Name: quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation
Uploaded: 2021-05-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation at JoVE.com

Die Autoren danken Dr. Getulio Pereira für seine Hilfe bei der extrazellulären Vesikelarbeit.
Diese Arbeit wurde durch die folgenden Zuschüsse des National Institute of Health an ICG unterstützt: RO1CA218500, UG3HL147353 und UG3TR002881.

Das in dieser Studie verwendete experimentelle Protokoll wurde vom Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB) genehmigt.
1. Geräteeinrichtung
HINWEIS: Für die Abbildung schwebender Zellen müssen zwei seltenere Neodym-Magnete, die auf der z-Achse magnetisiert sind, mit demselben Pol zueinander platziert werden, um ein Magnetfeld zu erzeugen. Der Abstand zwischen den Magneten kann in Abhängigkeit von der Intensität des Magnetfeldes und de...

<ol>
	<li>Tasoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levitational+Image+Cytometry+with+Temporal+Resolution.">Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution.</a> Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).</li><li>Durmus, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+levitation+of+single+cells.">Magnetic levitation of single cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (28), 3661-3668 (2015).</li><li>Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-Phone+Based+Magnetic+Levitation+for+Measuring+Densities.">Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities.</a> PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).</li><li>Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+Levitated+Plasma+Proteins.">Magnetically Levitated Plasma Proteins.</a> Analytical Chemistry. 92 (2), 1663-1668 (2020).</li><li>Yaman, S., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Susceptibility-Based+Protein+Detection+Using+Magnetic+Levitation.">Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation.</a> Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).</li><li>Abrahamsson, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Powders+Containing+Illicit+Drugs+Using+Magnetic+Levitation.">Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation.</a> Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).</li><li>Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+cell+density+alter+protein+markers+of+multiple+cellular+compartments,+confounding+experimental+outcomes.">Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes.</a> PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).</li><li>Hart, A., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+fluctuations+during+the+cell+cycle+of+Bacillus+subtilis.">Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis.</a> Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).</li><li>Poole, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+buoyant+density+during+the+cell+cycle+of+Escherichia+coli+K12:+significance+for+the+preparation+of+synchronous+cultures+by+age+selection.">Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection.</a> The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).</li><li>Cass, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density-dependent+fluctuations+in+membrane+permeability+in+logarithmically+growing+cell+cultures.">Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures.</a> Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).</li><li>Grover, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+density.">Measuring single-cell density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 10992-10996 (2011).</li><li>Bryan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single+cell+mass,+volume,+and+density+with+dual+suspended+microchannel+resonators.">Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators.</a> Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).</li><li>Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+sensing+and+size+determination.">Cell density sensing and size determination.</a> Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).</li><li>Neurohr, G. E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+and+Regulation+of+Cell+Density.">Relevance and Regulation of Cell Density.</a> Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).</li><li>Maric, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+gradients+in+proliferation+and+differentiation+of+embryonic+rat+CNS+accessed+by+buoyant+density+fractionation:+alpha+3,+beta+3+and+gamma+2+GABAA+receptor+subunit+co-expression+by+post-mitotic+neocortical+neurons+correlates+directly+with+cell+buoyancy.">Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy.</a> European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).</li><li>Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+gradient+fractionation+and+flow+cytometric+analysis+of+embryonic+rat+cortical+neurons+and+progenitor+cells.">Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells.</a> Methods. 16 (3), 247-259 (1998).</li><li>Wolff, D. A., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+HeLa+cells+by+colloidal+silica+density+gradient+centrifugation.+I.+Separation+and+partial+synchrony+of+mitotic+cells.">Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells.</a> Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).</li><li>Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+replication,+cytopathology,+and+lysosomal+enzyme+response+of+mitotic+and+interphase+Hep-2+cells+infected+with+poliovirus.">Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus.</a> Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).</li><li>Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+variation+during+the+cell+cycle+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).</li><li>Yurinskaya, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymocyte+K+,+Na++and+water+balance+during+dexamethasone-+and+etoposide-induced+apoptosis.">Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).</li><li>Wyllie, A. H., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-induced+cell+death.+Purification+ad+properties+of+thymocytes+undergoing+apoptosis+after+glucocorticoid+treatment.">Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment.</a> American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).</li><li>Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-induced+cell+death.+2.+Surface+changes+in+thymocytes+undergoing+apoptosis.">Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis.</a> American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).</li><li>Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cell+volume+loss+in+CEM-C7A+cells+during+dexamethasone-induced+apoptosis.">Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis.</a> American Journal of Physiology. 270 (4), 1190-1203 (1996).</li><li>Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+density+and+volume+in+normal+subjects+and+in+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia.">Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 48 (3), 361-371 (1976).</li><li>Huber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+the+buoyant+density+distribution+of+normal+and+malignant+lymphocytes.">A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes.</a> British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).</li><li>Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunological+enrichment+method+for+epithelial+cells+from+peripheral+blood.">An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood.</a> Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).</li><li>Andersen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Implementation+of+Magnetic+Levitation+to+Quantify+Leukocyte+Size,+Morphology,+and+Magnetic+Properties+to+Identify+Patients+with+Sepsis.">A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis.</a> Shock. , (2018).</li><li>Felton, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+subtle+changes+in+red+blood+cell+density+using+a+cell+phone.">Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone.</a> Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).</li><li>Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+pinocytosis+in+lymphoid+cells+has+a+low+capacity.">Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity.</a> Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).</li></ol>

Die Gradientenzentrifugation ist derzeit die Standardtechnik zur Isolierung subzellulärer Komponenten aufgrund ihrer einzigartigen Dichten. Dieser Ansatz erfordert jedoch den Einsatz spezialisierter Gradientenmedien sowie Zentrifugenanlagen. Der hier vorgestellte Magnetschwebeansatz ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der morphologischen und funktionellen Eigenschaften zirkulierender Zellen mit minimaler, wenn überhaupt, Manipulation der Zellen, was einen nahezu in vivo-Zugang zu zirkulierenden Zellen e...

Die Magnetschwebebahn ist eine Technik, die entwickelt wurde, um die Zelltypen1,2,3,Proteine4,5 und Opioide6 ausschließlich auf der Grundlage ihrer spezifischen Dichte und paramagnetischen Eigenschaften zu trennen, zu analysieren und zu identifizieren. Die Zelldichte ist eine einzigartige, intrinsische Eigenschaft jedes Zelltyps, die in direktem Zusammenhang mit seiner Stoffwechselrate und seinem Differenzierungsstatus steht7,8,9,10,11,12,13,14. Die Quantifizierung subtiler und vorübergehender Veränderungen der Zelldichte unter stationären Bedingungen und während einer Vielzahl von Zellprozessen könnte einen unübertroffenen Einblick in die Zellphysiologie und Pathophysiologie ermöglichen. Veränderungen der Zelldichte sind mit der Zelldifferenzierung15,16, der Zellzyklusprogression9,17,18,19, apoptose20,21,22,23und der malignen Transformation24,25,26 verbunden . Daher kann die Quantifizierung spezifischer Änderungen der Zelldichte verwendet werden, um zwischen Zellen verschiedener Typen zu unterscheiden und zwischen demselben Zelltyp zu unterscheiden, der verschiedenen Aktivierungsprozessen unterzogen wird. Dies ermöglicht Experimente, die auf eine bestimmte Zellteilpopulation abzielen, wobei dynamische Dichteänderungen als Indikator für einen veränderten Zellstoffwechsel dienen27. Da festgestellt wurde, dass eine Zelle ihre Dichte als Reaktion auf eine sich ändernde Umgebung ändern kann7, ist es unerlässlich, die Kinetik der Zelle in Bezug auf ihre Dichte zu messen, um sie vollständig zu verstehen, was aktuelle Methoden möglicherweise nicht liefern12. Die Magnetschwebebahn hingegen ermöglicht eine dynamische Bewertung von Zellen und ihren Eigenschaften28.
Zellen sind diamagnetisch, was bedeutet, dass sie kein permanentes magnetisches Dipolmoment haben. Wenn es jedoch einem externen Magnetfeld ausgesetzt wird, wird in den Zellen ein schwaches magnetisches Dipolmoment in der entgegengesetzten Richtung des angelegten Feldes erzeugt. Wenn Zellen also in einer paramagnetischen Lösung suspendiert und einem starken vertikalen Magnetfeld ausgesetzt werden, schweben sie von der Magnetquelle weg und stoppen bis zu einer Höhe, die in erster Linie von ihrer individuellen Dichte abhängt. Die diamagnetische Levitation eines Objekts, das auf das Minimum eines inhomogenen Magnetfeldes beschränkt ist, ist möglich, wenn die beiden folgenden Kriterien erfüllt sind: 1) Die magnetische Anfälligkeit des Partikels muss kleiner sein als die des umgebenden Mediums und 2) die Magnetkraft muss stark genug sein, um die Auftriebskraft des Partikels auszugleichen. Beide Kriterien können erfüllt werden, indem Erythrozyten in einem magnetischen Puffer aufgehängt und starke Magnetfeldgradienten mit kleinen, kostengünstigen, handelsüblichen Permanentmagneten erzeugt werden1. Die Gleichgewichtsposition eines magnetisch gefangenen Teilchens auf einer Achse entlang der Gravitationsrichtung wird durch seine Dichte (relativ zur Dichte des Puffers), seine magnetische Anfälligkeit (relativ zur magnetischen Empfindlichkeit des Puffers) und die Signatur des angelegten Magnetfeldes bestimmt. Da die Dichte und die magnetischen Eigenschaften der Lösung im gesamten System konstant sind, sind die intrinsischen Dichteeigenschaften der Zellen der Hauptfaktor, der die Levitationshöhe der Zellen bestimmt, wobei dichtere Zellen im Vergleich zu weniger dichten Zellen niedriger schweben. Dieser Ansatz verwendet einen Satz von zwei Dichtereferenzperlen (1,05 und 1,2 g/ ml), die es uns ermöglichen, eine präzise, ratiometrische Analyse für Dichtemessungen zu verwenden. Die Änderung der Konzentration der magnetischen Lösung ermöglicht es, verschiedene Zelluläre Populationen wie Erythrozyten von WBCs zu isolieren, da die Dichte der zirkulierenden Zellen zellspezifisch ist, wodurch isolationsprotokolle oder andere Zellmanipulationen entfallen.
Die Mehrzahl der in der biologischen Forschung verwendeten Nachweismethoden beruht auf der Extrapolation spezifischer Bindungsereignisse in leicht zu quantifizierende lineare Signale. Diese Auslesemethoden sind oft komplex und erfordern spezielle Geräte und engagiertes wissenschaftliches Personal. Ein Ansatz, der auf den Nachweis von Antigenen abzielt, die entweder auf der Plasmamembran von Zellen oder extrazellulären Vesikeln gefunden werden oder die im Plasma löslich sind, wobei entweder eine oder zwei Antikörperbeschichtete Kügelchen verwendet werden, wird hierin beschrieben. Die Perlen müssen von unterschiedlicher Dichte sein als die voneinander und von denen der befragten Ziele. Das Vorhandensein des Zielantigens in einem bestimmten Biofluid wird in eine spezifische, messbare Änderung der Levitationshöhe einer Antigen-positiven Zelle übersetzt, die an eine Nachweisperle gebunden ist. Im Falle von löslichen Antigenen oder extrazellulären Vesikeln sind sie sowohl an Einfang- als auch an Nachweisperlen gebunden und bilden eher einen Perlen-Perlen-Komplex als einen Perlen-Zell-Komplex. Die Änderung der Levitationshöhe hängt von der neuen Dichte der Perlenzell- oder Perlen-Perlen-Komplexe ab. Neben der Änderung der Levitationshöhe der Komplexe, die auf das Vorhandensein von Antigen im Biofluid hinweist, hängt die Anzahl der Komplexe auch von der Menge des Ziels ab, was die Magnetschwebebahn auch zu einem quantitativen Ansatz für den Antigennachweis macht24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-2933</td>
			<td>(MES); component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197&#34;) thickness</td>
			<td>K&#38;J Magnetics</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Magnets used for the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Tube Sealant (Critoseal)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>267620</td>
			<td>Used to cap the ends of the capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS8163</td>
			<td>Used to wash beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Lab Jack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ750</td>
			<td>Used for adjusting the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Solution for bead suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9508-100ML</td>
			<td>Used during a wash step for beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37608</td>
			<td>Used to stain Rh+ cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol Injection</td>
			<td>ProHance</td>
			<td>NDC 0270-1111-03</td>
			<td>Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS++</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td>Solution for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C5b,6 complex</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A122</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C7 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A124</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C8 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A125</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C9 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A126</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Series Post Collar</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSR2</td>
			<td>Used to secure magnetic levitation device to lab jacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1769-10G</td>
			<td>(EDC); used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AB-105-C</td>
			<td>Used to coat beads as a control condition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BM-220</td>
			<td>Component of coupling buffer, used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td>Component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Carboxyl Polymer</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>PC06004</td>
			<td>Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit RhD Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-112694</td>
			<td>Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Grade Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Provis AX-70</td>
			<td>Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Dampening Feet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RDF1</td>
			<td>Used to support the breadboard table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Boro Tubing</td>
			<td>VitroTubes</td>
			<td>8100-050</td>
			<td>Capillary tube used for loading sample into Maglev</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>24510</td>
			<td>Used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translational Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT1</td>
			<td>Used for focusing and for scanning capillary tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation

Die beschriebene Methode wurde basierend auf den Prinzipien der Magnetschwebebahn entwickelt, die Zellen und Partikel anhand ihrer Dichte und magnetischen Eigenschaften trennt. Dichte ist eine Zelltyp-identifizierende Eigenschaft, die in direktem Zusammenhang mit seiner Stoffwechselrate, Differenzierung und seinem Aktivierungsstatus steht. Die Magnetschwebebahn ermöglicht einen einstufigen Ansatz zur erfolgreichen Trennung, Abbildung und Charakterisierung zirkulierender Blutzellen sowie zur Erkennung von Anämie, Sichelzellenanämie und zirkulierenden Tumorzellen basierend auf Dichte und magnetischen Eigenschaften. Dieser Ansatz ist auch für den Nachweis löslicher Antigene in einer Lösung geeignet, indem Sätze von Perlen niedriger und hoher Dichte verwendet werden, die mit Einfang- bzw. Nachweisantikörpern beschichtet sind. Wenn das Antigen in Lösung vorhanden ist, überbrückt es die beiden Sätze von Perlen und erzeugt einen neuen Perlen-Perlen-Komplex, der zwischen den Reihen der antikörperbeschichteten Perlen schwebt. Eine erhöhte Konzentration des Zielantigens in Lösung erzeugt im Vergleich zu niedrigeren Antigenkonzentrationen eine größere Anzahl von Perlen-Perlen-Komplexen, wodurch quantitative Messungen des Zielantigens ermöglicht werden. Die Magnetschwebebahn ist für andere Methoden aufgrund ihrer verkürzten Probenvorbereitungszeit und der fehlenden Abhängigkeit von klassischen Auslesemethoden vorteilhaft. Das erzeugte Bild kann einfach mit einem Standardmikroskop oder einem mobilen Gerät wie einem Smartphone oder einem Tablet erfasst und analysiert werden.

Die Magnetschwebebahn fokussiert Objekte unterschiedlicher Dichte bei unterschiedlichen Levitationshöhen, abhängig von der Dichte des Objekts, seiner magnetischen Signatur, der Konzentration der paramagnetischen Lösung und der Stärke des Magnetfeldes, das von zwei starken Seltenerdmagneten erzeugt wird. Da die beiden Magnete übereinander angeordnet sind, können schwebende Proben unter Beibehaltung der Köhler-Beleuchtung nur mit einem zur Seite gedrehten Mikroskop betrachtet werden (Abbildung 1...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation at JoVE.com

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Diese Arbeit beschreibt eine auf Magnetschwebenutzung basierende Methode, die spezifisch das Vorhandensein von Antigenen, entweder löslich oder membrangebunden, nachweisen kann, indem Änderungen der Levitationshöhe von Auffangperlen mit festen Dichten quantifiziert werden.

Quantifizierung zellulärer Dichten und antigener Eigenschaften mittels Magnetschwebebahn

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Diese Technik ermöglicht die Trennung verschiedener Zelltypen und Zellen, die verschiedene Prozesse durchlaufen, die ausschließlich auf der Dichte basieren, mit wenig bis gar keiner Manipulation in kurzer Zeit. Die Hauptvorteile dieser Methode sind, dass sie minimalinvasiv ist, kleine Volumina erfordert, schnelle Ergebnisse liefert, nicht von klassischen Auslesungen abhängt und kein Fachpersonal erforderlich ist. Diese Technik kann zur Erkennung mehrerer Krankheiten, zum Beispiel Anämie und Sepsis, angewendet werden.Um zu beginnen, verwenden Sie das Ein-Klick-Stechgerät, um den Finger des Rhesusfaktor-positiven Blutspenders zu stechen, und sammeln Sie 10 Mikroliter Blut in einem Milliliter DPBS. Fügen Sie einen Mikroliter Fluoreszenzfarbstoff in einer Milliliter-Suspension der Rhesusfaktor-positiven Zellen hinzu, um die Plasmamembran fluoreszierend zu färben und bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten zu inkubieren. Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie sich 15 Sekunden lang mit 5,600 mal G drehen und waschen Sie das Pellet dreimal mit einem Milliliter DPBS.Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter HBSS mit Calcium und Magnesium. Verwenden Sie das Ein-Klick-Stechhilfegerät, um den Finger des Rhesusfaktor-negativen Blutspenders zu stechen und zwei Mikroliter Blut zu sammeln. Zur Herstellung des Versuchsröhrchens, das nur Perlen enthält, werden 174 Mikroliter HBSS mit Calcium und Magnesium, ein Mikroliter IgG-Kontrollperlen, ein Mikroliter schwere Perlen mit einer Dichte von 1,2 Gramm pro Milliliter und 24 Mikroliter 500 Millimolar Gadolinium zugegeben.Zur Herstellung des experimentellen Kontrollröhrchens, das IgG enthält, werden 172 Mikroliter HBSS mit Calcium und Magnesium, ein Mikroliter IgG-Kontrollperlen, ein Mikroliter schwere Perlen, ein Mikroliter Rhesusfaktor-negatives Blut, ein Mikroliter gefärbte Rhesusfaktor-positive Blutsuspension und 24 Mikroliter 500 Millimolar Gadolinium zugegeben. Zur Vorbereitung des Probenversuchsröhrchens werden 172 Mikroliter HBSS mit Calcium und Magnesium, ein Mikroliter Anti-RhD-beschichtete Kügelchen, ein Mikroliter schwere Perlen, ein Mikroliter Rhesusfaktor-negatives Blut, ein Mikroliter gefärbte Rhesusfaktor-positive Blutsuspension und 24 Mikroliter 500 Millimolar Gadolinium zugegeben. Richten Sie die Magnetschwebevorrichtung ein.Und laden Sie 50 Mikroliter der Probe in ein Kapillarrohr, bis das Röhrchen gefüllt ist. Versiegeln Sie die Enden des Kapillarrohrs mit einer Kapillarversiegelung, um sicherzustellen, dass keine Blasen vorhanden sind. Legen Sie das Kapillarrohr in den Kapillarhalter zwischen den oberen und unteren Magneten, stellen Sie die Bühne und den Fokus für eine optimale Betrachtung ein.Warten Sie etwa fünf bis 20 Minuten, bis sich die Zellen und Kügelchen an ihrer magnetischen Gleichgewichtsposition niedergelassen haben. Mit diesem Protokoll wurden die Blutzellen in Abhängigkeit von der Levitationshöhe mit hilfe der Magnetschwebevorrichtung getrennt. Perlen mit niedriger und hoher Dichte wurden verwendet, um Dichteschwebehöhen und Größenreferenzen bereitzustellen.Die polymorphkernigen Zellen schwebten über den roten Blutkörperchen bei einer Gadolinium-Ionenkonzentration von 21 Millimolaren. Alte Blutzellen schwebten bei einer Gadolinium-Ionenkonzentration von 60 Millimolaren. Die roten Blutkörperchen, polymorphkernigen Zellen und Lymphozyten wurden bei einer Gadolinium-Ionenkonzentration von 40 Millimol basierend auf ihren intrinsischen Dichten getrennt.Das Rhesusfaktor-Antigen wurde auf den roten Blutkörperchen mit IgG und Anti-RhD-Antikörper-beschichteten Kügelchen nachgewiesen. Die Perlenkomplexe der roten Blutkörperchen wurden nicht in der IgG-Kontrollprobe erzeugt, aber die fluoreszierend gefärbten roten Blutkörperchen, die von den Rhesusfaktor-positiven Kügelchen eingefangen wurden, wurden nachgewiesen. Die Bindung des Anti-RhB an die Rhesusfaktor-positiven Zellen erzeugte einen Kügelchenzellkomplex im Zentrum bei intermittierender Dichte der ungebundenen Kügelchen und der negativen roten Blutkörperchen.Weiterhin wurde die komplexe Bildung durch Beobachtung der emittierten Fluoreszenz bestätigt. Die B-Perlenkomplexe, die zwischen den mit den Antikörpern für CR1 und CD47 beschichteten Perlen mit hoher und niedriger Dichte gebildet werden, weisen auf das Vorhandensein von extrazellulären Vesikeln aus roten Blutkörperchen hin. Die Kapillare zu verschließen, ohne Blasen einzuführen, ist der schwierigste Schritt und erfordert Übung.Diese Methode könnte Einblicke in die Hämatologie liefern, insbesondere für Erkrankungen der roten Blutkörperchen.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Forschung

Biologie

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Quantifizierung Mixing mit Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

AFM-basierte Mapping der elastischen Eigenschaften der Zellwände: auf der Tissue-, Handy-und subzellulärer Beschlüsse

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Cellular Redox Profiling mit hochauflösender Mikroskopie

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Fisch Sperma Bewertung mit Software und Kühlgeräte

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Visualisierung der Lymphknotenstruktur und Zelllokalisierung mittels Ex-Vivo Konfokalmikroskopie

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Kryogene Probenladung in ein magisches Winkel-Spinning-Kernspinresonanzspektrometer, das die Zelllebensfähigkeit bewahrt

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Quantifizierung der interbakteriellen Konkurrenz mittels Einzelzell-Fluoreszenzbildgebung

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...