Name: capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction
Uploaded: 2022-06-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

Мы благодарим Хизер Моэн и Линду М. Каликин за тщательное редактирование этой рукописи. Эта работа была поддержана NIH NHLBI (грант 5R01HL136647-04).

1. Соображения по анализу сорбента Headspace Sorbent Pen (HSP) и анализа образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: HSP, содержащий сорбент Tenax TA, был выбран для улавливания широкого спектра летучих веществ. Tenax имеет более низкое сродство к воде по сравнению с другими сорбентами, что позволяет ему улавливать ...

<ol>
	<li>Van Berkel, J. J. B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+profile+of+volatile+organic+compounds+in+breath+discriminates+COPD+patients+from+controls.">A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls.</a> Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).</li><li>Nakhleh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+active+pulmonary+tuberculosis+with+a+breath+test+using+nanomaterial-based+sensors.">Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors.</a> European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).</li><li>Lim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+diagnosis+of+tuberculosis+from+analysis+of+urine+volatile+organic+compounds.">Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds.</a> ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).</li><li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+volatile+organic+compounds+in+exhaled+breath+to+diagnose+ventilator-associated+pneumonia.">Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia.</a> Scientific Reports. 5, 17179 (2015).</li><li>Paff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+molecular+profiles+in+the+assessment+of+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia.">Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).</li><li>Robroeks, C. M. H. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+volatile+organic+compounds+in+cystic+fibrosis+patients+and+controls.">Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls.</a> Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).</li><li>Neerincx, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+cyanide+emission+in+the+lung+by+Staphylococcus+aureus.">Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus.</a> European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).</li><li>Goeminne, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+sputum+headspace+through+volatile+organic+compound+analysis.">Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis.</a> Respiratory Research. 13, 87 (2012).</li><li>Joensen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+breath+analysis+using+Electronic+Nose+in+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia+patients+with+chronic+pulmonary+infections.">Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections.</a> PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).</li><li>Nasir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+molecules+from+bronchoalveolar+lavage+fluid+can+'rule-in'+Pseudomonas+aeruginosa+and+'rule-out'+Staphylococcus+aureus+infections+in+cystic+fibrosis+patients.">Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients.</a> Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).</li><li>Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatiles+in+inter-specific+bacterial+interactions.">Volatiles in inter-specific bacterial interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).</li><li>Gao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+polymicrobial+metabolism+in+cystic+fibrosis+airways:+Pseudomonas+aeruginosa+metabolism+and+physiology+are+influenced+by+Rothia+mucilaginosa-derived+metabolites.">Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites.</a> mSphere. 3 (2), 00151 (2018).</li><li>Schoenheimer, R., Rittenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deuterium+as+an+indicator+in+the+study+of+intermediary+metabolism.">Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism.</a> Science. 82 (2120), 156-157 (1935).</li><li>Neubauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+application+of+microbial+lipids+as+tracers+of+Staphylococcus+aureus+growth+rates+in+cystic+fibrosis+sputum.">Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).</li><li>Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GC-MS+analysis+of+ethanol+and+other+volatile+compounds+in+micro-volume+blood+samples-quantifying+neonatal+exposure.">GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).</li><li>Mayor, A. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+sample+preparation+for+direct+SPME-GC-MS+analysis+of+murine+and+human+faecal+volatile+organic+compounds+for+metabolomic+studies.">Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies.</a> Journal of Analytical &amp; Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).</li><li>Camarasu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headspace+SPME+method+development+for+the+analysis+of+volatile+polar+residual+solvents+by+GC-MS.">Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).</li><li>Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer+volatile+analysis:+optimization+of+HS/SPME+coupled+to+GC/MS/FID.">Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID.</a> Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).</li><li>Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+headspace+solid-phase+dynamic+extraction+to+analyse+the+volatile+fraction+of+food+matrices.">Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices.</a> Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).</li><li>Trujillo-Rodr&#237;guez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuum-assisted+sorbent+extraction:+An+analytical+methodology+for+the+determination+of+ultraviolet+filters+in+environmental+samples.">Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples.</a> Talanta. 208, 120390 (2020).</li><li>Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+algae-based+treatment+of+herbicide-contaminated+groundwater.">Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater.</a> Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).</li><li>Psillakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+vacuum:+an+emerging+experimental+parameter+to+consider+during+headspace+microextraction+sampling.">The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+daily+dynamics+of+cystic+fibrosis+airway+microbiota+during+clinical+stability+and+at+exacerbation.">The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation.</a> Microbiome. 3, 12 (2015).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Mahboubi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-based+and+culture-independent+bacteriologic+analysis+of+cystic+fibrosis+respiratory+specimens.">Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).</li></ol>

Для выявления летучего производства в культурах in vitro и связанных с человеком образцах был проведен летучий анализ моно- и кокультур P. aeruginosa, S. aureus и A. baumanii и стабильное изотопное зондирование различных биологических образцов. В анализе для моно- и ко-культур летучие вещес...

Летучие органические соединения (ЛОС) имеют большие перспективы для обнаружения и идентификации бактерий, поскольку они выделяются всеми организмами, а различные микробы имеют уникальные сигнатуры ЛОС. Летучие молекулы использовались в качестве неинвазивного измерения для выявления различных респираторных инфекций, включая хроническую обструктивную болезнь легких1, туберкулез2 в моче3 и пневмонию, связанную с ИВЛ4, в дополнение к различению субъектов с муковисцидозом (МВ) от здоровых контрольных субъектов 5,6. Летучие сигнатуры даже использовались для различения специфических патогенных инфекций при муковисцидозе (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 и S. aureus vs. P. aeruginosa10). Однако из-за сложности таких биологических образцов часто бывает трудно точно определить источник конкретных ЛОС.
Одной из стратегий отделения летучих профилей от множественных инфекционных микробов является проведение анализа пространства над головой микроорганизмов как в моно-, так и в кокультуре11. Анализ пространства над головой исследует аналиты, испускаемые в «пространство головы» над образцом, а не те, которые встроены в сам образец. Микробные метаболиты часто характеризуются в монокультурах из-за сложности определения происхождения микробных метаболитов в сложных клинических образцах. Профилируя летучие вещества из бактериальных монокультур, типы летучих веществ, которые микроб производит in vitro , могут представлять собой базовую линию его летучего репертуара. Объединение бактериальных культур, например, создание кокультур и профилирование образующихся летучих молекул может выявить взаимодействия или перекрестное питание между бактериями12.
Другая стратегия идентификации микробного происхождения летучих молекул заключается в обеспечении источника питательных веществ, который помечен стабильным изотопом. Стабильные изотопы являются естественными, нерадиоактивными формами атомов с различным количеством нейтронов. В стратегии, которая использовалась с начала 1930-х годов для отслеживания активного метаболизма у животных13, микроорганизм питается от меченого источника питательных веществ и включает стабильный изотоп в свои метаболические пути. Совсем недавно стабильный изотоп в виде тяжелой воды (D2O) был использован для идентификации метаболически активного S. aureus в клиническом образце мокротыCF 14. В другом примере 13С-меченая глюкоза была использована для демонстрации перекрестного питания метаболитов между клиническими изолятами МВ P. aeruginosa и Rothia mucilaginosa12 .
С развитием методов масс-спектрометрии методы обнаружения летучих сигналов перешли от качественных наблюдений к более количественным измерениям. Используя масс-спектрометрию газовой хроматографии (GC-MS), обработка биологических образцов стала доступной для большинства лабораторных или клинических условий. Многие методы исследования летучих молекул использовались для профилирования образцов, таких как пищевые продукты, бактериальные культуры и другие биологические образцы, а также воздуха и воды для обнаружения загрязнения. Однако некоторые распространенные методы летучего отбора проб с высокой пропускной способностью требуют растворителя и не выполняются с преимуществами, предоставляемыми вакуумной экстракцией. Кроме того, для анализа 15,16,17,18,19 часто требуются большие объемы или количества (более 0,5 мл) отобранных материалов, хотя это специфично для субстрата и требует оптимизации для каждого типа образца и метода.
Здесь вакуумная экстракция сорбента (VASE) с последующей термической десорбцией на GC-MS использовалась для обследования летучих профилей бактериальных моно- и кокультур и выявления активно продуцируемых летучих веществ со стабильным изотопным зондированием из образцов фекалий человека, слюны, сточных вод и мокроты (рисунок 1). При ограниченных количествах образцов ЛОС извлекали всего из 15 мкл мокроты. Эксперименты по изотопному зондированию с образцами человека требовали добавления стабильного изотопного источника, такого как глюкоза 13° C, и среды для культивирования роста микробного сообщества. Активное производство летучих веществ было идентифицировано как более тяжелая молекула GC-MS. Экстракция летучих молекул в статическом вакууме позволила обнаружить летучие молекулы с повышенной чувствительностью 20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Stg Diaph Pump</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-10-20030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL VOA vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5719110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Black Caps with hole, no septum</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-39-76044B</td>
			<td>holds lid liner in place on vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm vial liner for sorbent pens</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-L024S</td>
			<td>allows pens to make a vacuum seal at top of vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>5600-SPES</td>
			<td>5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI) media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation Stofware</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-624 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>122-1364E</td>
			<td>60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexsi sofware</td>
			<td>Dexsi (open source)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace Bundle HS-B01, 120VA</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-B01</td>
			<td>Items for running headspace extraction included in bundle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) - blank</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-T3560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53550-792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-OR-L024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Preparation Rail</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbent pen thermal conditioner</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>3801-SPTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Todd Hewitt (TH) media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1438-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction

Летучие органические соединения (ЛОС) из биологических образцов имеют неизвестное происхождение. ЛОС могут происходить от хозяина или различных организмов из микробного сообщества хозяина. Чтобы распутать происхождение микробных ЛОС, был проведен анализ летучих головных пространств бактериальных моно- и кокультур золотистого стафилококка, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii, а также исследование стабильных изотопов в биологических образцах кала, слюны, сточных вод и мокроты. Моно- и кокультуры использовались для идентификации летучего производства из отдельных видов бактерий или в сочетании со стабильным изотопным зондированием для идентификации активного метаболизма микробов из биологических образцов.
Для извлечения ЛОС использовалась вакуумная экстракция сорбента (VASE). VASE - это простой в использовании, коммерциализированный, не содержащий растворителей метод экстракции из пространства над головой для полулетучих и летучих соединений. Отсутствие растворителей и почти вакуумные условия, используемые во время экстракции, делают разработку метода относительно легкой и быстрой по сравнению с другими вариантами экстракции, такими как трет-бутилирование и твердофазная микроэкстракция. Описанный здесь рабочий процесс использовался для идентификации конкретных изменчивых сигнатур из моно- и сокультур. Кроме того, анализ зондирования стабильных изотопов связанных с человеком биологических образцов выявил ЛОС, которые либо обычно, либо уникально производились. В данной статье представлен общий рабочий процесс и экспериментальные соображения VASE в сочетании со стабильным изотопным зондированием живых микробных культур.

Моно- и кокультуры S. aureus, P. aeruginosa и A. baumannii Моно- и кокультуры состояли из бактериальных видов S. aureus, P. aeruginosa и A. baumannii. Это распространенные условно-патогенные микроорганизмы, обнаруженные в ранах человека и ...

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Этот протокол описывает извлечение летучих органических соединений из биологического образца методом вакуумной экстракции сорбента, газовую хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией с использованием Entech Sample Preparation Rail и анализ данных. Он также описывает культуру биологических образцов и зондирование стабильных изотопов.

Улавливание активно производимых микробных летучих органических соединений из образцов, связанных с человеком, с помощью вакуумной экстракции сорбента

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Этот протокол позволяет нам легко концентрировать и идентифицировать летучие метаболиты и активно продуцируемые летучие вещества из микробных организмов в различных биологических образцах. VASE является более удобным для пользователя методом концентрации летучих веществ с низким содержанием. Все, что вам нужно, это образец под почти вакуумом, и пусть физика сделает все остальное.Доступ к летучему анализу клинических образцов имеет важное значение для обнаружения метаболических биомаркеров в ряде различных болезненных состояний. Например, патогенное вождение и инфекция или успех антибактериальной терапии могут быть обнаружены с помощью летучего анализа образцов слюны, мокроты или дыхания. Для подготовки образцов фекалий добавьте один миллилитр деионизированной воды к 100 миллиграммам кала в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и вихрь в течение трех минут.Храните образцы на льду, когда они не используются. Добавьте 485 миллилитров среды BHI с 20-миллимолярной глюкозой 13C или BHI с 30% дейтерия до 15 микролитров фекальной и водной смеси, гарантируя, что конечный объем образца составляет 500 микролитров. Подготовьте образцы в технических трех экземплярах.Для подготовки образцов сточных вод добавьте 500 микролитров сточных вод к 500 микролитрам среды BHI с 13C глюкозой или 30% дейтерия общим объемом в один миллилитр. Подготовьте образцы в трех экземплярах и держите их на льду. Для приготовления образцов слюны добавьте 50 микролитров слюны к 500 микролитрам среды BHI с глюкозой 13C или 30% дейтерия общим объемом 550 микролитров.Подготовьте образцы в трех экземплярах и держите их на льду. Чтобы подготовить образцы мокроты, добавьте в флакон 15 микролитров мокроты. Подготовьте образцы в трех экземплярах и держите их на льду.Поместите пустые флаконы «Голоса Америки» на холодную тарелку и поместите холодную пластину на лед в вытяжку биобезопасности. Включите 5600 SPEU и отрегулируйте его до требуемой температуры. Маркировка 20-миллилитровых флаконов VOA в соответствии с образцами, репликами и идентификаторами HSP с использованием водостойкого маркера, который сопротивляется воде в случае образования конденсата на внешней стороне флакона во время нахождения на льду.Внутри капюшона биобезопасности открутите белый колпачок на флаконе, быстро поместите образец пипетки во флакон и соберите вкладыш крышки, черный колпачок и HSP. Поместите флакон, содержащий образец и HSP, обратно на холодную пластину. После того, как все образцы будут подготовлены в стеклянных флаконах, включите вакуумный насос, поместите флаконы под вакуум и удалите источник вакуума.Дважды проверьте давление после помещения всех образцов под вакуум с помощью манометра. Если флакон протекает, убедитесь, что колпачок плотно прикручен и что белые уплотнительные кольца HSP и вкладышей крышки правильно установлены. Поместите флаконы в SPEU для оптимизации времени и температуры с перемешиванием при 200 об/мин.Извлекайте культуры в течение одного часа при 70 градусах Цельсия и извлекайте стабильные эксперименты по зондированию изотипа с образцами фекалий, сточных вод, слюны и мокроты в течение 18 часов при 37 градусах Цельсия. Поместите холодную пластину при минус 80 градусах Цельсия для использования после завершения периода экстракции. Когда экстракция будет завершена, поместите образцы на холодную пластину на 15 минут, чтобы вытянуть водяной пар из HSP и пространства над головой флакона, а затем перенесите HSP на рукава.Настройте последовательность образцов в программном обеспечении Entech. Откройте программу и выберите 5800 и Sequence в опциях справа от выпадающего меню Инструмент. Сохраните таблицу последовательностей, выберите Выполнить слева, а затем Начните с пустого в Десорбере, если пустой HSP не является десорбером.Обратите внимание, что HSP будут обрабатываться SPR для каждого образца в последовательности. Пусть SPR разогреется. Разрешите SPR автоматически запускать все образцы.Последовательность на стороне GC-MS автоматически записывает данные в отдельные файлы. Добавьте пик к методу обработки, выбрав «Калибровка», а затем «Изменить соединение», «Имя» и «Вставить соединение» в разделе «Внешнее стандартное соединение». Добавьте название соединений, время удержания и квантовый сигнал целевого иона.Добавьте три самых больших пика, которые включают соединения с вероятностью более 75%, гарантируя, что выравнивание каждого идентифицирующего иона соединения лежит в центре пика. Сохраните его, выбрав OK, а затем Метод и Сохранить. После настройки метода процесса перейдите к параметрам Quantitate and Calculate, затем View and QEDIT Quant Result (Просмотр и QEDIT Quant Result) для количественной оценки данных.Здесь вакуумная экстракция сорбента сопровождалась термической десорбцией на GC-MS для обследования летучих профилей бактериальных моно- и кокультур и выявления активно продуцируемых летучих веществ со стабильным изотопным зондированием из человеческих фекалий, слюны, сточных вод и образцов мокроты. Моно- и кокультуры состояли из видов бактерий staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa и acinetobacter baumannii. 43 аннотированные летучие молекулы были обнаружены из моно- и ко-культур в 24- и 48-часовых временных точках.Было больше включения 13C в полностью меченые летучие молекулы по сравнению с дейтерием. 13C был включен в 2-бутанон, 3-гидрокси, 2, 3-бутандион диацетил, уксусную кислоту и фенол для всех образцов фекалий, сточных вод и слюны. Ацетон, бутановая кислота и пропановая кислота были обнаружены как меченые в слюне и сточных водах.в то время как диметилтрисульфид и дисульфид диметил были обогащены как в образцах фекалий, так и в образцах слюны. Летучие вещества 1-пропанол, 2-бутанон, бензофенон, этанол и метилтиол ацетат обогащались только в сточных водах и 2, 3-пентандион в слюне. Дейтерий был включен в летучие вещества уксусной кислоты, бензальдегида, 4-метил-диметилтрисульфида и фенола из образцов слюны или сточных вод.Уксусная кислота, диметилтрисульфид, ацетон и пропанол 2-метил были более распространены в культивируемых образцах мокроты, чем в образцах некультурной мокроты. Перестановочный многомерный анализ вариантов, PERMANOVA, был выполнен на матрице расстояний Брея-Кертиса летучих изобилий из образцов мокроты муковисцидоза. Мы обнаружили, что субъект, который пожертвовал образец, объясняет 51% вариаций в 13C-меченой культивируемой мокроте и 33% вариации в некультурной мокроте.Здесь показан успех маркировки стабильных изотопов глюкозой 13C в летучих веществах из образцов культивируемой мокроты, собранных у семи человек с муковисцидозом. Летучие вещества, которые имеют более высокую инкорпорацию 13C для большинства образцов, показаны на панели 5A, те, которые имеют более низкопроцентное включение 13C в большинстве образцов мокроты, находятся в панели 5B, а молекулы с более низким процентным преобразованием 13C в меньшинстве образцов мокроты показаны на панели 5C. Всегда дважды проверяйте давление во флаконах примерно через минуту.Сломанный вакуум снижает чувствительность и скорость метода VASE. После этой процедуры, если было проведено зондирование стабильных изотопов, ДНК может быть извлечена из оставшегося материала для идентификации микробных организмов или видов, которые могли способствовать производству летучих молекул. Этот метод также полезен при обнаружении летучих веществ из любого типа образца без изотопного зондирования.Благодаря преимуществам чувствительности и низкому объему образца многие приложения могут извлечь выгоду из этого метода.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Подражая функции сигнальных белков: на пути к искусственному трансдукции сигнала терапии

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Мультимеру-PAGE: метод для захвата и Разрешающая белковых комплексов в биологических образцах

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Оптимизированный протокол для извлечения белков из митрального клапана человека

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Захват кинетика взаимодействия ионного канала белка с малых молекул в Assay интерферометрии био слоя

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Масс-спектрометрия спрей лист: Быстрое окружающего ионизации техника непосредственно оценить метаболитов из растительных тканей

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Профилирование летучих соединений в плодах черной смородины с использованием твердофазной микроэкстракции в сочетании с газовой хроматографией-масс-спектрометрией

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Абсолютное количественное определение пирофосфатов инозитола методом масс-спектрометрии капиллярного электрофореза Электрораспылительная ионизация масс-спектрометрии

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Восстановление экстракции Msp1 с полностью очищенными компонентами

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Ультразвуковая экстракция каннабидиолевой кислоты из биомассы каннабиса

Industrial hemp (Cannabis spp.) has many compounds of interest with potential medical benefits. Of these compounds, cannabinoids have come to the center ...