Name: capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction
Uploaded: 2022-06-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

Vi tackar Heather Maughan och Linda M. Kalikin för noggrann redigering av detta manuskript. Detta arbete stöddes av NIH NHLBI (anslag 5R01HL136647-04).

1. Överväganden för Headspace Sorbent Pen (HSP) och provanalys
OBS: HSP som innehåller sorbent tenax TA valdes för att fånga ett brett spektrum av flyktiga ämnen. Tenax har en lägre affinitet för vatten jämfört med andra sorbenter, vilket gör det möjligt att fånga fler VOC från prover med högre fuktighet. Tenax har också en låg nivå av föroreningar och kan konditioneras för återanvändning. Sorbentval gjordes också med hänsyn till kolonnen installerad i GC-MS (se ...

<ol>
	<li>Van Berkel, J. J. B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+profile+of+volatile+organic+compounds+in+breath+discriminates+COPD+patients+from+controls.">A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls.</a> Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).</li><li>Nakhleh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+active+pulmonary+tuberculosis+with+a+breath+test+using+nanomaterial-based+sensors.">Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors.</a> European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).</li><li>Lim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+diagnosis+of+tuberculosis+from+analysis+of+urine+volatile+organic+compounds.">Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds.</a> ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).</li><li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+volatile+organic+compounds+in+exhaled+breath+to+diagnose+ventilator-associated+pneumonia.">Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia.</a> Scientific Reports. 5, 17179 (2015).</li><li>Paff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+molecular+profiles+in+the+assessment+of+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia.">Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).</li><li>Robroeks, C. M. H. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+volatile+organic+compounds+in+cystic+fibrosis+patients+and+controls.">Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls.</a> Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).</li><li>Neerincx, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+cyanide+emission+in+the+lung+by+Staphylococcus+aureus.">Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus.</a> European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).</li><li>Goeminne, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+sputum+headspace+through+volatile+organic+compound+analysis.">Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis.</a> Respiratory Research. 13, 87 (2012).</li><li>Joensen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+breath+analysis+using+Electronic+Nose+in+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia+patients+with+chronic+pulmonary+infections.">Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections.</a> PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).</li><li>Nasir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+molecules+from+bronchoalveolar+lavage+fluid+can+'rule-in'+Pseudomonas+aeruginosa+and+'rule-out'+Staphylococcus+aureus+infections+in+cystic+fibrosis+patients.">Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients.</a> Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).</li><li>Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatiles+in+inter-specific+bacterial+interactions.">Volatiles in inter-specific bacterial interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).</li><li>Gao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+polymicrobial+metabolism+in+cystic+fibrosis+airways:+Pseudomonas+aeruginosa+metabolism+and+physiology+are+influenced+by+Rothia+mucilaginosa-derived+metabolites.">Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites.</a> mSphere. 3 (2), 00151 (2018).</li><li>Schoenheimer, R., Rittenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deuterium+as+an+indicator+in+the+study+of+intermediary+metabolism.">Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism.</a> Science. 82 (2120), 156-157 (1935).</li><li>Neubauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+application+of+microbial+lipids+as+tracers+of+Staphylococcus+aureus+growth+rates+in+cystic+fibrosis+sputum.">Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).</li><li>Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GC-MS+analysis+of+ethanol+and+other+volatile+compounds+in+micro-volume+blood+samples-quantifying+neonatal+exposure.">GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).</li><li>Mayor, A. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+sample+preparation+for+direct+SPME-GC-MS+analysis+of+murine+and+human+faecal+volatile+organic+compounds+for+metabolomic+studies.">Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies.</a> Journal of Analytical &amp; Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).</li><li>Camarasu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headspace+SPME+method+development+for+the+analysis+of+volatile+polar+residual+solvents+by+GC-MS.">Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).</li><li>Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer+volatile+analysis:+optimization+of+HS/SPME+coupled+to+GC/MS/FID.">Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID.</a> Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).</li><li>Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+headspace+solid-phase+dynamic+extraction+to+analyse+the+volatile+fraction+of+food+matrices.">Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices.</a> Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).</li><li>Trujillo-Rodr&#237;guez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuum-assisted+sorbent+extraction:+An+analytical+methodology+for+the+determination+of+ultraviolet+filters+in+environmental+samples.">Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples.</a> Talanta. 208, 120390 (2020).</li><li>Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+algae-based+treatment+of+herbicide-contaminated+groundwater.">Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater.</a> Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).</li><li>Psillakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+vacuum:+an+emerging+experimental+parameter+to+consider+during+headspace+microextraction+sampling.">The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+daily+dynamics+of+cystic+fibrosis+airway+microbiota+during+clinical+stability+and+at+exacerbation.">The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation.</a> Microbiome. 3, 12 (2015).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Mahboubi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-based+and+culture-independent+bacteriologic+analysis+of+cystic+fibrosis+respiratory+specimens.">Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).</li></ol>

För att identifiera flyktig produktion i in vitro-kulturer och humanassocierade prover utfördes flyktig analys av mono- och samkulturer av P. aeruginosa, S. aureus och A. baumanii och stabil isotopprobning av olika biologiska prover. I analysen för mono- och samkulturerna detekterades flyktiga ämnen genom att utföra en kort extraktion i 1 timme vid 70 °C. Den flyktiga analysen av mono- och samkulturer möjliggjorde undersökning av de föreningar som produceras både av enskilda arter oc...

Flyktiga organiska föreningar (VOC) har stort löfte för bakteriell detektion och identifiering eftersom de emitteras från alla organismer, och olika mikrober har unika VOC-signaturer. Flyktiga molekyler har använts som en icke-invasiv mätning för att detektera olika luftvägsinfektioner inklusive kronisk obstruktiv lungsjukdom1, tuberkulos2 i urin3 och ventilatorassocierad lunginflammation4, förutom att skilja personer med cystisk fibros (CF) från friska kontrollpersoner 5,6. Flyktiga signaturer har till och med använts för att särskilja specifika patogeninfektioner vid CF (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 och S. aureus vs. P. aeruginosa10). Men med komplexiteten hos sådana biologiska prover är det ofta svårt att fastställa källan till specifika VOC.
En strategi för att lösgöra de flyktiga profilerna från flera infekterande mikrober är att utföra headspace-analys av mikroorganismer i både mono- och samkultur11. Headspace-analys undersöker analyterna som emitteras i "huvudutrymmet" ovanför ett prov snarare än de som är inbäddade i själva provet. Mikrobiella metaboliter har ofta karakteriserats i monokulturer på grund av svårigheten att bestämma ursprunget till mikrobiella metaboliter i komplexa kliniska prover. Genom att profilera flyktiga ämnen från bakteriella monokulturer kan de typer av flyktiga ämnen som en mikrob producerar in vitro representera en baslinje för dess flyktiga repertoar. Att kombinera bakteriekulturer, t.ex. skapa samkulturer, och profilera de flyktiga molekylerna som produceras kan avslöja interaktionerna eller korsmatningen mellan bakterierna12.
En annan strategi för att identifiera det mikrobiella ursprunget för flyktiga molekyler är att tillhandahålla en näringskälla som är märkt med en stabil isotop. Stabila isotoper är naturligt förekommande, icke-radioaktiva former av atomer med ett annat antal neutroner. I en strategi som har använts sedan början av 1930-talet för att spåra aktiv metabolism hos djur13, matar mikroorganismen av den märkta näringskällan och införlivar den stabila isotopen i sina metaboliska vägar. På senare tid har en stabil isotop i form av tungt vatten (D2O) använts för att identifiera metaboliskt aktiv S. aureus i ett kliniskt CF-sputumprov14. I ett annat exempel har 13C-märkt glukos använts för att demonstrera korsmatning av metaboliter mellan CF-kliniska isolat av P. aeruginosa och Rothia mucilaginosa12 .
Med utvecklingen av masspektrometritekniker har metoder för att detektera flyktiga signaler flyttat från kvalitativa observationer till mer kvantitativa mätningar. Genom att använda gaskromatografi masspektrometri (GC-MS) har bearbetning av biologiska prover blivit inom räckhåll för de flesta laboratorie- eller kliniska inställningar. Många metoder för att kartlägga flyktiga molekyler har använts för att profilera prover som mat, bakteriekulturer och andra biologiska prover och luft och vatten för att upptäcka föroreningar. Flera vanliga metoder för flyktig provtagning med hög genomströmning kräver emellertid lösningsmedel och utförs inte med de fördelar som vakuumextraktion ger. Dessutom krävs ofta större volymer eller kvantiteter (större än 0,5 ml) provterade material för analys 15,16,17,18,19, även om detta är substratspecifikt och kräver optimering för varje provtyp och metod.
Här användes vakuumassisterad sorbentextraktion (VASE) följt av termisk desorption på en GC-MS för att kartlägga de flyktiga profilerna för bakteriella mono- och samkulturer och identifiera aktivt producerade flyktiga ämnen med stabil isotopprobning från mänsklig avföring, saliv, avloppsvatten och sputumprover (Figur 1). Med begränsade provmängder extraherades VOC från så lite som 15 μL sputum. Isotopprobningsexperiment med mänskliga prover krävde tillsats av en stabil isotopkälla, såsom 13C glukos, och media för att odla tillväxten av det mikrobiella samhället. Den aktiva produktionen av flyktiga ämnen identifierades som en tyngre molekyl av GC-MS. Extraktion av flyktiga molekyler under ett statiskt vakuum möjliggjorde detektion av flyktiga molekyler med ökad känslighet 20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Stg Diaph Pump</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-10-20030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL VOA vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5719110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Black Caps with hole, no septum</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-39-76044B</td>
			<td>holds lid liner in place on vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm vial liner for sorbent pens</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-L024S</td>
			<td>allows pens to make a vacuum seal at top of vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>5600-SPES</td>
			<td>5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI) media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation Stofware</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-624 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>122-1364E</td>
			<td>60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexsi sofware</td>
			<td>Dexsi (open source)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace Bundle HS-B01, 120VA</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-B01</td>
			<td>Items for running headspace extraction included in bundle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) - blank</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-T3560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53550-792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-OR-L024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Preparation Rail</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbent pen thermal conditioner</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>3801-SPTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Todd Hewitt (TH) media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1438-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction

Flyktiga organiska föreningar (VOC) från biologiska prover har okänt ursprung. VOC kan härröra från värden eller olika organismer inifrån värdens mikrobiella samhälle. För att avlägsna ursprunget till mikrobiella VOC utfördes flyktig headspace-analys av bakteriella mono- och samkulturer av Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa och Acinetobacter baumannii och stabil isotopprobning i biologiska prover av avföring, saliv, avloppsvatten och sputum. Mono- och samkulturer användes för att identifiera flyktig produktion från enskilda bakteriearter eller i kombination med stabil isotopprobning för att identifiera den aktiva metabolismen av mikrober från de biologiska proverna.
Vakuumassisterad sorbentextraktion (VASE) användes för att extrahera VOC. VASE är en lättanvänd, kommersialiserad, lösningsmedelsfri extraktionsmetod för huvudutrymme för halvflyktiga och flyktiga föreningar. Bristen på lösningsmedel och de nära vakuumförhållanden som används vid extraktion gör det relativt enkelt och snabbt att utveckla en metod jämfört med andra extraktionsalternativ som tert-butylering och mikroextraktion i fast fas. Arbetsflödet som beskrivs här användes för att identifiera specifika flyktiga signaturer från mono- och samkulturer. Vidare identifierade analys av den stabila isotopprobningen av humanassocierade biologiska prover VOC som antingen producerades vanligt eller unikt. Detta dokument presenterar det allmänna arbetsflödet och experimentella överväganden för VASE i samband med stabil isotopprobning av levande mikrobiella kulturer.

Mono- och samkulturer av S. aureus, P. aeruginosa och A. baumannii Mono- och samkulturerna bestod av bakteriearterna S. aureus, P. aeruginosa och A. baumannii. Dessa är vanliga opportunistiska patogener som finns i mänskliga sår och kroniska infektioner. För att identifiera de flyktiga molekyler som finns i mono- och samkulturerna utfördes en kort 1-timmars extraktion ...

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Detta protokoll beskriver extraktionen av flyktiga organiska föreningar från ett biologiskt prov med vakuumassisterad sorbentextraktionsmetod, gaskromatografi i kombination med masspektrometri med hjälp av Entech Sample Preparation Rail och dataanalys. Den beskriver också odling av biologiska prover och stabil isotopprobning.

Fånga aktivt producerade mikrobiella flyktiga organiska föreningar från humant associerade prover med vakuumassisterad sorbentextraktion

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Detta protokoll gör det möjligt för oss att enkelt koncentrera och identifiera flyktiga metaboliter och aktivt producerade flyktiga ämnen från mikrobiella organismer i en mängd olika biologiska prover. VASE är en mer användarvänlig metod för att koncentrera flyktiga ämnen med låg förekomst. Allt du behöver är ett prov under nästan vakuum och låt fysiken göra resten.Tillgång till flyktig analys av kliniska prover har viktiga konsekvenser för upptäckten av metaboliska biomarkörer i ett antal olika sjukdomstillstånd. Till exempel kan patogenkörning och infektion eller framgången med antibakteriell terapi detekteras med flyktig analys av saliv, sputum eller andningsprover. För att förbereda fekala prover, tillsätt en milliliter avjoniserat vatten till 100 milligram avföring i ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör och virvel i tre minuter.Förvara proverna på is när de inte används. Tillsätt 485 ml BHI-medium med 20-millimolär 13C-glukos eller BHI med 30% deuterium till 15 mikroliter fekal och vattenblandning, vilket säkerställer att provets slutliga volym är 500 mikroliter. Förbered prover i tekniska tre exemplar.För att förbereda avloppsprover, tillsätt 500 mikroliter avloppsvatten till 500 mikroliter BHI-medium med 13C glukos eller 30% deuterium för en total volym på en milliliter. Förbered prover i tre exemplar och håll dem på is. För att förbereda salivprover, tillsätt 50 mikroliter saliv till 500 mikroliter BHI-medium med 13C glukos eller 30% deuterium för en total volym av 550 mikroliter.Förbered prover i tre exemplar och håll dem på is. För att förbereda sputumprover, tillsätt 15 mikroliter sputum i en injektionsflaska. Förbered prover i tre exemplar och håll dem på is.Placera tomma VOA-injektionsflaskor på den kalla plattan och lägg den kalla plattan på is i biosäkerhetshuven. Slå på 5600 SPEU och justera den till önskad temperatur. Märk 20 ml VOA-injektionsflaskor enligt prover, replikat och HSP-ID med hjälp av en vattenbeständig markör som motstår vatten om kondens bildas på utsidan av injektionsflaskan medan den är på is.Inuti biosäkerhetshuven skruvar du loss det vita locket på flaskan, pipettprov snabbt i flaskan och monterar lockfodret, svart lock och HSP. Placera injektionsflaskan som innehåller provet och HSP tillbaka på den kalla plattan. När alla prover har förberetts i glasflaskorna, sätt på vakuumpumpen, placera flaskorna under vakuum och ta bort vakuumkällan.Dubbelkontrollera trycket efter att ha placerat alla prover under vakuum med hjälp av tryckmätaren. Om en injektionsflaska läcker, se till att locket skruvas fast ordentligt och att de vita O-ringarna på HSP och lockfodren är korrekt på plats. Placera injektionsflaskor i SPEU för optimerad tid och temperatur med omrörning vid 200 rpm.Extrahera kulturer i en timme vid 70 grader Celsius och extrahera stabila isotypprobningsexperiment med fekala, avloppsvatten, saliv och sputumprover i 18 timmar vid 37 grader Celsius. Placera den kalla plattan vid minus 80 grader Celsius för användning efter att extraktionsperioden är klar. När extraktionen är klar, placera prover på den kalla plattan i 15 minuter för att dra ut vattenånga från HSP och injektionsflaskans huvudutrymme och överför sedan HSP: erna till ärmarna.Ställ in sekvensen av prover på Entech-programvaran. Öppna programmet och välj 5800 och Sekvens i alternativen till höger om rullgardinsmenyn Instrument. Spara sekvenstabellen, välj Kör till vänster och sedan Börja med tomt i Desorber om den tomma HSP:en inte är desorberaren.Observera att HSP:er hanteras av SPR för varje prov i sekvensen. Låt SPR värmas upp. Tillåt att SPR kör alla exempel automatiskt.Sekvensen på GC-MS-sidan registrerar automatiskt data i separata filer. Lägg till en topp i bearbetningsmetoden genom att välja Kalibrera följt av Redigera förening, Namn och Infoga förening under Extern standardförening. Lägg till namnet på föreningarna, retentionstiden och kvantsignalmåljonen.Lägg till de tre största topparna, som inkluderar föreningar med större än 75% sannolikhet, vilket säkerställer att inriktningen av varje identifierande jon av föreningen ligger inom mitten av toppen. Spara den genom att välja OK, följt av Metod och Spara. När processmetoden har ställts in fortsätter du till Kvantitera och beräkna, sedan Visa och QEDIT Quant Result för att kvantitera data.Här följdes vakuumassisterad sorbentextraktion av termisk desorption på en GC-MS för att kartlägga de flyktiga profilerna för bakteriella mono- och samkulturer och identifiera aktivt producerade flyktiga ämnen med stabil isotopprobning från mänsklig avföring, saliv, avloppsvatten och sputumprover. Mono- och samkulturerna bestod av bakteriearterna staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa och acinetobacter baumannii. 43 kommenterade flyktiga molekyler detekterades från mono- och samkulturerna vid 24- och 48-timmars tidpunkter.Det fanns mer införlivande av 13C i fullt märkta flyktiga molekyler jämfört med deuterium. 13C införlivades i 2-butanon, 3-hydroxi, 2, 3-butanediondiacetyl, ättiksyra och fenol för alla fekal-, avlopps- och salivprover. Aceton, butansyra och propansyra detekterades som märkta i saliv och avloppsvatten.Dimetyltrisulfid och disulfiddimetyl berikades i både fekala prover och salivprover. De flyktiga ämnena 1-propanol, 2-butanon, bensofenon, etanol och metyltiolacetat berikades endast i avloppsvatten och 2, 3-pentanedion i saliv. Deuterium införlivades i flyktiga ättiksyra, bensaldehyd, 4-metyl-dimetyltrisulfid och fenol från antingen saliv- eller avloppsprover.Ättiksyra, dimetyltrisulfid, aceton och propanol 2-metyl var rikligare i de odlade sputumproverna än odlade sputumprover. En permuterad multivariatanalys av varianter, en PERMANOVA, utfördes på en Bray-Curtis avståndsmatris av de flyktiga överflöden från de cystiska fibrossputumproverna. Vi fann att ämnet som donerade provet förklarar 51% av variationen i 13C-märkt odlat sputum och 33% av variationen i okultiverad sputum.Här visas framgången med stabil isotopmärkning med 13C glukos i flyktiga ämnen från odlade sputumprover som samlats in från sju personer med cystisk fibros. Flyktiga ämnen som har högre 13C-införlivande för majoriteten av proverna visas i panel 5A, de med lägre procent 13C-införlivande i majoriteten av sputumproverna är i panel 5B och molekyler med lägre 13C-procentig omvandling i en minoritet av sputumproverna visas i panel 5C. Dubbelkolla alltid dina injektionsflaskor efter ungefär en minut.Ett trasigt vakuum besegrar KÄNSLIGHETEN OCH HASTIGHETEN HOS VASE-METODEN. Efter denna procedur, om stabil isotopprobning utfördes, kan DNA extraheras från det återstående materialet för att identifiera mikroorganismer eller arter som kan ha bidragit till produktionen av de flyktiga molekylerna. Denna metod är också användbar för att detektera flyktiga ämnen från vilken provtyp som helst utan isotopprobning.Med fördelar med känslighet och låg provvolym kan många applikationer dra nytta av denna teknik.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Imitera funktionen av signalproteiner: Toward Artificial Signaltransduktion Therapy

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-PAGE: Ett förfarande för infångning och Lösa proteinkomplex i biologiska prover

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Optimerat protokoll för extraktion av proteiner från humanmitralventilen

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Fånga interaktion kineticsen av en jonkanal Protein med små molekyler av Bio-lager interferometri analysen

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Leaf Spray masspektrometri: En snabb omgivande jonisering teknik för att direkt bedöma metaboliter från växt vävnader

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Profilering av flyktiga föreningar i svartvinbärsfrukt med headspace solid fas mikroextraktion kopplad till gaskromatografi-masspektrometri

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Absolut kvantifiering av Inositol pyrofosfater av kapillärelektrofores Elektrospray jonisering masspektrometri

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Rekonstitution av Msp1-extraktionsaktivitet med helt renade komponenter

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Ultraljudsassisterad utvinning av cannabidiolic syra från cannabis biomassa

Industrial hemp (Cannabis spp.) has many compounds of interest with potential medical benefits. Of these compounds, cannabinoids have come to the center ...