+molecular+profiles+in+the+assessment+of+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia.">Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).</li><li>Robroeks, C. M. H. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+volatile+organic+compounds+in+cystic+fibrosis+patients+and+controls.">Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls.</a> Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).</li><li>Neerincx, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+cyanide+emission+in+the+lung+by+Staphylococcus+aureus.">Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus.</a> European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).</li><li>Goeminne, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+sputum+headspace+through+volatile+organic+compound+analysis.">Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis.</a> Respiratory Research. 13, 87 (2012).</li><li>Joensen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+breath+analysis+using+Electronic+Nose+in+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia+patients+with+chronic+pulmonary+infections.">Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections.</a> PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).</li><li>Nasir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+molecules+from+bronchoalveolar+lavage+fluid+can+'rule-in'+Pseudomonas+aeruginosa+and+'rule-out'+Staphylococcus+aureus+infections+in+cystic+fibrosis+patients.">Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients.</a> Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).</li><li>Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatiles+in+inter-specific+bacterial+interactions.">Volatiles in inter-specific bacterial interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).</li><li>Gao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+polymicrobial+metabolism+in+cystic+fibrosis+airways:+Pseudomonas+aeruginosa+metabolism+and+physiology+are+influenced+by+Rothia+mucilaginosa-derived+metabolites.">Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites.</a> mSphere. 3 (2), 00151 (2018).</li><li>Schoenheimer, R., Rittenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deuterium+as+an+indicator+in+the+study+of+intermediary+metabolism.">Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism.</a> Science. 82 (2120), 156-157 (1935).</li><li>Neubauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+application+of+microbial+lipids+as+tracers+of+Staphylococcus+aureus+growth+rates+in+cystic+fibrosis+sputum.">Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).</li><li>Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GC-MS+analysis+of+ethanol+and+other+volatile+compounds+in+micro-volume+blood+samples-quantifying+neonatal+exposure.">GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).</li><li>Mayor, A. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+sample+preparation+for+direct+SPME-GC-MS+analysis+of+murine+and+human+faecal+volatile+organic+compounds+for+metabolomic+studies.">Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies.</a> Journal of Analytical &amp; Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).</li><li>Camarasu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headspace+SPME+method+development+for+the+analysis+of+volatile+polar+residual+solvents+by+GC-MS.">Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).</li><li>Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer+volatile+analysis:+optimization+of+HS/SPME+coupled+to+GC/MS/FID.">Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID.</a> Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).</li><li>Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+headspace+solid-phase+dynamic+extraction+to+analyse+the+volatile+fraction+of+food+matrices.">Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices.</a> Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).</li><li>Trujillo-Rodr&#237;guez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuum-assisted+sorbent+extraction:+An+analytical+methodology+for+the+determination+of+ultraviolet+filters+in+environmental+samples.">Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples.</a> Talanta. 208, 120390 (2020).</li><li>Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+algae-based+treatment+of+herbicide-contaminated+groundwater.">Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater.</a> Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).</li><li>Psillakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+vacuum:+an+emerging+experimental+parameter+to+consider+during+headspace+microextraction+sampling.">The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+daily+dynamics+of+cystic+fibrosis+airway+microbiota+during+clinical+stability+and+at+exacerbation.">The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation.</a> Microbiome. 3, 12 (2015).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Mahboubi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-based+and+culture-independent+bacteriologic+analysis+of+cystic+fibrosis+respiratory+specimens.">Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).</li></ol>

For å identifisere flyktig produksjon i in vitro-kulturer og human-assosierte prøver, ble det utført flyktig analyse av mono- og samkulturer av P. aeruginosa, S. aureus og A. baumanii og stabil isotopprobing av forskjellige biologiske prøver. I analysen for mono- og samkulturer ble volatiler oppdaget ved å utføre en kort ekstraksjon i 1 time ved 70 °C. Den flyktige analysen av mono- og samkulturer tillot undersøkelsen av forbindelsene produsert både av individuelle arter og under dere...

Flyktige organiske forbindelser (VOC) har stort løfte om bakteriedeteksjon og identifikasjon fordi de slippes ut fra alle organismer, og forskjellige mikrober har unike VOC-signaturer. Flyktige molekyler har blitt brukt som en ikke-invasiv måling for å oppdage ulike luftveisinfeksjoner, inkludert kronisk obstruktiv lungesykdom1, tuberkulose2 i urin3 og respirator-assosiert lungebetennelse4, i tillegg til å skille personer med cystisk fibrose (CF) fra friske kontrollpersoner 5,6. Flyktige signaturer har til og med blitt brukt til å skille spesifikke patogeninfeksjoner i CF (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 og S. aureus vs. P. aeruginosa10). Men med kompleksiteten til slike biologiske prøver er det ofte vanskelig å finne kilden til spesifikke VOCer.
En strategi for å disentangling de flyktige profilene fra flere smittende mikrober er å utføre headspace analyse av mikroorganismer i både mono- og samkultur11. Headspace analyse undersøker analyttene som slippes ut i "headspace" over en prøve i stedet for de som er innebygd i selve prøven. Mikrobielle metabolitter har ofte blitt karakterisert i monokulturer på grunn av vanskeligheten med å bestemme opprinnelsen til mikrobielle metabolitter i komplekse kliniske prøver. Ved å profilere volatiler fra bakterielle monokulturer, kan typer volatiler en mikrobe produserer in vitro representere en grunnlinje for sitt flyktige repertoar. Å kombinere bakteriekulturer, for eksempel å skape samkulturer, og profilere de flyktige molekylene som produseres, kan avsløre interaksjonene eller kryssfôringen mellom bakteriene12.
En annen strategi for å identifisere den mikrobielle opprinnelsen til flyktige molekyler er å gi en næringskilde som er merket med en stabil isotop. Stabile isotoper forekommer naturlig, ikke-radioaktive former for atomer med et annet antall nøytroner. I en strategi som har blitt brukt siden tidlig på 1930-tallet for å spore aktiv metabolisme hos dyr13, strømmer mikroorganismen av den merkede næringskilden og inkorporerer den stabile isotopen i sine metabolske veier. Mer nylig har en stabil isotop i form av tungtvann (D2O) blitt brukt til å identifisere metabolsk aktiv S. aureus i en klinisk CF sputumprøve14. I et annet eksempel har 13C-merket glukose blitt brukt til å demonstrere kryssfôring av metabolitter mellom CF kliniske isolasjoner av P. aeruginosa og Rothia mucilaginosa12 .
Med fremme av massespektrometriteknikker har metoder for å oppdage flyktige signaler gått fra kvalitative observasjoner til mer kvantitative målinger. Ved å bruke gasskromatografi massespektrometri (GC-MS) har behandling av biologiske prøver blitt innen rekkevidde for de fleste laboratorie- eller kliniske innstillinger. Mange metoder for å kartlegge flyktige molekyler har blitt brukt til å profilere prøver som mat, bakteriekulturer og andre biologiske prøver, og luft og vann for å oppdage forurensning. Imidlertid krever flere vanlige metoder for flyktig prøvetaking med høy gjennomstrømning løsningsmiddel og utføres ikke med fordelene ved vakuumutvinning. I tillegg kreves det ofte større volumer eller mengder (større enn 0,5 ml) prøvematerialer for analyse 15,16,17,18,19, selv om dette er substratspesifikk og krever optimalisering for hver prøvetype og metode.
Her ble vakuumassistert sorbentutvinning (VASE) etterfulgt av termisk desorpsjon på en GC-MS brukt til å kartlegge de flyktige profilene til bakterielle mono- og samkulturer og identifisere aktivt produserte volatiler med stabil isotopprobing fra menneskelige avføring, spytt, kloakk og sputumprøver (figur 1). Med begrensede utvalgsmengder ble VOC hentet ut fra så lite som 15 μL sputum. Isotopprobing eksperimenter med menneskelige prøver krevde å legge til en stabil isotopkilde, for eksempel 13C glukose, og medier for å dyrke veksten av det mikrobielle samfunnet. Den aktive produksjonen av volatiler ble identifisert som et tyngre molekyl av GC-MS. Ekstraksjon av flyktige molekyler under et statisk vakuum gjorde det mulig å oppdage flyktige molekyler med økt følsomhet 20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Stg Diaph Pump</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-10-20030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL VOA vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5719110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Black Caps with hole, no septum</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-39-76044B</td>
			<td>holds lid liner in place on vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm vial liner for sorbent pens</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-L024S</td>
			<td>allows pens to make a vacuum seal at top of vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>5600-SPES</td>
			<td>5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI) media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation Stofware</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-624 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>122-1364E</td>
			<td>60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexsi sofware</td>
			<td>Dexsi (open source)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace Bundle HS-B01, 120VA</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-B01</td>
			<td>Items for running headspace extraction included in bundle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) - blank</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-T3560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53550-792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-OR-L024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Preparation Rail</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbent pen thermal conditioner</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>3801-SPTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Todd Hewitt (TH) media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1438-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction

Flyktige organiske forbindelser (VOC) fra biologiske prøver har ukjent opprinnelse. VOCer kan stamme fra verten eller forskjellige organismer fra vertens mikrobielle samfunn. For å disentangle opprinnelsen til mikrobielle VOCer, ble det utført flyktige hoderomsanalyser av bakterielle mono- og samkulturer av Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa og Acinetobacter baumannii, og stabil isotopprobing i biologiske prøver av avføring, spytt, kloakk og sputum. Mono- og samkulturer ble brukt til å identifisere flyktig produksjon fra individuelle bakteriearter eller i kombinasjon med stabil isotopprobing for å identifisere den aktive metabolismen av mikrober fra de biologiske prøvene.
Vakuumassistert sorbentutvinning (VASE) ble brukt til å trekke ut VOC-ene. VASE er en brukervennlig, kommersialisert, løsningsmiddelfri headspace ekstraksjonsmetode for semi-flyktige og flyktige forbindelser. Mangelen på løsemidler og de nesten vakuumforholdene som brukes under ekstraksjon, gjør utviklingen av en metode relativt enkel og rask sammenlignet med andre ekstraksjonsalternativer som tert-butylering og solid fasemikroekstraksjon. Arbeidsflyten som beskrives her, ble brukt til å identifisere spesifikke flyktige signaturer fra mono- og samkulturer. Videre identifiserte analyse av den stabile isotop-probingen av humane assosierte biologiske prøver VOC-er som enten ble ofte eller unikt produsert. Denne artikkelen presenterer de generelle arbeidsflyt- og eksperimentelle hensynene til VASE i forbindelse med stabil isotopprobing av levende mikrobielle kulturer.

Mono- og samkulturer av S. aureus, P. aeruginosa og A. baumannii Mono- og samkulturene besto av bakterieartene S. aureus, P. aeruginosa og A. baumannii. Dette er vanlige opportunistiske patogener som finnes i menneskelige sår og kroniske infeksjoner. For å identifisere de flyktige molekylene som finnes i mono- og samkulturene, ble det utført en kort 1-timers ekstraksjon ...

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Denne protokollen beskriver utvinning av flyktige organiske forbindelser fra en biologisk prøve med vakuumassistert sorbentutvinningsmetode, gasskromatografi kombinert med massespektrometri ved hjelp av Entech Sample Preparation Rail, og dataanalyse. Den beskriver også kultur for biologiske prøver og stabil isotopprobing.

Fange aktivt produserte mikrobielle flyktige organiske forbindelser fra human-assosierte prøver med vakuumassistert sorbentutvinning

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Denne protokollen gjør at vi enkelt kan konsentrere og identifisere flyktige metabolitter og aktivt produserte volatiler fra mikrobielle organismer i en rekke biologiske prøver. VASE er en mer brukervennlig metode for å konsentrere lav-overflod volatiles. Alt du trenger er en prøve under nesten-vakuum, og la fysikken gjøre resten.Tilgang til flyktig analyse av kliniske prøver har viktige implikasjoner for metabolsk biomarkørfunn i en rekke ulike sykdomstilstander. For eksempel kan patogenkjøring og infeksjon eller suksessen med antibakteriell terapi oppdages med flyktig analyse av spytt-, sputum- eller pusteprøver. For å forberede fekale prøver, legg til en milliliter deionisert vann til 100 milligram avføring i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør og virvel i tre minutter.Oppbevar prøvene på is når de ikke er i bruk. Tilsett 485 milliliter BHI-medium med 20 millimolar 13C glukose eller BHI med 30% deuterium til 15 mikroliter fekal og vannblanding, og sørg for at det endelige volumet av prøven er 500 mikroliter. Forbered prøver i tekniske triplikater.For å forberede kloakkprøver, tilsett 500 mikroliter kloakk til 500 mikroliter BHI-medium med 13C glukose eller 30% deuterium for et totalt volum på en milliliter. Forbered prøver i triplikater og hold dem på is. For å forberede spyttprøver, tilsett 50 mikroliter spytt til 500 mikroliter BHI-medium med 13C glukose eller 30% deuterium for et totalt volum på 550 mikroliter.Forbered prøver i triplikater og hold dem på is. For å forberede sputumprøver, tilsett 15 mikroliter sputum i et hetteglass. Forbered prøver i triplikat og hold dem på is.Legg tomme VOA-hetteglass på kaldplaten og legg kaldplaten på isen i den biosikre hetten. Slå på 5600 SPEU og juster den til ønsket temperatur. Merk 20 milliliter VOA-hetteglass i henhold til prøver, replikerer og HSP-IDer ved hjelp av en vannavstøtende markør som motstår vann i tilfelle kondens dannes på utsiden av hetteglasset mens du er på is.Inne i den biosikre hetten skruer du ut den hvite hetten på hetteglasset, piper raskt inn i hetteglasset og monterer lokkforingen, den svarte hetten og HSP. Plasser hetteglasset som inneholder prøven og HSP tilbake på kaldplaten. Når alle prøvene er klargjort i hetteglassene i glass, slår du på vakuumpumpen, plasserer hetteglassene under vakuum og fjerner vakuumkilden.Dobbeltsjekk trykket etter at du har plassert alle prøvene under vakuum ved hjelp av trykkmåleren. Hvis et hetteglass lekker, må du kontrollere at hetten er skrudd godt fast og at de hvite O-ringene på HSP- og lokkforingene er riktig på plass. Plasser hetteglassene i SPEU for optimalisert tid og temperatur med agitasjon ved 200 o/min.Trekk ut kulturer i en time ved 70 grader Celsius og trekk ut stabile isotype probing eksperimenter med fekal, kloakk, spytt og sputumprøver i 18 timer ved 37 grader Celsius. Plasser kaldplaten på minus 80 grader Celsius for bruk etter at ekstraksjonsperioden er fullført. Når ekstraksjonen er fullført, plasser prøver på kaldplaten i 15 minutter for å trekke ut vanndamp fra HSP og hetteglassets hoderom, og overfør deretter HSP-ene til ermene.Konfigurer rekkefølgen på eksempler på Entech-programvaren. Åpne programmet og velg 5800 og Sekvens i alternativene til høyre for rullegardinmenyen Instrument. Lagre sekvenstabellen, velg Kjør på venstre side, og start deretter med Tom i Desorber hvis den tomme HSP ikke er desorberen.Vær oppmerksom på at HSP-er vil bli håndtert av SPR for hvert utvalg i sekvensen. La SPR varme opp. Tillat SPR å kjøre alle prøver automatisk.Sekvensen på GC-MS-siden vil automatisk registrere dataene i separate filer. Legg til en topp i behandlingsmetoden ved å velge Kalibrer etterfulgt av Rediger forbindelse, Navn og Sett inn sammensetning under Ekstern standard compound. Legg til navnet på forbindelsene, oppbevaringstiden og kvantsignalmålionen.Legg til de tre største toppene, som inkluderer forbindelser med større sannsynlighet enn 75 %, slik at justeringen av hver identifiserende ion av forbindelsen ligger i midten av toppen. Lagre den ved å velge OK etterfulgt av Metode og Lagre. Når prosessmetoden er definert, går du videre til Antall og Beregn, og deretter viser og QEDIT kvant resultat for å kvantisere dataene.Her ble vakuumassistert sorbentutvinning etterfulgt av termisk desorpsjon på en GC-MS for å kartlegge de flyktige profilene til bakterielle mono- og kokulturer, og identifisere aktivt produserte volatiler med stabil isotopprobing fra menneskelige avføring, spytt, kloakk og sputumprøver. Mono- og samkulturene besto av bakterieartene stafylokokker aureus, pseudomonas aeruginosa og acinetobacter baumannii. 43 kommenterte flyktige molekyler ble påvist fra mono- og samkulturene ved 24- og 48-timers tidspunkter.Det var mer inkorporering av 13C i fullt merkede flyktige molekyler i forhold til deuterium. 13C ble innlemmet i 2-butanone, 3-hydroksy, 2, 3-butanedione diacetyl, eddiksyre og fenol for alle fekale, kloakk og spyttprøver. Aceton, butanoinsyre og propanosyre ble påvist som merket i spytt og kloakk.mens dimetyltrisulfid og disulfid dimetyl ble beriket i både fekale og spyttprøver. Volatiles 1-propanol, 2-butanone, benzophenone, etanol og metylthiolacetat ble beriket bare i kloakk og 2, 3-pentanedione i spytt. Deuterium ble innlemmet i flyktig eddiksyre, benzaldehyd, 4-metyl-dimetyltrisulfid og fenol fra enten spytt- eller kloakkprøver.Eddiksyre, dimetyltrisulfid, aceton og propanol 2-metyl var mer rikelig i de dyrkede sputumprøvene enn ukulturerte sputumprøver. En permutert multi-variate analyse av varianter, en PERMANOVA, ble utført på en Bray-Curtis avstandsmatrise av flyktige overflod fra cystiske fibrose sputumprøver. Vi fant at subjektet som donerte prøven forklarer 51% av variasjonen i 13C-merket kultivert sputum og 33% av variasjonen i ukulturert sputum.Her vises suksessen med stabil isotopmerking med 13C glukose i volatiler fra kultiverte sputumprøver samlet inn fra syv personer med cystisk fibrose. Volatiler som har høyere 13C inkorporering for de fleste prøver er vist i panel 5A, de med lavere prosent 13C inkorporering i de fleste sputumprøver er i panel 5B, og molekyler med lavere 13C prosent konvertering i et mindretall av sputumprøvene er vist i panel 5C. Dobbeltsjekk alltid hetteglasstrykket etter omtrent et minutt.Et ødelagt vakuum beseirer følsomheten og hastigheten til VASE-metoden. Etter denne prosedyren, hvis stabil isotopprobing ble utført, kan DNA-et ekstraheres fra det gjenværende materialet for å identifisere mikrobielle organismer eller arter som kan ha bidratt til produksjonen av de flyktige molekylene. Denne metoden er også nyttig for å oppdage volatiler fra enhver prøvetype uten isotopprobing.Med fordeler med følsomhet og lavt prøvevolum, kan mange applikasjoner dra nytte av denne teknikken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Ligne Funksjon Melde Proteiner: Mot Kunstig signaltransduksjon Therapy

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-PAGE: En metode for å fange og løse protein komplekser i biologiske prøver

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Optimalisert protokoll for ekstraksjon av proteiner fra Human Mitral Valve

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Fange samhandling Kinetics en Ion kanal protein med små molekyler av Bio-lags Interferometry analysen

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blad Spray massespektrometri: En rask Ambient ionisering teknikk å vurdere direkte metabolitter fra anlegget vev

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Profilering av flyktige forbindelser i solbærfrukt ved hjelp av headspace solidfaset mikroekstraksjon koblet til gasskromatografi-massespektrometri

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Absolutt kvantifisering av inositolpyrofosfater ved kapillærelektroforese Elektrospray ionisering massespektrometri

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Rekonstituering av msp1-ekstraksjonsaktivitet med fullstendig rensede komponenter

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Ultralydassistert ekstraksjon av cannabidiolic acid fra Cannabis Biomass

Industrial hemp (Cannabis spp.) has many compounds of interest with potential medical benefits. Of these compounds, cannabinoids have come to the center ...