Name: quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation
Uploaded: 2021-05-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation at JoVE.com

De auteurs willen Dr. Getulio Pereira bedanken voor zijn hulp bij extracellulair blaasjeswerk.
Dit werk werd ondersteund door de volgende National Institute of Health-subsidies aan ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 en UG3TR002881.

Het experimentele protocol dat in deze studie werd gebruikt, werd goedgekeurd door de Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).
1. Instrument instellen
OPMERKING: Voor het afbeelden van zwevende cellen moeten twee zeldzame aard neodymiummagneten die op de z-as zijn gemagnetiseerd, worden geplaatst met dezelfde pool naar elkaar toe om een magnetisch veld te genereren. De afstand tussen de magneten kan worden aangepast afhankelijk van de int...

<ol>
	<li>Tasoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levitational+Image+Cytometry+with+Temporal+Resolution.">Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution.</a> Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).</li><li>Durmus, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+levitation+of+single+cells.">Magnetic levitation of single cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (28), 3661-3668 (2015).</li><li>Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-Phone+Based+Magnetic+Levitation+for+Measuring+Densities.">Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities.</a> PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).</li><li>Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+Levitated+Plasma+Proteins.">Magnetically Levitated Plasma Proteins.</a> Analytical Chemistry. 92 (2), 1663-1668 (2020).</li><li>Yaman, S., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Susceptibility-Based+Protein+Detection+Using+Magnetic+Levitation.">Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation.</a> Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).</li><li>Abrahamsson, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Powders+Containing+Illicit+Drugs+Using+Magnetic+Levitation.">Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation.</a> Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).</li><li>Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+cell+density+alter+protein+markers+of+multiple+cellular+compartments,+confounding+experimental+outcomes.">Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes.</a> PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).</li><li>Hart, A., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+fluctuations+during+the+cell+cycle+of+Bacillus+subtilis.">Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis.</a> Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).</li><li>Poole, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+buoyant+density+during+the+cell+cycle+of+Escherichia+coli+K12:+significance+for+the+preparation+of+synchronous+cultures+by+age+selection.">Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection.</a> The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).</li><li>Cass, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density-dependent+fluctuations+in+membrane+permeability+in+logarithmically+growing+cell+cultures.">Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures.</a> Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).</li><li>Grover, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+density.">Measuring single-cell density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 10992-10996 (2011).</li><li>Bryan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single+cell+mass,+volume,+and+density+with+dual+suspended+microchannel+resonators.">Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators.</a> Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).</li><li>Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+sensing+and+size+determination.">Cell density sensing and size determination.</a> Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).</li><li>Neurohr, G. E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+and+Regulation+of+Cell+Density.">Relevance and Regulation of Cell Density.</a> Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).</li><li>Maric, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+gradients+in+proliferation+and+differentiation+of+embryonic+rat+CNS+accessed+by+buoyant+density+fractionation:+alpha+3,+beta+3+and+gamma+2+GABAA+receptor+subunit+co-expression+by+post-mitotic+neocortical+neurons+correlates+directly+with+cell+buoyancy.">Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy.</a> European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).</li><li>Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+gradient+fractionation+and+flow+cytometric+analysis+of+embryonic+rat+cortical+neurons+and+progenitor+cells.">Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells.</a> Methods. 16 (3), 247-259 (1998).</li><li>Wolff, D. A., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+HeLa+cells+by+colloidal+silica+density+gradient+centrifugation.+I.+Separation+and+partial+synchrony+of+mitotic+cells.">Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells.</a> Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).</li><li>Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+replication,+cytopathology,+and+lysosomal+enzyme+response+of+mitotic+and+interphase+Hep-2+cells+infected+with+poliovirus.">Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus.</a> Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).</li><li>Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+variation+during+the+cell+cycle+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).</li><li>Yurinskaya, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymocyte+K+,+Na++and+water+balance+during+dexamethasone-+and+etoposide-induced+apoptosis.">Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).</li><li>Wyllie, A. H., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-induced+cell+death.+Purification+ad+properties+of+thymocytes+undergoing+apoptosis+after+glucocorticoid+treatment.">Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment.</a> American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).</li><li>Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-induced+cell+death.+2.+Surface+changes+in+thymocytes+undergoing+apoptosis.">Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis.</a> American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).</li><li>Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cell+volume+loss+in+CEM-C7A+cells+during+dexamethasone-induced+apoptosis.">Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis.</a> American Journal of Physiology. 270 (4), 1190-1203 (1996).</li><li>Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+density+and+volume+in+normal+subjects+and+in+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia.">Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 48 (3), 361-371 (1976).</li><li>Huber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+the+buoyant+density+distribution+of+normal+and+malignant+lymphocytes.">A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes.</a> British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).</li><li>Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunological+enrichment+method+for+epithelial+cells+from+peripheral+blood.">An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood.</a> Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).</li><li>Andersen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Implementation+of+Magnetic+Levitation+to+Quantify+Leukocyte+Size,+Morphology,+and+Magnetic+Properties+to+Identify+Patients+with+Sepsis.">A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis.</a> Shock. , (2018).</li><li>Felton, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+subtle+changes+in+red+blood+cell+density+using+a+cell+phone.">Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone.</a> Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).</li><li>Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+pinocytosis+in+lymphoid+cells+has+a+low+capacity.">Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity.</a> Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).</li></ol>

Gradiëntcentrifugatie is momenteel de standaardtechniek voor het isoleren van subcellulaire componenten op basis van hun unieke dichtheden. Deze aanpak vereist echter het gebruik van gespecialiseerde gradiëntmedia en centrifuge-apparatuur. De magnetische levitatiebenadering die hier wordt gepresenteerd, maakt gedetailleerd onderzoek mogelijk naar de morfologische en functionele eigenschappen van circulerende cellen, met minimale, indien enige manipulatie van de cellen, waardoor een bijna in vivo toegang tot ci...

Magnetische levitatie is een techniek die is ontwikkeld om celtypen1,2,3,eiwitten4,5 en opioïden6 te scheiden, analyseren en identificeren, uitsluitend op basis van hun specifieke dichtheid en paramagnetische eigenschappen. Celdichtheid is een unieke, intrinsieke eigenschap van elk celtype die direct verband houdt met de stofwisseling en differentiatiestatus7,8,9,10,11,12,13,14. Het kwantificeren van subtiele en voorbijgaande veranderingen in celdichtheid tijdens steady state-omstandigheden en tijdens een verscheidenheid aan celprocessen, zou iemand een ongeëvenaard inzicht in celfysiologie en pathofysiologie kunnen bieden. Veranderingen in celdichtheid zijn geassocieerd met celdifferentiatie15,16,celcyclusprogressie9,17,18,19,apoptose20,21,22,23en kwaadaardige transformatie24,25,26 . Daarom kan kwantificering van specifieke veranderingen in celdichtheid worden gebruikt om onderscheid te maken tussen cellen van verschillende typen, en om onderscheid te maken tussen hetzelfde type cellen dat verschillende activeringsprocessen ondergaat. Dit maakt experimenten mogelijk die zich richten op een bepaalde celsubpopulatie, waarbij dynamische veranderingen in dichtheid dienen als een indicator van veranderd celmetabolisme27. Aangezien is vastgesteld dat een cel zijn dichtheid kan veranderen als reactie op een veranderende omgeving7, is het noodzakelijk om de kinetiek van de cel te meten in relatie tot zijn dichtheid om deze volledig te begrijpen, wat de huidige methoden mogelijk niet bieden12. Magnetische levitatie daarentegen zorgt voor een dynamische evaluatie van cellen en hun eigenschappen28.
Cellen zijn diamagnetisch, wat betekent dat ze geen permanent magnetisch dipoolmoment hebben. Bij blootstelling aan een extern magnetisch veld wordt echter een zwak magnetisch dipoolmoment gegenereerd in de cellen, in de tegenovergestelde richting van het toegepaste veld. Dus als cellen worden opgehangen in een paramagnetische oplossing en worden blootgesteld aan een sterk verticaal magnetisch veld, zullen ze weg zweven van de magnetische bron en stoppen tot een hoogte, die voornamelijk afhangt van hun individuele dichtheid. Diamagnetische levitatie van een object dat beperkt is tot het minimum van een inhomogeen magnetisch veld is mogelijk wanneer aan de volgende twee criteria is voldaan: 1) de magnetische gevoeligheid van het deeltje moet kleiner zijn dan die van het omringende medium, en 2) de magnetische kracht moet sterk genoeg zijn om tegenwicht te bieden aan de drijfkracht van het deeltje. Aan beide criteria kan worden voldaan door RBC's in een magnetische buffer op te hangen en door sterke magnetische veldgradiënten te creëren met kleine, goedkope, in de handel verkrijgbare permanente magneten1. De evenwichtspositie van een magnetisch gevangen deeltje op een as langs de zwaartekrachtrichting wordt bepaald door zijn dichtheid (ten opzichte van de dichtheid van de buffer), zijn magnetische gevoeligheid (ten opzichte van de magnetische gevoeligheid van de buffer) en de signatuur van het toegepaste magnetische veld. Omdat de dichtheid en de magnetische eigenschappen van de oplossing constant zijn in het hele systeem, zullen de intrinsieke dichtheidseigenschappen van de cellen de belangrijkste factor zijn die de levitatiehoogte van de cellen bepaalt, waarbij dichtere cellen lager zweven in vergelijking met minder dichte cellen. Deze benadering maakt gebruik van een set van twee dichtheidsreferentieparels (1,05 en 1,2 g / ml) waarmee we nauwkeurige, ratiometrische analyse kunnen gebruiken voor dichtheidsmetingen. Door de concentratie van de magnetische oplossing te veranderen, kan men verschillende cellulaire populaties, zoals RBC's, isoleren van WBC's, omdat de dichtheid van circulerende cellen celspecifiek is, waardoor isolatieprotocollen of andere celmanipulatie niet meer nodig zijn.
De meeste detectiemethoden die in biologisch onderzoek worden gebruikt, zijn gebaseerd op extrapolatie van specifieke bindingsgebeurtenissen in gemakkelijk te kwantificeren lineaire signalen. Deze uitleesmethoden zijn vaak complex en omvatten gespecialiseerde apparatuur en toegewijd wetenschappelijk personeel. Een benadering gericht op de detectie van antigenen gevonden op het plasmamembraan van cellen of extracellulaire blaasjes of die oplosbaar zijn in plasma, met behulp van een of twee antilichaam gecoate kralen, wordt hierin beschreven. De kralen moeten van verschillende dichtheden zijn en van die van de ondervraagde doelwitten. De aanwezigheid van het doelantigeen in een bepaald biofluïde wordt vertaald in een specifieke, meetbare verandering in de levitatiehoogte van een antigeenpositieve cel die gebonden is aan een detectiekraal. In het geval van oplosbare antigenen of extracellulaire blaasjes zijn ze gebonden aan zowel vangst- als detectieparels, waardoor een kraal-kraalcomplex wordt gevormd in plaats van een kralencelcomplex. De verandering in levitatiehoogte hangt af van de nieuwe dichtheid van de kraalcel- of kraal-kraalcomplexen. Naast de verandering in de levitatiehoogte van de complexen, die de aanwezigheid van antigeen in de biofluïde aangeeft, is het aantal complexen ook afhankelijk van de hoeveelheid doel, waardoor magnetische levitatie ook een kwantitatieve benadering is voor antigeendetectie24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-2933</td>
			<td>(MES); component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197&#34;) thickness</td>
			<td>K&#38;J Magnetics</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Magnets used for the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Tube Sealant (Critoseal)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>267620</td>
			<td>Used to cap the ends of the capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS8163</td>
			<td>Used to wash beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Lab Jack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ750</td>
			<td>Used for adjusting the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Solution for bead suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9508-100ML</td>
			<td>Used during a wash step for beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37608</td>
			<td>Used to stain Rh+ cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol Injection</td>
			<td>ProHance</td>
			<td>NDC 0270-1111-03</td>
			<td>Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS++</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td>Solution for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C5b,6 complex</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A122</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C7 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A124</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C8 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A125</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C9 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A126</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Series Post Collar</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSR2</td>
			<td>Used to secure magnetic levitation device to lab jacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1769-10G</td>
			<td>(EDC); used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AB-105-C</td>
			<td>Used to coat beads as a control condition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BM-220</td>
			<td>Component of coupling buffer, used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td>Component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Carboxyl Polymer</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>PC06004</td>
			<td>Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit RhD Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-112694</td>
			<td>Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Grade Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Provis AX-70</td>
			<td>Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Dampening Feet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RDF1</td>
			<td>Used to support the breadboard table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Boro Tubing</td>
			<td>VitroTubes</td>
			<td>8100-050</td>
			<td>Capillary tube used for loading sample into Maglev</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>24510</td>
			<td>Used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translational Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT1</td>
			<td>Used for focusing and for scanning capillary tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation

De beschreven methode is ontwikkeld op basis van de principes van magnetische levitatie, die cellen en deeltjes scheidt op basis van hun dichtheid en magnetische eigenschappen. Dichtheid is een celtype identificerende eigenschap, direct gerelateerd aan de stofwisseling, differentiatie en activeringsstatus. Magnetische levitatie maakt een aanpak in één stap mogelijk om circulerende bloedcellen met succes te scheiden, in beeld te brengen en te karakteriseren, en om bloedarmoede, sikkelcelziekte en circulerende tumorcellen te detecteren op basis van dichtheid en magnetische eigenschappen. Deze aanpak is ook vatbaar voor het detecteren van oplosbare antigenen die aanwezig zijn in een oplossing door gebruik te maken van sets kralen met lage en hoge dichtheid bedekt met respectievelijk vang- en detectieantistoffen. Als het antigeen in oplossing aanwezig is, zal het de twee sets kralen overbruggen en een nieuw kralencomplex genereren, dat tussen de rijen met antilichamen bedekte kralen zal zweven. Een verhoogde concentratie van het doelantigeen in oplossing zal een groter aantal kralencomplexen genereren in vergelijking met lagere concentraties antigeen, waardoor kwantitatieve metingen van het doelantigeen mogelijk zijn. Magnetische levitatie is voordelig voor andere methoden vanwege de verminderde monstervoorbereidingstijd en het gebrek aan afhankelijkheid van klassieke uitleesmethoden. Het gegenereerde beeld wordt eenvoudig vastgelegd en geanalyseerd met behulp van een standaardmicroscoop of mobiel apparaat, zoals een smartphone of een tablet.

Magnetische levitatie richt objecten van verschillende dichtheden op verschillende levitatiehoogten, afhankelijk van de dichtheid van het object, de magnetische signatuur, de concentratie van paramagnetische oplossing en de sterkte van het magnetisch veld gecreëerd door twee sterke, zeldzame aardmagneten. Omdat de twee magneten op elkaar zijn geplaatst, kunnen zwevende monsters alleen worden bekeken, met behoud van Köhler-verlichting, met behulp van een microscoop die op zijn kant isgedraaid (figuu...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation at JoVE.com

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Dit artikel beschrijft een op magnetische levitatie gebaseerde methode die specifiek de aanwezigheid van antigenen kan detecteren, oplosbaar of membraangebonden, door veranderingen in de levitatiehoogte van vanvangkralen met vaste dichtheden te kwantificeren.

Kwantificering van cellulaire dichtheden en antigene eigenschappen met behulp van magnetische levitatie

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Deze techniek maakt scheiding mogelijk van verschillende celtypen en cellen die verschillende processen ondergaan die uitsluitend gebaseerd zijn op dichtheid met weinig tot geen manipulatie in een korte periode van tijd. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat het minimaal invasief is, kleine volumes vereist, snelle resultaten biedt, niet afhankelijk is van klassieke uitleingen en dat er geen gespecialiseerd personeel nodig is. Deze techniek kan worden toegepast voor het opsporen van meerdere ziekten, bijvoorbeeld bloedarmoede en sepsis.Gebruik om te beginnen het prikapparaat met één klik om in de vinger van de rhesusfactor positieve bloeddonor te prikken en verzamel 10 microliter bloed in één milliliter DPBS. Voeg een microliter fluorescerende kleurstof toe in een milliliter suspensie van de rhesusfactorpositieve cellen om het plasmamembraan fluorescerend te bevlekken en incubaleer bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Pellet de cellen door gedurende 15 seconden op 5.600 maal G te draaien en was de pellet driemaal met één milliliter DPBS.Resuspend de pellet in één milliliter HBSS met calcium en magnesium. Gebruik het prikapparaat met één klik om in de vinger van de rhesusfactor negatieve bloeddonor te prikken en twee microliter bloed te verzamelen. Om de experimentele buis met alleen kralen te bereiden, voegt u 174 microliter HBSS met calcium en magnesium, één microliter IgG-controleparels, één microliter zware kralen met een dichtheid van 1,2 gram per milliliter en 24 microliter 500 millimolar gadolinium toe.Voeg ter voorbereiding van de experimentele controlebuis met IgG 172 microliter HBSS met calcium en magnesium, één microliter IgG-controleparels, één microliter zware kralen, één microliter rhesusfactornegatief bloed, één microliter gekleurde rhesusfactorpositieve bloedsuspensie en 24 microliter 500 millimolar gadolinium toe. Voeg ter voorbereiding van de experimentele monsterbuis 172 microliter HBSS met calcium en magnesium, één microliter anti-RhD-gecoate kralen, één microliter zware kralen, één microliter rhesusfactornegatief bloed, één microliter gekleurde rhesusfactorpositieve bloedsuspensie en 24 microliter 500 millimolar gadolinium toe. Stel het magnetische levitatieapparaat in.En laad 50 microliter van het monster in een capillaire buis totdat de buis is gevuld. Sluit de uiteinden van de capillaire buis af met een capillaire kit om ervoor te zorgen dat er geen bubbels zijn. Plaats de capillaire buis in de capillaire houder tussen de bovenste en onderste magneten, pas het podium en de focus aan voor optimaal zicht.Wacht ongeveer vijf tot 20 minuten totdat de cellen en kralen zich op hun magnetische evenwichtspositie hebben gevestigd. Met behulp van dit protocol werden de bloedcellen gescheiden afhankelijk van de levitatiehoogte met behulp van het magnetische levitatieapparaat. Kralen met lage en hoge dichtheid werden gebruikt om dichtheids levitatiehoogten en maatreferenties te bieden.De polymorfinucleaire cellen zweefden boven de rode bloedcellen met een concentratie van 21 millimolaire gadoliniumionen. Oude bloedcellen zweefden bij een concentratie van 60 millimolaire gadoliniumionen. De rode bloedcellen, polymorfinucleaire cellen en lymfocyten werden gescheiden bij een concentratie van 40 millimolaire gadoliniumionen op basis van hun intrinsieke dichtheden.Het rhesusfactorantigeen werd gedetecteerd op de rode bloedcellen met behulp van IgG en anti-RhD-antilichaam gecoate kralen. De kraalrodooscelcomplexen werden niet gegenereerd in het IgG-controlemonster, maar de fluorescerend gekleurde rode bloedcellen gevangen door de rhesusfactorpositieve kralen werden gedetecteerd. De binding van de anti-RhB aan de rhesusfactorpositieve cellen creëerde een kralencelcomplex in het centrum met intermitterende dichtheid van de ongebonden kralen en de negatieve rode bloedcellen.Verder werd de complexe formatie bevestigd door de uitgezonden fluorescentie te observeren. De B-kraalcomplexen gevormd tussen de kralen met hoge en lage dichtheid bedekt met de antilichamen voor CR1 en CD47 wijzen op de aanwezigheid van van rode bloedcellen afgeleide extracellulaire blaasjes. Het afdekken van het capillair zonder bubbels te introduceren is de meest uitdagende stap en vereist oefening.Deze methode zou inzicht kunnen geven voor de hematologie, met name gericht op rode bloedcelziekten.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Kwantificeren mengen met behulp van Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

AFM-gebaseerde kaart brengen van de elastische eigenschappen van celwanden: op weefsel-, cellulair en Subcellulaire Resoluties

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Cellular Redox Profiling Met High-Content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Vis sperma beoordeling softwarematig en koelingsapparaten

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Visualisering van lymfeklieren structuur en cellulaire lokalisatie met behulp van ex-vivo confocale microscopie

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Cryogene monster laden in een magische hoek spinnen nucleaire magnetische resonantie spectrometer die cellulaire levensvatbaarheid behoudt

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Kwantificering van interbacteriële concurrentie met behulp van single-cell fluorescentiebeeldvorming

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...