Name: quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation
Uploaded: 2021-05-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לד"ר גטוליו פריירה על עזרתו בעבודה צעיפית חוץ-תאית.
עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים של המכון הלאומי לבריאות ל- ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 ו- UG3TR002881.

הפרוטוקול הניסיוני המשמש במחקר זה אושר על ידי הוועדה לבדיקה מוסדית של המרכז הרפואי בית ישראל דיקונס (IRB).
1. התקנת מכשיר
הערה: הדמיה של תאים מרחפים דורשת שני מגנטים נדירים של ניאודימיום אדמה הממוגנטים על ציר z כדי להיות ממוקמים עם אותו מוט אחד מול השני כדי ליצור ש...

<ol>
	<li>Tasoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levitational+Image+Cytometry+with+Temporal+Resolution.">Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution.</a> Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).</li><li>Durmus, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+levitation+of+single+cells.">Magnetic levitation of single cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (28), 3661-3668 (2015).</li><li>Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-Phone+Based+Magnetic+Levitation+for+Measuring+Densities.">Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities.</a> PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).</li><li>Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+Levitated+Plasma+Proteins.">Magnetically Levitated Plasma Proteins.</a> Analytical Chemistry. 92 (2), 1663-1668 (2020).</li><li>Yaman, S., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Susceptibility-Based+Protein+Detection+Using+Magnetic+Levitation.">Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation.</a> Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).</li><li>Abrahamsson, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Powders+Containing+Illicit+Drugs+Using+Magnetic+Levitation.">Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation.</a> Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).</li><li>Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+cell+density+alter+protein+markers+of+multiple+cellular+compartments,+confounding+experimental+outcomes.">Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes.</a> PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).</li><li>Hart, A., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+fluctuations+during+the+cell+cycle+of+Bacillus+subtilis.">Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis.</a> Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).</li><li>Poole, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+buoyant+density+during+the+cell+cycle+of+Escherichia+coli+K12:+significance+for+the+preparation+of+synchronous+cultures+by+age+selection.">Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection.</a> The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).</li><li>Cass, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density-dependent+fluctuations+in+membrane+permeability+in+logarithmically+growing+cell+cultures.">Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures.</a> Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).</li><li>Grover, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+density.">Measuring single-cell density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 10992-10996 (2011).</li><li>Bryan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single+cell+mass,+volume,+and+density+with+dual+suspended+microchannel+resonators.">Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators.</a> Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).</li><li>Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+sensing+and+size+determination.">Cell density sensing and size determination.</a> Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).</li><li>Neurohr, G. E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+and+Regulation+of+Cell+Density.">Relevance and Regulation of Cell Density.</a> Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).</li><li>Maric, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+gradients+in+proliferation+and+differentiation+of+embryonic+rat+CNS+accessed+by+buoyant+density+fractionation:+alpha+3,+beta+3+and+gamma+2+GABAA+receptor+subunit+co-expression+by+post-mitotic+neocortical+neurons+correlates+directly+with+cell+buoyancy.">Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy.</a> European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).</li><li>Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+gradient+fractionation+and+flow+cytometric+analysis+of+embryonic+rat+cortical+neurons+and+progenitor+cells.">Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells.</a> Methods. 16 (3), 247-259 (1998).</li><li>Wolff, D. A., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+HeLa+cells+by+colloidal+silica+density+gradient+centrifugation.+I.+Separation+and+partial+synchrony+of+mitotic+cells.">Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells.</a> Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).</li><li>Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+replication,+cytopathology,+and+lysosomal+enzyme+response+of+mitotic+and+interphase+Hep-2+cells+infected+with+poliovirus.">Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus.</a> Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).</li><li>Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+variation+during+the+cell+cycle+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).</li><li>Yurinskaya, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymocyte+K+,+Na++and+water+balance+during+dexamethasone-+and+etoposide-induced+apoptosis.">Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).</li><li>Wyllie, A. H., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-induced+cell+death.+Purification+ad+properties+of+thymocytes+undergoing+apoptosis+after+glucocorticoid+treatment.">Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment.</a> American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).</li><li>Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-induced+cell+death.+2.+Surface+changes+in+thymocytes+undergoing+apoptosis.">Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis.</a> American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).</li><li>Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cell+volume+loss+in+CEM-C7A+cells+during+dexamethasone-induced+apoptosis.">Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis.</a> American Journal of Physiology. 270 (4), 1190-1203 (1996).</li><li>Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+density+and+volume+in+normal+subjects+and+in+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia.">Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 48 (3), 361-371 (1976).</li><li>Huber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+the+buoyant+density+distribution+of+normal+and+malignant+lymphocytes.">A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes.</a> British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).</li><li>Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunological+enrichment+method+for+epithelial+cells+from+peripheral+blood.">An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood.</a> Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).</li><li>Andersen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Implementation+of+Magnetic+Levitation+to+Quantify+Leukocyte+Size,+Morphology,+and+Magnetic+Properties+to+Identify+Patients+with+Sepsis.">A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis.</a> Shock. , (2018).</li><li>Felton, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+subtle+changes+in+red+blood+cell+density+using+a+cell+phone.">Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone.</a> Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).</li><li>Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+pinocytosis+in+lymphoid+cells+has+a+low+capacity.">Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity.</a> Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).</li></ol>

צנטריפוגה הדרגתית היא כיום הטכניקה הסטנדרטית לבידוד רכיבים תת-תאיים בהתבסס על הצפיפות הייחודית שלהם. גישה זו, לעומת זאת, דורשת שימוש במדיה הדרגתית מיוחדת, כמו גם ציוד צנטריפוגות. גישת הריחוף המגנטי המוצגת כאן מאפשרת חקירה מפורטת של התכונות המורפולוגיות והתפקודיות של תאים במחזור, עם מינימ...

ריחוף מגנטי הוא טכניקה שפותחה כדי להפריד, לנתח ולזהות סוגי תאים1,2,3, חלבונים4,5 ואופיואידים6 המבוססים אך ורק על הצפיפות הספציפית שלהם ואת המאפיינים paramagnetic. צפיפות תאים היא מאפיין ייחודי ומהותי של כל סוג תא הקשור ישירות לקצב חילוף החומרים שלו ומצב הבידולשלו 7,8,9,10,11,12,13,14. כימות שינויים עדינים וחולפים בצפיפות התאים בתנאי מצב קבועים, ובמגוון תהליכי תאים, יכול להרשות לעצמו תובנה שאין שני לה על פיזיולוגיה של תאים ופתופיזיולוגיה. שינויים בצפיפות התא קשורים לבידול תאים15,16, התקדמות מחזור התא9,17,18,19, אפופטוזיס20,21,22,23, ושינוי ממאיר24,25,26 . לכן, כימות של שינויים ספציפיים בצפיפות התא, יכול לשמש כדי להבדיל בין תאים מסוגים שונים, כמו גם להפלות בין אותו סוג של תאים העוברים תהליכי הפעלה שונים. זה מאפשר ניסויים המתמקדים תת-אוכלוסיית תאים מסוימת, שבו שינויים דינמיים בצפיפות משמש אינדיקטור של חילוף החומרים התא שונה27. כפי שנקבע כי תא עשוי לשנות את צפיפותו בתגובה לסביבה משתנה7, זה הכרחי למדוד את הקינטיקה של התא ביחס לצפיפותו כדי להבין אותו באופן מלא, אשר השיטות הנוכחיות לא יכול לספק12. ריחוף מגנטי לעומת זאת, מאפשר הערכה דינמית של תאים ומאפייניםשלהם 28.
תאים הם דיאמגנטיים כלומר אין להם רגע דיפול מגנטי קבוע. עם זאת, כאשר נחשפים לשדה מגנטי חיצוני, נוצר רגע דיפול מגנטי חלש בתאים, בכיוון ההפוך של השדה המיושם. לכן, אם תאים מושעים בתמיסה פרמגנטית ונחשפים לשדה מגנטי אנכי חזק, הם ירחפו הרחק מהמקור המגנטי ויעצרו לגובה, אשר תלוי בעיקר בצפיפות האישית שלהם. ריחוף דימגנטי של עצם המרותק למינימום של שדה מגנטי אינומוגני אפשרי כאשר שני הקריטריונים הבאים מתקיימים: 1) הרגישות המגנטית של החלקיק חייבת להיות קטנה מזו של המדיום שמסביב, ו -2) הכוח המגנטי חייב להיות חזק מספיק כדי לאזן את כוח הציפה של החלקיק. שני הקריטריונים יכולים להתממש על ידי השעיית RBCs במאגר מגנטי ועל ידי יצירת שיפועי שדה מגנטי חזקים עם מגנטים קבועים קטנים, זולים וזמינים מסחרית1. מיקום שיווי המשקל של חלקיק לכוד מגנטית על ציר לאורך כיוון הכבידה נקבע על ידי צפיפותו (ביחס לצפיפות המאגר), הרגישות המגנטית שלו (ביחס לרגישות המגנטית של המאגר) וחתימת השדה המגנטי המיושם. מכיוון שהצפיפות והמאפיינים המגנטיים של הפתרון קבועים בכל המערכת, תכונות הצפיפות המהותיות של התאים יהיו הגורם העיקרי הקובע את גובה הריחוף של התאים, כאשר תאים צפופים יותר מרחפים נמוך יותר בהשוואה לתאים צפופים פחות. גישה זו משתמשת בערכה של שני חרוזי התייחסות בצפיפות (1.05 ו- 1.2 גרם/מ"ל) המאפשרים לנו להשתמש בניתוח מדויק ויחסי למדידות צפיפות. שינוי הריכוז של הפתרון המגנטי מאפשר לבודד אוכלוסיות תאיות שונות, כגון RBCs מ- WBCs, שכן צפיפות התאים במחזור היא ספציפית לתא, הסרת הצורך בפרוטוקולי בידוד או מניפולציה אחרת של תאים.
רוב שיטות הזיהוי המשמשות במחקר ביולוגי מסתמכות על אקסטרפולציה של אירועים מחייבים ספציפיים לאותות ליניאריים קלים לכימות. שיטות קריאה אלה הן לעתים קרובות מורכבות וכוללות ציוד מיוחד ואנשי צוות מדעיים ייעודיים. גישה שמטרתה זיהוי של אנטיגנים שנמצאו על קרום הפלזמה של תאים או שלל חוץ תאי או כי הם מסיסים בפלזמה, באמצעות אחד או שניים חרוזים מצופים נוגדן, מתואר בזאת. החרוזים חייבים להיות בצפיפות שונה זה מזה וממטרות שנחקרו. נוכחותו של אנטיגן היעד בכל ביופלואיד נתון מתורגמת לשינוי ספציפי, מדיד בגובה הריחוף של תא אנטיגן חיובי כי הוא קשור חרוז זיהוי. במקרה של אנטיגנים מסיסים או שלל חוץ-תאי, הם קשורים הן לחרוזים ללכוד ולזיהוי, ויוצרות קומפלקס חרוזים ולא קומפלקס של תאי חרוזים. השינוי בגובה הריחוף תלוי בצפיפות החדשה של מתחמי חרוזים או חרוזים. בנוסף לשינוי בגובה הריחוף של המתחמים, המציין את נוכחות האנטיגן בביופלואיד, מספר המתחמים תלוי גם בכמות היעד, מה שהופך את הריחוף המגנטי גם לגישה כמותית לזיהוי אנטיגן24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-2933</td>
			<td>(MES); component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197&#34;) thickness</td>
			<td>K&#38;J Magnetics</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Magnets used for the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Tube Sealant (Critoseal)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>267620</td>
			<td>Used to cap the ends of the capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS8163</td>
			<td>Used to wash beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Lab Jack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ750</td>
			<td>Used for adjusting the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Solution for bead suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9508-100ML</td>
			<td>Used during a wash step for beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37608</td>
			<td>Used to stain Rh+ cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol Injection</td>
			<td>ProHance</td>
			<td>NDC 0270-1111-03</td>
			<td>Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS++</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td>Solution for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C5b,6 complex</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A122</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C7 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A124</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C8 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A125</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C9 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A126</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Series Post Collar</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSR2</td>
			<td>Used to secure magnetic levitation device to lab jacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1769-10G</td>
			<td>(EDC); used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AB-105-C</td>
			<td>Used to coat beads as a control condition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BM-220</td>
			<td>Component of coupling buffer, used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td>Component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Carboxyl Polymer</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>PC06004</td>
			<td>Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit RhD Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-112694</td>
			<td>Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Grade Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Provis AX-70</td>
			<td>Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Dampening Feet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RDF1</td>
			<td>Used to support the breadboard table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Boro Tubing</td>
			<td>VitroTubes</td>
			<td>8100-050</td>
			<td>Capillary tube used for loading sample into Maglev</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>24510</td>
			<td>Used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translational Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT1</td>
			<td>Used for focusing and for scanning capillary tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation

השיטה המתוארת פותחה על בסיס עקרונות הריחוף המגנטי, המפריד בין תאים וחלקיקים על סמך צפיפותם ומאפייניהם המגנטיים. Density הוא מאפיין מזהה סוג תא, הקשור ישירות לקצב חילוף החומרים שלו, לבידול ולמצב ההפעלה שלו. ריחוף מגנטי מאפשר גישה חד-שלבית כדי להפריד, לדם ולאפיין בהצלחה תאי דם במחזור, ולזהות אנמיה, מחלת חרמשית ותאי גידול במחזור המבוססים על צפיפות ומאפיינים מגנטיים. גישה זו מקובלת גם על זיהוי אנטיגנים מסיסים הנמצאים בפתרון באמצעות סטים של חרוזים בצפיפות נמוכה וגבוהה מצופים בנוגדנים ללכידה וזיהוי, בהתאמה. אם האנטיגן נמצא בתמיסה, הוא יגשר בין שני סטים של חרוזים, יצירת קומפלקס חרוזים חדש, אשר מרחף בין השורות של חרוזים מצופים נוגדנים. ריכוז מוגבר של האנטיגן היעד בפתרון יפיק מספר גדול יותר של מתחמי חרוזים בהשוואה לריכוזים נמוכים יותר של אנטיגן, ובכך יאפשר מדידות כמותיות של אנטיגן היעד. ריחוף מגנטי הוא יתרון לשיטות אחרות בשל זמן הכנת המדגם הירידה שלה וחוסר תלות בשיטות קריאה קלאסיות. התמונה שנוצרת נלכדת ומנותחת בקלות באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי או מכשיר נייד, כגון טלפון חכם או טאבלט.

ריחוף מגנטי ממקד עצמים בצפיפות שונה בגבהי ריחוף שונים בהתאם לצפיפות האובייקט, החתימה המגנטית שלו, ריכוז התמיסה הפרמגנטית וכוח השדה המגנטי שנוצר על ידי שני מגנטים חזקים ונדירים של כדור הארץ. כששני המגנטים מונחים זה על גבי זה, ניתן לצפות רק בדגימות מרחפות, תוך שמירה על תאורת קולר, באמצעות מי?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation at JoVE.com

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

מאמר זה מתאר שיטה מבוססת ריחוף מגנטית שיכולה לזהות באופן ספציפי נוכחות של אנטיגנים, מסיסים או קשורים לממברנה, על ידי כימות שינויים בגובה הריחוף של חרוזי לכידה עם צפיפות קבועה.

כימות של צפיפות תאית ומאפיינים אנטיגניים באמצעות ריחוף מגנטי

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

טכניקה זו מאפשרת הפרדה של סוגי תאים ותאים שונים העוברים תהליכים שונים המבוססים אך ורק על צפיפות עם מעט מאוד מניפולציה בפרק זמן קצר. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם כי זה פולשני מינימלית, דורש נפחים קטנים, מספק תוצאות מהירות, אינו תלוי קריאות קלאסיות, וכוח אדם מיוחד אינו נדרש. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לאיתור מחלות מרובות, למשל אנמיה ואלח דם.כדי להתחיל להשתמש במכשיר פנס בלחיצה אחת כדי לדקור את האצבע של תורם דם חיובי גורם רזוס, ולאסוף 10 microliters של דם במיליליטר אחד של DPBS. הוסף מיקרוליטר אחד של צבע פלואורסצנטי בהשעיה מיליליטר אחת של רזוס גורם תאים חיוביים כדי להכתים פלואורסצנטית את קרום הפלזמה ודגורה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. גלולה את התאים על ידי ספינינג ב 5, 600 פעמים G במשך 15 שניות לשטוף את הכדור שלוש פעמים באמצעות מיליליטר אחד של DPBS.resuspend הכדור במיליליטר אחד של HBSS עם סידן ומגנזיום. השתמש בהתקן lancing בלחיצה אחת כדי לדקור את האצבע של תורם דם שלילי גורם רזוס ולאסוף שני microliters של דם. כדי להכין את הצינור הניסיוני המכיל רק חרוזים, להוסיף 174 microliters של HBSS עם סידן ומגנזיום, microliter אחד של חרוזי בקרה IgG, microliter אחד של חרוזים כבדים עם 1.2 גרם לצפיפות מיליליטר, ו 24 microliters של 500 מילימטר gadolinium.כדי להכין את צינור הבקרה הניסיוני המכיל IgG, להוסיף 172 microliters של HBSS עם סידן ומגנזיום, microliter אחד של חרוזי בקרה IgG, microliter אחד של חרוזים כבדים, microliter אחד של דם שלילי גורם רזוס, microliter אחד של השעיית דם חיובית גורם רזוס מוכתם, ו 24 microliters של 500 מילימולר גדליניום. כדי להכין את הצינור הניסיוני מדגם, להוסיף 172 microliters של HBSS עם סידן ומגנזיום, microliter אחד של חרוזים מצופים אנטי RhD, microliter אחד של חרוזים כבדים, microliter אחד של רזוס גורם דם שלילי, microliter אחד של השעיית דם חיובית גורם רזוס מוכתם, ו 24 microliters של 500 מילימיליניום מילימולר. תגדיר את מכשיר הריחוף המגנטי.ותטענו 50 מיקרוליטרים של הדגימה לתוך צינור נימי עד שהצינור יתמלא. לאטום את הקצוות של צינור נימי עם איטום נימי להבטיח כי אין בועות. מניחים את צינור נימי במחזיק הנימי בין המגנטים העליונים לתחתונים, מתאימים את הבמה ומתמקדים לצפייה אופטימלית.המתן כחמש עד 20 דקות עד התאים והחרוזים להתיישב בעמדת שיווי המשקל המגנטי שלהם. באמצעות פרוטוקול זה, תאי הדם הופרדו בהתאם לגובה הריחוף באמצעות מכשיר הריחוף המגנטי. חרוזי צפיפות נמוכה וגבוהה שימשו כדי לספק גבהים ריחוף צפיפות והפניות גודל.תאי הפולימורפונוקליר ריחפו מעל תאי הדם האדומים בריכוז יון דוליניום 21 מ"מ. תאי דם ישנים ריחפו בריכוז יון גדליניום 60 מילימולר. תאי הדם האדומים, תאי הפולימורפונוקליר והלימפוציטים הופרדו בריכוז יון גדליניום 40 מילימולארי בהתבסס על הצפיפות המהותית שלהם.אנטיגן גורם רזוס זוהה על תאי הדם האדומים באמצעות חרוזים מצופים נוגדן IgG ו- Anti-RhD. מתחמי התא האדום חרוזים לא נוצרו בדגימת בקרת IgG, אבל תאי הדם האדומים מוכתמים פלואורסצנטית שנתפסו על ידי גורם רזוס חרוזים חיוביים זוהו. הכריכה של האנטי-RHB לתאים החיוביים של גורם הרזוס יצרה קומפלקס תאי חרוזים במרכז בצפיפות לסירוגין של החרוזים הלא מאוגדים ותאי הדם האדומים השליליים.יתר על כן, המבנה המורכב אושר על ידי התבוננות פלואורסצנטיות הנפלטת. מתחמי חרוז B שנוצרו בין חרוזים בצפיפות גבוהה ונמוכה מצופים בנוגדנים עבור CR1 ו- CD47 מצביעים על נוכחות של תאי דם אדומים שמקורם שלפוחיות חוץ תאיות. כיסוי נימי מבלי להציג בועות הוא הצעד המאתגר ביותר ודורש תרגול.שיטה זו יכולה לספק תובנה להמטולוגיה, המתמקדת במיוחד במחלות תאי דם אדומים.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

כימות ערבוב באמצעות תהודה מגנטית

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

מיפוי מבוסס AFM של תכונות אלסטיות של קירות תא: ברקמות, נייד, והחלטות subcellular

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

התאוששות נייד באמצעות פרופילים תוכן גבוהה מיקרוסקופית

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

הערכת זרע דגים באמצעות תוכנה, התקני קירור

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

חזותי מבנה צומת לימפה ולוקליזציה לסלולר באמצעות Ex-Vivo Confocal מיקרוסקופ

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

דגימה קריוגנית נטענת לתוך זווית קסם ספינינג ספקטרומטר תהודה מגנטית גרעינית המשמרת את הכדאיות התאית

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

כימות של תחרות בין-בקטריאלית באמצעות הדמיית פלואורסצנטיות חד-תאית

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...