Name: quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation
Uploaded: 2021-05-17T15:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Getulio Pereira pour son aide dans le travail sur les vésicules extracellulaires.
Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes de l’Institut national de la santé à iCG: RO1CA218500, UG3HL147353 et UG3TR002881.

Le protocole expérimental utilisé dans cette étude a été approuvé par le Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).
1. Configuration de l’instrument
REMARQUE: L’imagerie des cellules en lévitation nécessite que deux aimants en néodyme de terres rares magnétisés sur l’axe z soient placés avec le même pôle face à l’autre pour générer un champ magnétique. La distance entre les aimants peut être personnalisée en fonc...

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	<li>Tasoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levitational+Image+Cytometry+with+Temporal+Resolution.">Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution.</a> Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).</li><li>Durmus, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+levitation+of+single+cells.">Magnetic levitation of single cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (28), 3661-3668 (2015).</li><li>Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-Phone+Based+Magnetic+Levitation+for+Measuring+Densities.">Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities.</a> PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).</li><li>Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+Levitated+Plasma+Proteins.">Magnetically Levitated Plasma Proteins.</a> Analytical Chemistry. 92 (2), 1663-1668 (2020).</li><li>Yaman, S., Tekin, H. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Powders+Containing+Illicit+Drugs+Using+Magnetic+Levitation.">Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation.</a> Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).</li><li>Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+cell+density+alter+protein+markers+of+multiple+cellular+compartments,+confounding+experimental+outcomes.">Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes.</a> PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).</li><li>Hart, A., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+fluctuations+during+the+cell+cycle+of+Bacillus+subtilis.">Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis.</a> Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).</li><li>Poole, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+buoyant+density+during+the+cell+cycle+of+Escherichia+coli+K12:+significance+for+the+preparation+of+synchronous+cultures+by+age+selection.">Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection.</a> The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).</li><li>Cass, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density-dependent+fluctuations+in+membrane+permeability+in+logarithmically+growing+cell+cultures.">Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures.</a> Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).</li><li>Grover, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+density.">Measuring single-cell density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 10992-10996 (2011).</li><li>Bryan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single+cell+mass,+volume,+and+density+with+dual+suspended+microchannel+resonators.">Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators.</a> Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).</li><li>Gomer, R. 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E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+and+Regulation+of+Cell+Density.">Relevance and Regulation of Cell Density.</a> Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).</li><li>Maric, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+gradients+in+proliferation+and+differentiation+of+embryonic+rat+CNS+accessed+by+buoyant+density+fractionation:+alpha+3,+beta+3+and+gamma+2+GABAA+receptor+subunit+co-expression+by+post-mitotic+neocortical+neurons+correlates+directly+with+cell+buoyancy.">Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy.</a> European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).</li><li>Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+gradient+fractionation+and+flow+cytometric+analysis+of+embryonic+rat+cortical+neurons+and+progenitor+cells.">Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells.</a> Methods. 16 (3), 247-259 (1998).</li><li>Wolff, D. A., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+HeLa+cells+by+colloidal+silica+density+gradient+centrifugation.+I.+Separation+and+partial+synchrony+of+mitotic+cells.">Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells.</a> Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).</li><li>Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+replication,+cytopathology,+and+lysosomal+enzyme+response+of+mitotic+and+interphase+Hep-2+cells+infected+with+poliovirus.">Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus.</a> Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).</li><li>Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+variation+during+the+cell+cycle+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).</li><li>Yurinskaya, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymocyte+K+,+Na++and+water+balance+during+dexamethasone-+and+etoposide-induced+apoptosis.">Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).</li><li>Wyllie, A. H., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-induced+cell+death.+Purification+ad+properties+of+thymocytes+undergoing+apoptosis+after+glucocorticoid+treatment.">Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment.</a> American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).</li><li>Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-induced+cell+death.+2.+Surface+changes+in+thymocytes+undergoing+apoptosis.">Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis.</a> American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).</li><li>Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cell+volume+loss+in+CEM-C7A+cells+during+dexamethasone-induced+apoptosis.">Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis.</a> American Journal of Physiology. 270 (4), 1190-1203 (1996).</li><li>Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+density+and+volume+in+normal+subjects+and+in+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia.">Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 48 (3), 361-371 (1976).</li><li>Huber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+the+buoyant+density+distribution+of+normal+and+malignant+lymphocytes.">A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes.</a> British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).</li><li>Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunological+enrichment+method+for+epithelial+cells+from+peripheral+blood.">An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood.</a> Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).</li><li>Andersen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Implementation+of+Magnetic+Levitation+to+Quantify+Leukocyte+Size,+Morphology,+and+Magnetic+Properties+to+Identify+Patients+with+Sepsis.">A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis.</a> Shock. , (2018).</li><li>Felton, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+subtle+changes+in+red+blood+cell+density+using+a+cell+phone.">Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone.</a> Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).</li><li>Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+pinocytosis+in+lymphoid+cells+has+a+low+capacity.">Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity.</a> Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).</li></ol>

La centrifugation par gradient est actuellement la technique standard pour isoler les composants subcellulaires en fonction de leurs densités uniques. Cette approche nécessite toutefois l’utilisation de milieux de gradient spécialisés ainsi que d’équipements de centrifugeuse. L’approche de lévitation magnétique présentée ici permet une étude détaillée des propriétés morphologiques et fonctionnelles des cellules circulantes, avec un minimum, voire aucune manipulation des cellules, fournissant un accès...

La lévitation magnétique est une technique développée pour séparer, analyser et identifier les types de cellules1,2,3,protéines4,5 et opioïdes6 en fonction uniquement de leur densité spécifique et de leurs propriétés paramagnétiques. La densité cellulaire est une propriété intrinsèque unique de chaque type de cellule directement liée à son taux métabolique et à son statut de différenciation7,8,9,10,11,12,13,14. La quantification des changements subtils et transitoires de la densité cellulaire dans des conditions d’état d’équilibre et au cours de divers processus cellulaires pourrait permettre de mieux comprendre la physiologie et la physiopathologie cellulaires. Les changements de densité cellulaire sont associés à la différenciation cellulaire15,16, la progression du cycle cellulaire9,17,18,19, l’apoptose20,21,22,23, et la transformation maligne24,25,26 . Par conséquent, la quantification de changements spécifiques dans la densité cellulaire peut être utilisée pour différencier les cellules de différents types, ainsi que pour discriminer le même type de cellules subissant divers processus d’activation. Cela permet des expériences qui ciblent une sous-population cellulaire particulière, où les changements dynamiques de densité servent d’indicateur d’altération du métabolisme cellulaire27. Comme il a été établi qu’une cellule peut altérer sa densité en réponse à un environnement changeant7,il est impératif de mesurer la cinétique de la cellule par rapport à sa densité pour la comprendre pleinement, ce que les méthodes actuelles peuvent ne pas fournir12. La lévitation magnétique, quant à elle, permet une évaluation dynamique des cellules et de leurs propriétés28.
Les cellules sont diamagnétiques, ce qui signifie qu’elles n’ont pas de moment dipolaire magnétique permanent. Cependant, lorsqu’il est exposé à un champ magnétique externe, un faible moment dipolaire magnétique est généré dans les cellules, dans la direction opposée du champ appliqué. Ainsi, si les cellules sont suspendues dans une solution paramagnétique et exposées à un fort champ magnétique vertical, elles léviteront loin de la source magnétique et s’arrêteront à une hauteur, qui dépend principalement de leur densité individuelle. La lévitation diamagnétique d’un objet confiné au minimum d’un champ magnétique inhomogène est possible lorsque les deux critères suivants sont remplis : 1) la susceptibilité magnétique de la particule doit être inférieure à celle du milieu environnant, et 2) la force magnétique doit être suffisamment forte pour contrebalancer la force de flottabilité de la particule. Les deux critères peuvent être remplis en suspendant les globules bouclés dans un tampon magnétique et en créant de forts gradients de champ magnétique avec de petits aimants permanents peu coûteux et disponibles dans le commerce1. La position d’équilibre d’une particule piégée magnétiquement sur un axe le long de la direction de la gravité est déterminée par sa densité (par rapport à la densité du tampon), sa susceptibilité magnétique (par rapport à la susceptibilité magnétique du tampon) et la signature du champ magnétique appliqué. Comme la densité et les propriétés magnétiques de la solution sont constantes dans tout le système, les propriétés de densité intrinsèque des cellules seront le principal facteur déterminant la hauteur de lévitation des cellules, les cellules plus denses lévitant moins que les cellules moins denses. Cette approche utilise un ensemble de deux billes de référence de densité (1,05 et 1,2 g/mL) qui nous permettent d’utiliser une analyse ratiométrique précise pour les mesures de densité. La modification de la concentration de la solution magnétique permet d’isoler différentes populations cellulaires, telles que les globules rouges des globules blancs, car la densité des cellules circulantes est spécifique à la cellule, éliminant ainsi le besoin de protocoles d’isolement ou d’autres manipulations cellulaires.
La majorité des méthodes de détection utilisées dans la recherche en biologie reposent sur l’extrapolation d’événements de liaison spécifiques en signaux linéaires faciles à quantifier. Ces méthodes de lecture sont souvent complexes et impliquent un équipement spécialisé et un personnel scientifique dédié. Une approche visant à la détection d’antigènes présents soit sur la membrane plasmique de cellules ou de vésicules extracellulaires, soit solubles dans le plasma, à l’aide d’une ou deux billes recouvertes d’anticorps, est décrite ici. Les perles doivent être de densités différentes les unes des autres et de celles des cibles interrogées. La présence de l’antigène cible dans un biofluide donné se traduit par un changement spécifique et mesurable de la hauteur de lévitation d’une cellule antigène positif liée à une bille de détection. Dans le cas d’antigènes solubles ou de vésicules extracellulaires, ils sont liés à la fois aux perles de capture et de détection, formant un complexe perle-perle plutôt qu’un complexe perle-cellule. Le changement de hauteur de lévitation dépend de la nouvelle densité des complexes perles-cellules ou perles-perles. Outre la modification de la hauteur de lévitation des complexes, qui indique la présence d’antigène dans le biofluide, le nombre de complexes dépend également de la quantité de cible, ce qui fait de la lévitation magnétique également une approche quantitative pour la détection d’antigènes24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-2933</td>
			<td>(MES); component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197&#34;) thickness</td>
			<td>K&#38;J Magnetics</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Magnets used for the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Tube Sealant (Critoseal)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>267620</td>
			<td>Used to cap the ends of the capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS8163</td>
			<td>Used to wash beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Lab Jack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ750</td>
			<td>Used for adjusting the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Solution for bead suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9508-100ML</td>
			<td>Used during a wash step for beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37608</td>
			<td>Used to stain Rh+ cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol Injection</td>
			<td>ProHance</td>
			<td>NDC 0270-1111-03</td>
			<td>Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS++</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td>Solution for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C5b,6 complex</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A122</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C7 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A124</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C8 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A125</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C9 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A126</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Series Post Collar</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSR2</td>
			<td>Used to secure magnetic levitation device to lab jacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1769-10G</td>
			<td>(EDC); used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AB-105-C</td>
			<td>Used to coat beads as a control condition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BM-220</td>
			<td>Component of coupling buffer, used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td>Component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Carboxyl Polymer</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>PC06004</td>
			<td>Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit RhD Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-112694</td>
			<td>Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Grade Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Provis AX-70</td>
			<td>Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Dampening Feet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RDF1</td>
			<td>Used to support the breadboard table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Boro Tubing</td>
			<td>VitroTubes</td>
			<td>8100-050</td>
			<td>Capillary tube used for loading sample into Maglev</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>24510</td>
			<td>Used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translational Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT1</td>
			<td>Used for focusing and for scanning capillary tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation

La méthode décrite a été développée sur la base des principes de la lévitation magnétique, qui sépare les cellules et les particules en fonction de leur densité et de leurs propriétés magnétiques. La densité est une propriété d’identification de type cellulaire, directement liée à son taux métabolique, à sa différenciation et à son statut d’activation. La lévitation magnétique permet une approche en une étape pour séparer, imager et caractériser avec succès les cellules sanguines circulantes, et pour détecter l’anémie, la drépanocytose et les cellules tumorales circulantes en fonction de la densité et des propriétés magnétiques. Cette approche se prête également à la détection d’antigènes solubles présents dans une solution en utilisant des ensembles de billes de faible et haute densité recouvertes d’anticorps de capture et de détection, respectivement. Si l’antigène est présent en solution, il reliera les deux ensembles de perles, générant un nouveau complexe perle-perle, qui lévitera entre les rangées de perles recouvertes d’anticorps. Une concentration accrue de l’antigène cible en solution générera un plus grand nombre de complexes perles-billes par rapport à des concentrations plus faibles d’antigène, permettant ainsi des mesures quantitatives de l’antigène cible. La lévitation magnétique est avantageuse pour d’autres méthodes en raison de son temps de préparation des échantillons réduit et de son manque de dépendance aux méthodes de lecture classiques. L’image générée est facilement capturée et analysée à l’aide d’un microscope standard ou d’un appareil mobile, tel qu’un smartphone ou une tablette.

La lévitation magnétique concentre des objets de différentes densités à différentes hauteurs de lévitation en fonction de la densité de l’objet, de sa signature magnétique, de la concentration de solution paramagnétique et de la force du champ magnétique créé par deux aimants puissants de terres rares. Comme les deux aimants sont placés l’un sur l’autre, les échantillons en lévitation ne peuvent être vus, tout en maintenant l’éclairage de Köhler, qu’à l’aide d’un microscope tourné sur l...

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Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Cet article décrit une méthode basée sur la lévitation magnétique qui peut détecter spécifiquement la présence d’antigènes, solubles ou liés à la membrane, en quantifiant les changements dans la hauteur de lévitation des billes de capture avec des densités fixes.

Quantification des densités cellulaires et des propriétés antigéniques par lévitation magnétique

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Cette technique permet de séparer différents types de cellules et de cellules subissant divers processus basés uniquement sur la densité avec peu ou pas de manipulation dans un court laps de temps. Les principaux avantages de cette méthode sont qu’elle est peu invasive, nécessite de petits volumes, fournit des résultats rapides, ne dépend pas des lectures classiques et n’a pas besoin de personnel spécialisé. Cette technique peut être appliquée pour détecter plusieurs maladies, par exemple l’anémie et la septicémie.Pour commencer, utilisez l’autopiqueur en un clic pour piquer le doigt du donneur de sang positif au facteur rhésus et prélever 10 microlitres de sang dans un millilitre de DPBS. Ajouter un microlitre de colorant fluorescent dans une suspension millilitre des cellules positives du facteur rhésus pour colorer la membrane plasmique par fluorescence et incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Aézez les cellules en les faisant tourner à 5 600 fois G pendant 15 secondes et lavez la pastille trois fois à l’aide d’un millilitre de DPBS.Resuspendez la pastille dans un millilitre de HBSS avec du calcium et du magnésium. Utilisez l’autopiqueur en un clic pour piquer le doigt du donneur de sang à facteur rhésus négatif et prélever deux microlitres de sang. Pour préparer le tube expérimental contenant uniquement des billes, ajoutez 174 microlitres de HBSS avec du calcium et du magnésium, un microlitre de perles témoins d’IgG, un microlitre de perles lourdes d’une densité de 1,2 gramme par millilitre et 24 microlitres de gadolinium de 500 millimolaires.Pour préparer le tube témoin expérimental contenant des IgG, ajoutez 172 microlitres de HBSS avec du calcium et du magnésium, un microlitre de billes témoins d’IgG, un microlitre de perles lourdes, un microlitre de sang négatif au facteur rhésus, un microlitre de suspension sanguine positive au facteur rhésus coloré et 24 microlitres de gadolinium 500 millimolaires. Pour préparer le tube expérimental de l’échantillon, ajoutez 172 microlitres de HBSS avec du calcium et du magnésium, un microlitre de perles enduites d’anti-RhD, un microlitre de perles lourdes, un microlitre de sang négatif au facteur rhésus, un microlitre de suspension sanguine positive au facteur rhésus coloré et 24 microlitres de gadolinium 500 millimolaires. Configurez le dispositif de lévitation magnétique.Et chargez 50 microlitres de l’échantillon dans un tube capillaire jusqu’à ce que le tube soit rempli. Scellez les extrémités du tube capillaire avec un scellant capillaire en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles. Placez le tube capillaire dans le support capillaire entre les aimants supérieur et inférieur, ajustez la scène et la mise au point pour une visualisation optimale.Attendez environ cinq à 20 minutes que les cellules et les billes se déposent à leur position d’équilibre magnétique. En utilisant ce protocole, les cellules sanguines ont été séparées en fonction de la hauteur de lévitation à l’aide du dispositif de lévitation magnétique. Des perles de faible et haute densité ont été utilisées pour fournir des hauteurs de lévitation de densité et des références de taille.Les cellules polymorphonucléaires lévitaient au-dessus des globules rouges à une concentration d’ions gadolinium de 21 millimolaires. Les vieilles cellules sanguines lévitaient à une concentration d’ions gadolinium de 60 millimolaires. Les globules rouges, les cellules polymorphonucléaires et les lymphocytes ont été séparés à une concentration d’ions gadolinium de 40 millimolaires en fonction de leurs densités intrinsèques.L’antigène du facteur rhésus a été détecté sur les globules rouges à l’aide de billes recouvertes d’IgG et d’anticorps anti-RhD. Les complexes de globules rouges de billes n’ont pas été générés dans l’échantillon témoin d’IgG, mais les globules rouges colorés par fluorescence capturés par les perles positives du facteur rhésus ont été détectés. La liaison de l’anti-RhB aux cellules positives du facteur rhésus a créé un complexe de cellules perles au centre à la densité intermittente des perles non liées et des globules rouges négatifs.De plus, la formation complexe a été confirmée par l’observation de la fluorescence émise. Les complexes de billes B formés entre les perles de haute et de basse densité recouvertes d’anticorps contre CR1 et CD47 indiquent la présence de vésicules extracellulaires dérivées de globules rouges. Coiper le capillaire sans introduire de bulles est l’étape la plus difficile et nécessite de la pratique.Cette méthode pourrait fournir des informations pour l’hématologie, en particulier axée sur les maladies des globules rouges.

Research

JoVE Journal

Biology

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Isolement du labiles complexes multi-protéiques par des In vivo Contrôlée Cellulaire réticulation et chromatographie d&#39;affinité immuno-magnétiques

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Recherche

Biologie

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