Name: capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction
Uploaded: 2022-06-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

Agradecemos a Heather Maughan e Linda M. Kalikin pela edição cuidadosa deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo NIH NHLBI (grant 5R01HL136647-04).

1. Headspace Sorbent Pen (HSP) e considerações de análise de amostras
NOTA: O HSP contendo o sêrbent Tenax TA foi selecionado para capturar uma ampla gama de voláteis. Tenax tem uma menor afinidade com a água em comparação com outros sorbents, o que lhe permite capturar mais VOCs de amostras de maior umidade. Tenax também tem um baixo nível de impurezas e pode ser condicionado para reutilização. A seleção sorbent também foi feita em consideração com a coluna instalada no GC-MS (...

<ol>
	<li>Van Berkel, J. J. B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+profile+of+volatile+organic+compounds+in+breath+discriminates+COPD+patients+from+controls.">A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls.</a> Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).</li><li>Nakhleh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+active+pulmonary+tuberculosis+with+a+breath+test+using+nanomaterial-based+sensors.">Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors.</a> European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).</li><li>Lim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+diagnosis+of+tuberculosis+from+analysis+of+urine+volatile+organic+compounds.">Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds.</a> ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).</li><li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+volatile+organic+compounds+in+exhaled+breath+to+diagnose+ventilator-associated+pneumonia.">Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia.</a> Scientific Reports. 5, 17179 (2015).</li><li>Paff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+molecular+profiles+in+the+assessment+of+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia.">Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).</li><li>Robroeks, C. M. H. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+volatile+organic+compounds+in+cystic+fibrosis+patients+and+controls.">Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls.</a> Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).</li><li>Neerincx, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+cyanide+emission+in+the+lung+by+Staphylococcus+aureus.">Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus.</a> European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).</li><li>Goeminne, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+sputum+headspace+through+volatile+organic+compound+analysis.">Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis.</a> Respiratory Research. 13, 87 (2012).</li><li>Joensen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+breath+analysis+using+Electronic+Nose+in+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia+patients+with+chronic+pulmonary+infections.">Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections.</a> PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).</li><li>Nasir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+molecules+from+bronchoalveolar+lavage+fluid+can+'rule-in'+Pseudomonas+aeruginosa+and+'rule-out'+Staphylococcus+aureus+infections+in+cystic+fibrosis+patients.">Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients.</a> Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).</li><li>Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatiles+in+inter-specific+bacterial+interactions.">Volatiles in inter-specific bacterial interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).</li><li>Gao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+polymicrobial+metabolism+in+cystic+fibrosis+airways:+Pseudomonas+aeruginosa+metabolism+and+physiology+are+influenced+by+Rothia+mucilaginosa-derived+metabolites.">Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites.</a> mSphere. 3 (2), 00151 (2018).</li><li>Schoenheimer, R., Rittenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deuterium+as+an+indicator+in+the+study+of+intermediary+metabolism.">Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism.</a> Science. 82 (2120), 156-157 (1935).</li><li>Neubauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+application+of+microbial+lipids+as+tracers+of+Staphylococcus+aureus+growth+rates+in+cystic+fibrosis+sputum.">Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).</li><li>Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GC-MS+analysis+of+ethanol+and+other+volatile+compounds+in+micro-volume+blood+samples-quantifying+neonatal+exposure.">GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).</li><li>Mayor, A. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+sample+preparation+for+direct+SPME-GC-MS+analysis+of+murine+and+human+faecal+volatile+organic+compounds+for+metabolomic+studies.">Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies.</a> Journal of Analytical &amp; Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).</li><li>Camarasu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headspace+SPME+method+development+for+the+analysis+of+volatile+polar+residual+solvents+by+GC-MS.">Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).</li><li>Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer+volatile+analysis:+optimization+of+HS/SPME+coupled+to+GC/MS/FID.">Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID.</a> Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).</li><li>Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+headspace+solid-phase+dynamic+extraction+to+analyse+the+volatile+fraction+of+food+matrices.">Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices.</a> Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).</li><li>Trujillo-Rodr&#237;guez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuum-assisted+sorbent+extraction:+An+analytical+methodology+for+the+determination+of+ultraviolet+filters+in+environmental+samples.">Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples.</a> Talanta. 208, 120390 (2020).</li><li>Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+algae-based+treatment+of+herbicide-contaminated+groundwater.">Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater.</a> Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).</li><li>Psillakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+vacuum:+an+emerging+experimental+parameter+to+consider+during+headspace+microextraction+sampling.">The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+daily+dynamics+of+cystic+fibrosis+airway+microbiota+during+clinical+stability+and+at+exacerbation.">The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation.</a> Microbiome. 3, 12 (2015).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Mahboubi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-based+and+culture-independent+bacteriologic+analysis+of+cystic+fibrosis+respiratory+specimens.">Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).</li></ol>

Para identificar a produção volátil em culturas in vitro e amostras associadas ao homem, foram realizadas análises voláteis de monoculturas de P. aeruginosa, S. aureus e A. baumanii e isótopos estáveis de diferentes amostras biológicas. Na análise para as monoculturas e coculturas, os voláteis foram detectados realizando uma extração curta por 1h a 70 °C. A análise volátil das monoculturas e coculturas permitiu o levantamento dos compostos produzidos tanto por espécies individu...

Compostos orgânicos voláteis (VOCs) têm grande promessa de detecção e identificação bacteriana porque são emitidos de todos os organismos, e diferentes micróbios têm assinaturas exclusivas de VOC. Moléculas voláteis têm sido utilizadas como uma medida não invasiva para a detecção de várias infecções respiratórias, incluindo doença pulmonar obstrutiva crônica1, tuberculose2 na urina3 e pneumonia associada ao ventilador4, além de distinguir indivíduos com fibrose cística (CF) de indivíduos de controle saudável 5,6. Assinaturas voláteis têm sido usadas até mesmo para distinguir infecções específicas de patógenos em CF (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 e S. aureus vs. P. aeruginosa10). No entanto, com a complexidade dessas amostras biológicas, muitas vezes é difícil identificar a fonte de VOCs específicos.
Uma estratégia para desembaraçar os perfis voláteis de micróbios infecciosos múltiplos é realizar a análise do espaço da cabeça de microrganismos tanto na mono-quanto na cocultura11. A análise do headspace examina os analitos emitidos no "headspace" acima de uma amostra em vez daqueles incorporados na própria amostra. Metabólitos microbianos têm sido frequentemente caracterizados em monoculturas devido à dificuldade em determinar a origem dos metabólitos microbianos em amostras clínicas complexas. Ao traçar perfis voláteis de monoculturas bacterianas, os tipos de voláteis que um micróbio produz in vitro podem representar uma linha de base de seu repertório volátil. A combinação de culturas bacterianas, por exemplo, a criação de co-culturas e o perfil das moléculas voláteis produzidas podem revelar as interações ou a alimentação cruzada entre as bactérias12.
Outra estratégia para identificar a origem microbiana de moléculas voláteis é fornecer uma fonte de nutrientes que é rotulada com um isótopo estável. Isótopos estáveis são formas não radioativas de átomos com um número diferente de nêutrons. Em uma estratégia que vem sendo utilizada desde o início da década de 1930 para traçar o metabolismo ativo em animais13, o microrganismo se alimenta da fonte de nutrientes rotulado e incorpora o isótopo estável em suas vias metabólicas. Mais recentemente, um isótopo estável na forma de água pesada (D2O) tem sido usado para identificar S. aureus metabolicamente ativo em uma amostra clínica de escarro CF14. Em outro exemplo, a glicose com 13C foi usada para demonstrar a alimentação cruzada de metabólitos entre os isolados clínicos cf de P. aeruginosa e Rothia mucilaginosa12 .
Com o avanço das técnicas de espectrometria de massa, os métodos de detecção de pistas voláteis passaram de observações qualitativas para medidas mais quantitativas. Usando espectrometria de massa cromatografia gasosa (GC-MS), o processamento de amostras biológicas tornou-se ao alcance da maioria dos ambientes laboratoriais ou clínicos. Muitos métodos para levantamento de moléculas voláteis têm sido usados para traçar o perfil de amostras como alimentos, culturas bacterianas e outras amostras biológicas, e ar e água para detectar contaminação. No entanto, vários métodos comuns de amostragem volátil com alto rendimento exigem solvente e não são realizados com as vantagens proporcionadas pela extração a vácuo. Além disso, volumes ou quantidades maiores (superiores a 0,5 mL) de materiais amostrados são frequentemente necessários para análisede 15,16,17,18,19, embora isso seja específico do substrato e exija otimização para cada tipo e método de amostra.
Aqui, a extração sorbent assistida a vácuo (VASE) seguida de desorção térmica em um GC-MS foi empregada para examinar os perfis voláteis de monoculturas bacterianas e coculturas e identificar voláteis produzidos ativamente com isótopos estáveis sondando de fezes humanas, saliva, esgoto e amostras de escarro (Figura 1). Com quantidades amostrais limitadas, os VOCs foram extraídos de apenas 15 μL de escarro. Experimentos de sondagem de isótopos com amostras humanas exigiram a adição de uma fonte estável de isótopos, como glicose de 13C, e mídia para cultivar o crescimento da comunidade microbiana. A produção ativa de voláteis foi identificada como uma molécula mais pesada pelo GC-MS. A extração de moléculas voláteis sob um vácuo estático permitiu a detecção de moléculas voláteis com maior sensibilidade 20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Stg Diaph Pump</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-10-20030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL VOA vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5719110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Black Caps with hole, no septum</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-39-76044B</td>
			<td>holds lid liner in place on vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm vial liner for sorbent pens</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-L024S</td>
			<td>allows pens to make a vacuum seal at top of vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>5600-SPES</td>
			<td>5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI) media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation Stofware</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-624 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>122-1364E</td>
			<td>60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexsi sofware</td>
			<td>Dexsi (open source)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace Bundle HS-B01, 120VA</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-B01</td>
			<td>Items for running headspace extraction included in bundle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) - blank</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-T3560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53550-792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-OR-L024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Preparation Rail</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbent pen thermal conditioner</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>3801-SPTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Todd Hewitt (TH) media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1438-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction

Compostos orgânicos voláteis (VOCs) de amostras biológicas têm origens desconhecidas. Os VOCs podem se originar do hospedeiro ou de diferentes organismos de dentro da comunidade microbiana do hospedeiro. Para desembaraçar a origem dos VOCs microbianos, foram realizadas análises voláteis do espaço da cabeça de monoculturas bacterianas e co-culturas de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii, e testes estáveis de isótopos em amostras biológicas de fezes, saliva, esgoto e espito. Monoculturas foram utilizadas para identificar a produção volátil de espécies bacterianas individuais ou em combinação com a sondagem de isótopos estáveis para identificar o metabolismo ativo dos micróbios das amostras biológicas.
A extração sorbent assistida a vácuo (VASE) foi empregada para extrair os VOCs. O VASE é um método de extração de espaço livre de solventes fácil de usar, comercializado e livre de solventes para compostos semi-voláteis e voláteis. A falta de solventes e as condições de quase vácuo utilizadas durante a extração tornam o desenvolvimento de um método relativamente fácil e rápido quando comparado a outras opções de extração, como tert-butylation e microextração de fase sólida. O fluxo de trabalho descrito aqui foi usado para identificar assinaturas voláteis específicas de mono-e co-culturas. Além disso, a análise da sondagem estável de isótopos de amostras biológicas associadas humanas identificou CODs comumente ou exclusivamente produzidos. Este artigo apresenta o fluxo de trabalho geral e considerações experimentais do VASE em conjunto com a sondagem estável de culturas microbianas vivas.

Mono-e co-culturas de S. aureus, P. aeruginosa, e A. baumannii As monoculturas consistiam das espécies bacterianas S. aureus, P. aeruginosa e A. baumannii. Estes são patógenos oportunistas comuns encontrados em feridas humanas e infecções crônicas. Para identificar as moléculas voláteis presentes nas monoculturas e coculturas, foi realizada uma pequena extração de...

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Este protocolo descreve a extração de compostos orgânicos voláteis de uma amostra biológica com o método de extração sorbent assistido a vácuo, cromatografia gasosa juntamente com espectrometria de massa usando o Entech Sample Preparation Rail e análise de dados. Também descreve a cultura de amostras biológicas e sondagem de isótopos estáveis.

Capturando compostos orgânicos voláteis microbianos produzidos ativamente a partir de amostras associadas ao homem com extração sorbent assistida a vácuo

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Este protocolo nos permite concentrar e identificar facilmente metabólitos voláteis e produzir ativamente voláteis de organismos microbianos em uma variedade de amostras biológicas. O VASE é um método mais fácil de usar para concentrar voláteis de baixa abundância. Tudo que você precisa é de uma amostra sob quase vácuo, e deixe a física fazer o resto.O acesso à análise volátil de amostras clínicas tem implicações importantes para a descoberta de biomarcadores metabólicos em vários estados diferentes da doença. Por exemplo, a condução e infecção do patógeno ou o sucesso da terapia antibacteriana poderiam ser detectados com análise volátil de saliva, saliva ou amostras de respiração. Para preparar amostras fecais, adicione um mililitro de água deionizada a 100 miligramas de fezes em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e vórtice por três minutos.Mantenha as amostras no gelo quando não estiver em uso. Adicione 485 mililitros de bhi médio com 20 mililitros de glicose 13C ou BHI com 30% de deutério a 15 microliters de mistura fecal e de água, garantindo que o volume final da amostra seja de 500 microliters. Prepare amostras em triplicados técnicos.Para preparar amostras de esgoto, adicione 500 microliters de esgoto a 500 microliters de meio BHI com glicose de 13C ou 30% deutério para um volume total de um mililitro. Prepare amostras em triplicados e mantenha-as no gelo. Para preparar amostras de saliva, adicione 50 microliters de saliva a 500 microliters de meio BHI com glicose de 13C ou 30% deutério para um volume total de 550 microliters.Prepare amostras em triplicados e mantenha-as no gelo. Para preparar amostras de escarro, adicione 15 microliters de escarro em um frasco. Prepare amostras em triplicado e mantenha-as no gelo.Coloque frascos VOA vazios na placa fria e coloque a placa fria no gelo no capô da biossegurança. Ligue o SPEU 5600 e ajuste-o à temperatura necessária. Rotular frascos VOA de 20 mililitros de acordo com amostras, réplicas e IDs HSP usando um marcador resistente à água que resiste à água no caso de formas de condensação nas partes externas do frasco enquanto estiver no gelo.Dentro do capô de biossegurança, desaparafusar a tampa branca no frasco, rapidamente pipeta amostra no frasco, e montar o forro da tampa, tampa preta e HSP. Coloque o frasco contendo a amostra e o HSP de volta na placa fria. Uma vez que todas as amostras tenham sido preparadas nos frascos de vidro, ligue a bomba de vácuo, coloque os frascos sob vácuo e remova a fonte de vácuo.Verifique duas vezes a pressão depois de colocar todas as amostras sob vácuo usando o medidor de pressão. Se um frasco estiver vazando, certifique-se de que a tampa está aparafusada firmemente e que os anéis O brancos do HSP e dos forros da tampa estejam corretamente no lugar. Coloque frascos na SPEU para o tempo e temperatura otimizados com agitação a 200 RPM.Extrair culturas por uma hora a 70 graus Celsius e extrair experimentos estáveis de sondagem de isótipo com amostras fecais, de esgoto, saliva e escarro por 18 horas a 37 graus Celsius. Coloque a placa fria a menos 80 graus Celsius para uso após o período de extração estiver completo. Quando a extração estiver completa, coloque amostras na placa fria por 15 minutos para retirar vapor de água do HSP e do espaço para a cabeça do frasco e, em seguida, transfira os HSPs para suas mangas.Configure a sequência de amostras no software Entech. Abra o programa e selecione 5800 e Sequência nas opções à direita do menu suspenso do instrumento. Salve a tabela de sequência, selecione Executar no lado esquerdo e, em seguida, Começar com Blank em Desorber se o HSP em branco não for o desorber.Observe que os HSPs serão manipulados pelo SPR para cada amostra na sequência. Deixe o SPR aquecer. Permita que o SPR execute todas as amostras automaticamente.A sequência no lado GC-MS gravará automaticamente os dados em arquivos separados. Adicione um pico ao método de processamento selecionando Calibrar seguido de Editar composto, nome e composto de inserção sob composto padrão externo. Adicione o nome dos compostos, o tempo de retenção e o íon alvo do sinal quântico.Adicione os três maiores picos, que incluem compostos com maior probabilidade superior a 75%, garantindo que o alinhamento de cada íon identificador do composto esteja dentro do centro do pico. Salve-o selecionando OK, seguido de Method e Save. Uma vez que o método de processo seja configurado, proceda para Quantitate e Calcule, então Exibir e QEDIT Quant Result para quantificar os dados.Aqui, a extração de sorbent assistida a vácuo foi seguida por desorção térmica em um GC-MS para examinar os perfis voláteis de monoculturas bacterianas e co-culturas, e identificar voláteis produzidos ativamente com isótopos estáveis sondando de fezes humanas, saliva, esgoto e amostras de escarro. As monoculturas consistiam das espécies bacterianas staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa e acinetobacter baumannii. 43 moléculas voláteis anotadas foram detectadas a partir das monoculturas em pontos de tempo de 24 e 48 horas.Houve mais incorporação de 13C em moléculas voláteis totalmente rotuladas em comparação com o deutério. 13C foi incorporado em 2-butanone, 3-hidroxi, 2, 3-butanedione diacetil, ácido acético e fenol para todas as amostras fecais, de esgoto e saliva. Acetona, ácido butanoico e ácido propanoico foram detectados como rotulados em saliva e esgoto.enquanto dimetil trissulfeto e dimetil de dissulfeto foram enriquecidos em amostras fecais e saliva. Os voláteis 1-propanol, 2-butanona, benzofenona, etanol e acetato de metiltígiol foram enriquecidos apenas em esgoto e 2, 3-pentanedione na saliva. O deutério foi incorporado ao ácido acético volátil, benzaldeído, trissulfeto de 4 metila-dimetil, e fenol de amostras de saliva ou esgoto.Ácido acético, trissulfeto de dimetila, acetona e propanol 2-metil foram mais abundantes nas amostras de escarro cultivadas do que amostras de escarro não cultivadas. Uma análise multivariada permutada de variantes, uma PERMANOVA, foi realizada em uma matriz de distância Bray-Curtis das abundâncias voláteis das amostras de escarro de fibrose cística. Verificou-se que o sujeito que doou a amostra explica 51% da variação na escarro cultivada com rótulo 13C e 33% da variação da escarro não cultivada.Aqui, mostra-se o sucesso da rotulagem estável de isótopos com glicose de 13C em voláteis de amostras de escarro cultivadas coletadas de sete pessoas com fibrose cística. Os voláteis que possuem maior incorporação de 13C para a maioria das amostras são mostrados no painel 5A, aqueles com incorporação de 13C de menor percentual na maioria das amostras de escarro estão no painel 5B, e moléculas com menor conversão de 13C em uma minoria das amostras de escarro são mostradas no painel 5C. Verifique sempre as pressões do frasco depois de cerca de um minuto.Um vácuo quebrado derrota a sensibilidade e a velocidade do método VASE. Após este procedimento, se for realizada a sondagem de isótopos estáveis, o DNA pode ser extraído do material restante para identificar organismos microbianos ou espécies que possam ter contribuído para a produção das moléculas voláteis. Este método também é útil na detecção de voláteis de qualquer tipo de amostra sem sondagem de isótopos.Com vantagens de sensibilidade e baixo volume amostral, muitas aplicações podem se beneficiar dessa técnica.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Imitando a Função de Proteínas de Sinalização: Toward Artificial Signal Therapy Transdução

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Bioquímica

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multímero-PAGE: Um método para capturar e Solução de proteína em amostras biológicas Complexos

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Protocolo otimizado para a extração de proteínas da válvula mitral humana

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Capturando a cinética de interação de uma proteína de canal iônico com pequenas moléculas por ensaio de interferometria de Bio-camada

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Espectrometria de massa folha Spray: Uma técnica de ionização ambiente rápida para avaliar diretamente a metabolitos de tecidos vegetais

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Perfil de compostos voláteis em frutas groselha usando microextração de fase sólida do headspace acoplado à espectrometria de massa de cromatografia gasosa

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Quantificação Absoluta de Pirofosfatos de Inositol por Eletroforese Capilar Eletrospray Ionização Espectrometria de Massa

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Reconstituição da Atividade de Extração de Msp1 com Componentes Totalmente Purificados

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Extração ultrassônica assistida de ácido canabidiolico da biomassa da cannabis

Industrial hemp (Cannabis spp.) has many compounds of interest with potential medical benefits. Of these compounds, cannabinoids have come to the center ...