Name: capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction
Uploaded: 2022-06-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

Bu yazıyı dikkatli bir şekilde düzenledikleri için Heather Maughan ve Linda M. Kalikin'e teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH NHLBI (hibe 5R01HL136647-04) tarafından desteklenmiştir.

1. Headspace Sorbent Pen (HSP) ve numune analizi ile ilgili hususlar
NOT: Sorbent Tenax TA'yı içeren HSP, çok çeşitli uçucuları yakalamak için seçilmiştir. Tenax, diğer sorbentlere kıyasla su için daha düşük bir afiniteye sahiptir, bu da daha yüksek nemli numunelerden daha fazla VOC yakalamasını sağlar. Tenax ayrıca düşük safsızlık seviyesine sahiptir ve yeniden kullanım için şartlandırılabilir. Sorbent seçimi, GC-MS'ye takılan sütun da dikkate alınarak yapılm...

<ol>
	<li>Van Berkel, J. J. B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+profile+of+volatile+organic+compounds+in+breath+discriminates+COPD+patients+from+controls.">A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls.</a> Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).</li><li>Nakhleh, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+active+pulmonary+tuberculosis+with+a+breath+test+using+nanomaterial-based+sensors.">Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors.</a> European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).</li><li>Lim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+diagnosis+of+tuberculosis+from+analysis+of+urine+volatile+organic+compounds.">Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds.</a> ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).</li><li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+volatile+organic+compounds+in+exhaled+breath+to+diagnose+ventilator-associated+pneumonia.">Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia.</a> Scientific Reports. 5, 17179 (2015).</li><li>Paff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+molecular+profiles+in+the+assessment+of+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia.">Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).</li><li>Robroeks, C. M. H. H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+volatile+organic+compounds+in+cystic+fibrosis+patients+and+controls.">Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls.</a> Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).</li><li>Neerincx, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+cyanide+emission+in+the+lung+by+Staphylococcus+aureus.">Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus.</a> European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).</li><li>Goeminne, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+sputum+headspace+through+volatile+organic+compound+analysis.">Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis.</a> Respiratory Research. 13, 87 (2012).</li><li>Joensen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+breath+analysis+using+Electronic+Nose+in+cystic+fibrosis+and+primary+ciliary+dyskinesia+patients+with+chronic+pulmonary+infections.">Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections.</a> PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).</li><li>Nasir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatile+molecules+from+bronchoalveolar+lavage+fluid+can+'rule-in'+Pseudomonas+aeruginosa+and+'rule-out'+Staphylococcus+aureus+infections+in+cystic+fibrosis+patients.">Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients.</a> Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).</li><li>Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatiles+in+inter-specific+bacterial+interactions.">Volatiles in inter-specific bacterial interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1412 (2015).</li><li>Gao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+polymicrobial+metabolism+in+cystic+fibrosis+airways:+Pseudomonas+aeruginosa+metabolism+and+physiology+are+influenced+by+Rothia+mucilaginosa-derived+metabolites.">Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites.</a> mSphere. 3 (2), 00151 (2018).</li><li>Schoenheimer, R., Rittenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deuterium+as+an+indicator+in+the+study+of+intermediary+metabolism.">Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism.</a> Science. 82 (2120), 156-157 (1935).</li><li>Neubauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+application+of+microbial+lipids+as+tracers+of+Staphylococcus+aureus+growth+rates+in+cystic+fibrosis+sputum.">Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).</li><li>Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GC-MS+analysis+of+ethanol+and+other+volatile+compounds+in+micro-volume+blood+samples-quantifying+neonatal+exposure.">GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).</li><li>Mayor, A. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+sample+preparation+for+direct+SPME-GC-MS+analysis+of+murine+and+human+faecal+volatile+organic+compounds+for+metabolomic+studies.">Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies.</a> Journal of Analytical &amp; Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).</li><li>Camarasu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Headspace+SPME+method+development+for+the+analysis+of+volatile+polar+residual+solvents+by+GC-MS.">Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).</li><li>Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beer+volatile+analysis:+optimization+of+HS/SPME+coupled+to+GC/MS/FID.">Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID.</a> Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).</li><li>Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+headspace+solid-phase+dynamic+extraction+to+analyse+the+volatile+fraction+of+food+matrices.">Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices.</a> Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).</li><li>Trujillo-Rodr&#237;guez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuum-assisted+sorbent+extraction:+An+analytical+methodology+for+the+determination+of+ultraviolet+filters+in+environmental+samples.">Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples.</a> Talanta. 208, 120390 (2020).</li><li>Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+algae-based+treatment+of+herbicide-contaminated+groundwater.">Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater.</a> Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).</li><li>Psillakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+vacuum:+an+emerging+experimental+parameter+to+consider+during+headspace+microextraction+sampling.">The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+daily+dynamics+of+cystic+fibrosis+airway+microbiota+during+clinical+stability+and+at+exacerbation.">The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation.</a> Microbiome. 3, 12 (2015).</li><li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Mahboubi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture-based+and+culture-independent+bacteriologic+analysis+of+cystic+fibrosis+respiratory+specimens.">Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).</li></ol>

In vitro kültürlerde ve insanla ilişkili örneklerde uçucu üretimi tanımlamak için, P. aeruginosa, S. aureus ve A. baumanii'nin mono ve ko-kültürlerinin uçucu analizi ve farklı biyolojik örneklerin kararlı izotop sondalaması yapılmıştır. Mono- ve ko-kültürlerin analizinde, 70 °C'de 1 saat kısa bir ekstraksiyon yapılarak uçucular tespit edildi. Mono ve ortak kültürlerin uçucu analizi, hem bireysel türler tarafından hem de diğer türlerle etkileşimleri sırasında ...

Uçucu organik bileşikler (VOC'ler) bakteriyel tespit ve tanımlama için büyük umut vaat etmektedir, çünkü tüm organizmalardan yayılırlar ve farklı mikroplar benzersiz VOC imzalarına sahiptir. Uçucu moleküller, kronik obstrüktif akciğer hastalığı1, idrarda tüberküloz2 3 ve ventilatör ilişkili pnömoni4 dahil olmak üzere çeşitli solunum yolu enfeksiyonlarını tespit etmek için invaziv olmayan bir ölçüm olarak kullanılmış, ayrıca kistik fibrozlu (KF) denekleri sağlıklı kontrol deneklerinden ayırt etmek 5,6. Uçucu imzalar, KF'deki spesifik patojen enfeksiyonları ayırt etmek için bile kullanılmıştır (Staphylococcus aureus 7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 ve S. aureus vs. P. aeruginosa10). Bununla birlikte, bu tür biyolojik örneklerin karmaşıklığı ile, belirli VOC'lerin kaynağını belirlemek genellikle zordur.
Uçucu profilleri çoklu enfekte edici mikroplardan ayırmak için bir strateji, hem mono- hem de ko-kültürdeki mikroorganizmaların kafa boşluğu analizini yapmaktır11. Kafa boşluğu analizi, numunenin kendisine gömülü olanlardan ziyade bir numunenin üzerindeki "kafa boşluğuna" yayılan analitleri inceler. Mikrobiyal metabolitler, karmaşık klinik örneklerde mikrobiyal metabolitlerin kökenini belirlemedeki zorluk nedeniyle mono-kültürlerde sıklıkla karakterize edilmiştir. Bakteriyel mono-kültürlerden uçucuların profilini çıkararak, bir mikrobun in vitro olarak ürettiği uçucu tipler, uçucu repertuarının bir taban çizgisini temsil edebilir. Bakteri kültürlerini birleştirmek, örneğin ortak kültürler oluşturmak ve üretilen uçucu moleküllerin profilini çıkarmak, bakteriler arasındaki etkileşimleri veya çapraz beslenmeyi ortaya çıkarabilir12.
Uçucu moleküllerin mikrobiyal kökenini tanımlamak için bir başka strateji, kararlı bir izotop ile etiketlenmiş bir besin kaynağı sağlamaktır. Kararlı izotoplar doğal olarak oluşur, farklı sayıda nötrona sahip radyoaktif olmayan atom formlarıdır. 1930'ların başından beri hayvanlarda aktif metabolizmayı izlemek için kullanılan bir stratejide13, mikroorganizma etiketli besin kaynağından beslenir ve kararlı izotopu metabolik yolaklarına dahil eder. Daha yakın zamanlarda, klinik bir CF balgam örneği14'te metabolik olarak aktif S. aureus'u tanımlamak için ağır su (D2O) şeklinde kararlı bir izotop kullanılmıştır. Başka bir örnekte, P. aeruginosa ve Rothia mucilaginosa12'nin CF klinik izolatları arasındaki metabolitlerin çapraz beslenmesini göstermek için 13C etiketli glikoz kullanılmıştır.
Kütle spektrometresi tekniklerinin ilerlemesiyle, uçucu ipuçlarını tespit etme yöntemleri nitel gözlemlerden daha nicel ölçümlere geçmiştir. Gaz kromatografisi kütle spektrometresi (GC-MS) kullanılarak, biyolojik numunelerin işlenmesi çoğu laboratuvar veya klinik ortam için ulaşılabilir hale gelmiştir. Uçucu molekülleri araştırmak için birçok yöntem, gıda, bakteri kültürleri ve diğer biyolojik numuneler ve kontaminasyonu tespit etmek için hava ve su gibi numunelerin profilini çıkarmak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, yüksek verimli uçucu numune alımının birkaç yaygın yöntemi çözücü gerektirir ve vakumlu ekstraksiyonun sağladığı avantajlarla gerçekleştirilmez. Ek olarak, 15,16,17,18,19 analizi için genellikle daha büyük hacimler veya miktarlar (0,5 mL'den büyük) numune alınan malzemeler gereklidir, ancak bu substrata özgüdür ve her numune tipi ve yöntemi için optimizasyon gerektirir.
Burada, vakum yardımlı sorbent ekstraksiyonu (VASE), ardından bir GC-MS üzerinde termal desorpsiyon, bakteriyel mono- ve ko-kültürlerin uçucu profillerini araştırmak ve insan dışkısı, tükürük, kanalizasyon ve balgam örneklerinden stabil izotop sondalaması ile aktif olarak üretilen uçucuları tanımlamak için kullanılmıştır (Şekil 1). Sınırlı numune miktarlarıyla, VOC'ler 15 μL balgamdan ekstrakte edildi. İnsan örnekleriyle yapılan izotop sondalama deneyleri, mikrobiyal topluluğun büyümesini geliştirmek için 13C glikoz ve ortam gibi kararlı bir izotop kaynağı eklemeyi gerektiriyordu. Uçucuların aktif üretimi, GC-MS tarafından daha ağır bir molekül olarak tanımlanmıştır. Uçucu moleküllerin statik vakum altında ekstraksiyonu, artan hassasiyete sahip uçucu moleküllerin tespit edilmesini sağladı20,21,22.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>389374-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Stg Diaph Pump</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-10-20030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL VOA vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5719110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Black Caps with hole, no septum</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>01-39-76044B</td>
			<td>holds lid liner in place on vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm vial liner for sorbent pens</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-L024S</td>
			<td>allows pens to make a vacuum seal at top of vial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>5600-SPES</td>
			<td>5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plates</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI) media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemStation Stofware</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-624 column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>122-1364E</td>
			<td>60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>151882-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexsi sofware</td>
			<td>Dexsi (open source)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace Bundle HS-B01, 120VA</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-B01</td>
			<td>Items for running headspace extraction included in bundle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) - blank</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-HS-T3560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53550-792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-rings</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>SP-OR-L024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Preparation Rail</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbent pen thermal conditioner</td>
			<td>Entech Instruments</td>
			<td>3801-SPTC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Todd Hewitt (TH) media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1438-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing actively produced microbial volatile organic compounds from human-associated samples with vacuum-assisted sorbent extraction

Biyolojik örneklerden elde edilen uçucu organik bileşiklerin (VOC'ler) bilinmeyen kökenleri vardır. VOC'ler, konakçıdan veya konağın mikrobiyal topluluğundan farklı organizmalardan kaynaklanabilir. Mikrobiyal VOC'lerin kökenini çözmek için, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa ve Acinetobacter baumannii'nin bakteriyel mono- ve ko-kültürlerinin uçucu kafa boşluğu analizi ve dışkı, tükürük, kanalizasyon ve balgamın biyolojik örneklerinde kararlı izotop sondalaması yapıldı. Mono- ve ko-kültürler, bireysel bakteri türlerinden uçucu üretimi tanımlamak için veya biyolojik örneklerden mikropların aktif metabolizmasını tanımlamak için kararlı izotop sondalaması ile kombinasyon halinde kullanılmıştır.
VOC'leri çıkarmak için vakum yardımlı sorbent ekstraksiyonu (VASE) kullanıldı. VASE, yarı uçucu ve uçucu bileşikler için kullanımı kolay, ticarileştirilmiş, solventsiz bir kafa boşluğu ekstraksiyon yöntemidir. Solventlerin eksikliği ve ekstraksiyon sırasında kullanılan vakuma yakın koşullar, tert-bütilasyon ve katı faz mikroekstraksiyonu gibi diğer ekstraksiyon seçenekleriyle karşılaştırıldığında nispeten kolay ve hızlı bir yöntem geliştirmeyi sağlar. Burada açıklanan iş akışı, mono ve ortak kültürlerden belirli geçici imzaları tanımlamak için kullanılmıştır. Ayrıca, insanla ilişkili biyolojik örneklerin kararlı izotop sondalamasının analizi, yaygın veya benzersiz bir şekilde üretilen VOC'leri tanımladı. Bu yazıda VASE'nin genel iş akışı ve deneysel hususları, canlı mikrobiyal kültürlerin stabil izotop problanması ile birlikte sunulmaktadır.

S. aureus, P. aeruginosa ve A. baumannii'nin mono ve ortak kültürleri Mono ve ortak kültürler, S. aureus, P. aeruginosa ve A. baumannii bakteri türlerinden oluşuyordu. Bunlar, insan yaralarında ve kronik enfeksiyonlarda bulunan yaygın fırsatçı patojenlerdir. Mono- ve ko-kültürlerde bulunan uçucu molekülleri tanımlamak için, 200 rpm ajitasyon ile 70 ° C'de...

Watch this Scientific Journal Video about Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction at JoVE.com

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Bu protokol, biyolojik bir numuneden uçucu organik bileşiklerin vakum destekli sorbent ekstraksiyon yöntemi, Entech Numune Hazırlama Rayı kullanılarak kütle spektrometresi ile birleştirilmiş gaz kromatografisi ve veri analizi ile ekstraksiyonunu açıklar. Ayrıca biyolojik örneklerin kültürünü ve kararlı izotop sondalamasını da açıklar.

Vakum Yardımlı Sorbent Ekstraksiyonu ile İnsanla İlişkili Numunelerden Aktif Olarak Üretilen Mikrobiyal Uçucu Organik Bileşiklerin Yakalanması

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Bu protokol, uçucu metabolitleri ve çeşitli biyolojik örneklerde mikrobiyal organizmalardan aktif olarak üretilen uçucuları kolayca konsantre etmemizi ve tanımlamamızı sağlar. VASE, düşük bolluktaki uçucuları yoğunlaştırmak için daha kullanıcı dostu bir yöntemdir. İhtiyacınız olan tek şey neredeyse vakum altında bir örnek ve gerisini fiziğin yapmasına izin verin.Klinik örneklerin uçucu analizine erişim, bir dizi farklı hastalık durumunda metabolik biyobelirteç keşfi için önemli etkilere sahiptir. Örneğin, patojen sürüşü ve enfeksiyonu veya antibakteriyel tedavinin başarısı, tükürük, balgam veya nefes örneklerinin uçucu analizi ile tespit edilebilir. Fekal numuneler hazırlamak için, 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde ve vorteksinde 100 miligram dışkıya üç dakika boyunca bir mililitre deiyonize su ekleyin.Numuneleri kullanılmadığında buz üzerinde tutun. 15 mikrolitre dışkı ve su karışımına 20 milimolar 13C glikoz ile 485 mililitre BHI ortamı veya% 30 döteryum ile BHI ekleyin ve numunenin son hacminin 500 mikrolitre olmasını sağlayın. Teknik üçlü olarak numuneler hazırlayın.Kanalizasyon numuneleri hazırlamak için, toplam bir mililitre hacim için 13C glikoz veya% 30 döteryum ile 500 mikrolitre BHI ortamına 500 mikrolitre kanalizasyon ekleyin. Numuneleri üçlü olarak hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Tükürük örnekleri hazırlamak için, toplam 550 mikrolitre hacim için 13C glikoz veya% 30 döteryum ile 500 mikrolitre BHI ortamına 50 mikrolitre tükürük ekleyin.Numuneleri üçlü olarak hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Balgam örnekleri hazırlamak için, bir şişeye 15 mikrolitre balgam ekleyin. Numuneleri üçlü olarak hazırlayın ve buz üzerinde tutun.Boş VOA şişelerini soğuk plakaya yerleştirin ve soğuk plakayı biyogüvenlik başlığındaki buzun üzerine yerleştirin. 5600 SPEU'yu açın ve gerekli sıcaklığa ayarlayın. 20 mililitrelik VOA şişelerini numunelere, çoğaltmalara ve HSP ID'lerine göre, buz üzerindeyken şişenin dış kısımlarında yoğuşma oluşması durumunda suya dayanıklı bir işaretleyici kullanarak etiketleyin.Biyogüvenlik başlığının içinde, şişe üzerindeki beyaz kapağı sökün, pipet numunesini hızlıca şişeye sökün ve kapak astarı, siyah kapak ve HSP'yi monte edin. Numuneyi ve HSP'yi içeren şişeyi tekrar soğuk plakaya yerleştirin. Tüm numuneler cam şişelerde hazırlandıktan sonra, vakum pompasını açın, şişeleri vakum altına yerleştirin ve vakum kaynağını çıkarın.Basınç göstergesini kullanarak tüm numuneleri vakum altına yerleştirdikten sonra basıncı iki kez kontrol edin. Bir şişe sızıntı yapıyorsa, kapağın sıkıca vidalandığından ve HSP ve kapak gömleklerinin beyaz O-ringlerinin doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Şişeleri, 200 RPM'de ajitasyon ile optimize edilmiş zaman ve sıcaklık için SPEU'ya yerleştirin.70 santigrat derecede bir saat boyunca kültürleri ayıklayın ve 37 santigrat derecede 18 saat boyunca dışkı, kanalizasyon, tükürük ve balgam örnekleri ile kararlı izotip problama deneylerini çıkarın. Soğuk plakayı, ekstraksiyon süresi tamamlandıktan sonra kullanılmak üzere eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin. Ekstraksiyon tamamlandığında, HSP ve şişe kafa boşluğundan su buharı çekmek için numuneleri 15 dakika boyunca soğuk plakaya yerleştirin, ardından HSP'leri manşonlarına aktarın.Entech yazılımında örneklerin sırasını ayarlayın. Programı açın ve Müzik Aleti açılır menüsünün sağındaki seçeneklerden 5800 ve Sırala'yı seçin. Sıra tablosunu kaydedin, sol tarafta Çalıştır'ı seçin, ardından boş HSP desorber değilse Desorber'da Boş ile Başlat'ı seçin.HSP'lerin dizideki her örnek için SPR tarafından işleneceğini unutmayın. SPR'nin ısınmasına izin verin. SPR'nin tüm örnekleri otomatik olarak çalıştırmasına izin verin.GC-MS tarafındaki dizi, verileri otomatik olarak ayrı dosyalara kaydeder. Kalibre Et'i ve ardından Dış Standart Bileşik altında Bileşik, Ad ve Ekle Bileşiğini Düzenle'yi seçerek işleme yöntemine bir tepe noktası ekleyin. Bileşiklerin adını, tutma süresini ve miktar sinyali hedef iyonunu ekleyin.% 75'ten daha büyük bir olasılığa sahip bileşikleri içeren en büyük üç tepe noktasını ekleyin, böylece bileşiğin her bir tanımlayıcı iyonunun hizalanmasının zirvenin merkezinde olmasını sağlayın. Tamam'ı, ardından Yöntem ve Kaydet'i seçerek kaydedin. İşlem yöntemi ayarlandıktan sonra, verileri ölçmek için Quantitate and Calculate, ardından View ve QEDIT Quant Result (Niceliksel Sonucu) bölümüne geçin.Burada, vakum yardımlı sorbent ekstraksiyonunu, bakteriyel mono-ve ko-kültürlerin uçucu profillerini araştırmak ve insan dışkısı, tükürük, kanalizasyon ve balgam örneklerinden stabil izotop sondalaması ile aktif olarak üretilen uçucuları tanımlamak için bir GC-MS üzerinde termal desorpsiyon izledi. Mono-ve ko-kültürler staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa ve acinetobacter baumannii bakteri türlerinden oluşuyordu. Mono ve ko-kültürlerden 24 ve 48 saatlik zaman noktalarında 43 açıklamalı uçucu molekül tespit edildi.Döteryuma kıyasla 13C'nin tamamen etiketlenmiş uçucu moleküllere daha fazla dahil edilmesi söz konusuydu. 13C, tüm fekal, kanalizasyon ve tükürük örnekleri için 2-bütanon, 3-hidroksi, 2, 3-bütandion diasetil, asetik asit ve fenol içine dahil edildi. Aseton, bütanoik asit ve propanoik asit, tükürük ve kanalizasyonda etiketlenmiş olarak tespit edildi.dimetil trisülfit ve disülfit dimetil ise hem fekal hem de tükürük örneklerinde zenginleştirilmiştir. Uçucu 1-propanol, 2-bütanon, benzofenon, etanol ve metiltiol asetat sadece kanalizasyonda ve 2, 3-pentanedion tükürükte zenginleştirildi. Döteryum, tükürük veya kanalizasyon örneklerinden uçucu asetik asit, benzaldehit, 4-metil-dimetil trisülfür ve fenol içine dahil edildi.Asetik asit, dimetil trisülfit, aseton ve propanol 2-metil, kültürlenmiş balgam örneklerinde kültürlenmemiş balgam örneklerinden daha fazlaydı. Varyantların permute edilmiş çok değişkenli bir analizi, bir PERMANOVA, kistik fibroz balgam örneklerinden uçucu bollukların Bray-Curtis mesafe matrisi üzerinde gerçekleştirildi. Örneği bağışlayan deneğin, 13C etiketli kültürlü balgamdaki varyasyonun% 51'ini ve kültürsüz balgamdaki varyasyonun% 33'ünü açıkladığını bulduk.Burada, kistik fibrozisli yedi kişiden toplanan kültürlü balgam örneklerinden elde edilen uçucularda 13C glikoz ile stabil izotop etiketlemenin başarısı gösterilmiştir. Numunelerin çoğunluğu için daha yüksek 13C birleşmesine sahip uçucular panel 5A'da, balgam numunelerinin çoğunda daha düşük yüzde 13C dahil olanlara sahip olanlar panel 5B'de ve balgam numunelerinin azınlığında daha düşük yüzde 13C dönüşümüne sahip moleküller panel 5C'de gösterilmiştir. Her zaman yaklaşık bir dakika sonra şişe basınçlarınızı iki kez kontrol edin.Kırık bir vakum, VASE yönteminin hassasiyetini ve hızını yener. Bu prosedürü takiben, kararlı izotop sondalaması yapılmışsa, uçucu moleküllerin üretimine katkıda bulunmuş olabilecek mikrobiyal organizmaları veya türleri tanımlamak için DNA, kalan materyalden çıkarılabilir. Bu yöntem, izotop probu olmadan herhangi bir numune türünden uçucuların tespit edilmesinde de yararlıdır.Hassasiyet ve düşük numune hacmi avantajları ile birçok uygulama bu teknikten yararlanabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Sinyal Proteinlerin Fonksiyonu taklit: Yapay Sinyal İletimi Tedavisi Doğru

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

İnsan Mitral Valfinden Proteinlerin Çıkarılması İçin Optimize Edilmiş Protokol

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Bir iyon kanal protein biyo-katman Interferometry tahlil tarafından küçük molekülleri ile etkileşimi Kinetik yakalama

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Yaprak sprey kütle spektrometresi: Doğrudan metabolitleri bitki doku üzerinden değerlendirmek için bir hızlı ortam iyonlaşma tekniği

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi ile Birleştirilmiş Headspace Katı Faz Mikroextraction Kullanarak Frenk Üzümü Meyvesinde Uçucu Bileşiklerin Profillemesi

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...

Absolute Quantitation of Inositol Pyrophosphates by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry

İnositol Pirofosfatların Kapiler Elektroforez Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometrisi ile Mutlak Kantitasyonu

Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are an important group of intracellular signaling molecules. Derived from inositol phosphates (InsPs), these molecules ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Msp1 Ayıklama Etkinliğinin Tamamen Saflaştırılmış Bileşenlerle Yeniden Uzlaştırılması

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Esrar Biyokütlesinden Esrar Destekli Esrar Asidinin Ultrasonik Destekli Ekstraksiyonu

Industrial hemp (Cannabis spp.) has many compounds of interest with potential medical benefits. Of these compounds, cannabinoids have come to the center ...