Name: quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation
Uploaded: 2021-05-17T15:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Getulio Pereira per il suo aiuto con il lavoro sulle vescicole extracellulari.
Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni del National Institute of Health all'ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 e UG3TR002881.

Il protocollo sperimentale utilizzato in questo studio è stato approvato dal Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).
1. Configurazione dello strumento
NOTA: l'imaging delle cellule levitanti richiede che due magneti al neodimio delle terre rare magnetizzati sull'asse z siano posizionati con lo stesso polo uno di fronte all'altro per generare un campo magnetico. La distanza tra i magneti può essere personalizzata in base all'intensità ...

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-induced+cell+death.+2.+Surface+changes+in+thymocytes+undergoing+apoptosis.">Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis.</a> American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).</li><li>Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cell+volume+loss+in+CEM-C7A+cells+during+dexamethasone-induced+apoptosis.">Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis.</a> American Journal of Physiology. 270 (4), 1190-1203 (1996).</li><li>Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+subtle+changes+in+red+blood+cell+density+using+a+cell+phone.">Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone.</a> Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).</li><li>Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+pinocytosis+in+lymphoid+cells+has+a+low+capacity.">Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity.</a> Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).</li></ol>

La centrifugazione a gradiente è attualmente la tecnica standard per isolare i componenti subcellulari in base alle loro densità uniche. Questo approccio, tuttavia, richiede l'uso di mezzi gradienti specializzati e apparecchiature centrifughe. L'approccio a levitazione magnetica qui presentato consente un'indagine dettagliata delle proprietà morfologiche e funzionali delle cellule circolanti, con una manipolazione minima, se non nulla, delle cellule, fornendo un accesso quasi in vivo alle cellule circolanti.<...

La levitazione magnetica è una tecnica sviluppata per separare, analizzare e identificare i tipi di cellule1,2,3,le proteine4,5 e gli oppioidi6 basandosi esclusivamente sulla loro densità specifica e proprietà paramagnetiche. La densità cellulare è una proprietà intrinseca unica di ciascun tipo di cellula direttamente correlata al suo tasso metabolico e allo stato di differenziazione7,8,9,10,11, 12,13,14. Quantificare i cambiamenti sottili e transitori nella densità cellulare durante le condizioni di stato stazionario e durante una varietà di processi cellulari, potrebbe offrire una visione senza pari della fisiologia cellulare e della fisiopatologia. I cambiamenti nella densità cellulare sono associatialla differenziazione cellulare15,16,alla progressione del ciclo cellulare9,17,18,19,all'apoptosi20,21,22,23e alla trasformazione maligna24,25,26 . Pertanto, la quantificazione di specifici cambiamenti nella densità cellulare, può essere utilizzata per differenziare tra cellule di diversi tipi, nonché discriminare tra lo stesso tipo di cellule sottoposte a vari processi di attivazione. Ciò consente esperimenti che prendono di mira una particolare sotto-popolazione cellulare, in cui i cambiamenti dinamici nella densità fungono da indicatore del metabolismo cellulare alterato27. Poiché è stato stabilito che una cellula può alterare la sua densità in risposta a un ambiente mutevole7, è imperativo misurare la cinetica della cellula in relazione alla sua densità per comprenderla pienamente, che i metodi attuali potrebbero non fornire12. La levitazione magnetica, d'altra parte, consente una valutazione dinamica delle cellule e delle loro proprietà28.
Le cellule sono diamagnetiche, il che significa che non hanno un momento di dipolo magnetico permanente. Tuttavia, quando esposto a un campo magnetico esterno, viene generato un debole momento di dipolo magnetico nelle cellule, nella direzione opposta del campo applicato. Pertanto, se le cellule sono sospese in una soluzione paramagnetica ed esposte a un forte campo magnetico verticale, levitano lontano dalla sorgente magnetica e si fermano ad un'altezza, che dipende principalmente dalla loro densità individuale. La levitazione diamagnetica di un oggetto confinato al minimo di un campo magnetico disomogeneo è possibile quando sono soddisfatti i due seguenti criteri: 1) la suscettibilità magnetica della particella deve essere inferiore a quella del mezzo circostante e 2) la forza magnetica deve essere abbastanza forte da controbilanciare la forza di galleggiamento della particella. Entrambi i criteri possono essere soddisfatti sospendendo i globuli rossi in un buffer magnetico e creando forti gradienti di campo magnetico con magneti permanenti piccoli, economici e disponibili in commercio1. La posizione di equilibrio di una particella intrappolata magneticamente su un asse lungo la direzione di gravità è determinata dalla sua densità (relativa alla densità del buffer), dalla sua suscettibilità magnetica (relativa alla suscettibilità magnetica del buffer) e dalla firma del campo magnetico applicato. Poiché la densità e le proprietà magnetiche della soluzione sono costanti in tutto il sistema, le proprietà di densità intrinseca delle cellule saranno il fattore principale che determina l'altezza di levitazione delle cellule, con cellule più dense che levitano più in basso rispetto alle cellule meno dense. Questo approccio utilizza una serie di due perle di riferimento di densità (1,05 e 1,2 g/ml) che ci consentono di utilizzare un'analisi puntuale precisa e rapportometrica per le misurazioni della densità. L'alterazione della concentrazione della soluzione magnetica consente di isolare diverse popolazioni cellulari, come i globuli rossi dai globuli bianchi, poiché la densità delle cellule circolanti è specifica della cellula, eliminando la necessità di protocolli di isolamento o altre manipolazioni cellulari.
La maggior parte dei metodi di rilevamento utilizzati nella ricerca in biologia si basano sull'estrapolazione di specifici eventi di legame in segnali lineari facili da quantificare. Questi metodi di lettura sono spesso complessi e coinvolgono attrezzature specializzate e personale scientifico dedicato. Un approccio volto alla rilevazione di antigeni trovati sulla membrana plasmatica delle cellule o delle vescicole extracellulari o che sono solubili nel plasma, utilizzando uno o due perle rivestite di anticorpi, è qui descritto. Le peri devono essere di densità diverse l'una dall'altra e da quelle dei bersagli interrogati. La presenza dell'antigene bersaglio in un dato biofluido si traduce in un cambiamento specifico e misurabile nell'altezza di levitazione di una cellula antigene-positiva che è legata a un perla di rilevamento. Nel caso di antigeni solubili o vescicole extracellulari, sono legati sia alle perle di cattura che a quelle di rilevamento, formando un complesso perle-perle piuttosto che un complesso perle-cellula. La variazione dell'altezza di levitazione dipende dalla nuova densità dei complessi perle-cella o perla-perla. Oltre alla variazione dell'altezza di levitazione dei complessi, che indica la presenza di antigene nel biofluido, il numero di complessi dipende anche dalla quantità di bersaglio, rendendo la levitazione magnetica anche un approccio quantitativo per il rilevamento dell'antigene24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-2933</td>
			<td>(MES); component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197&#34;) thickness</td>
			<td>K&#38;J Magnetics</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Magnets used for the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Tube Sealant (Critoseal)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>267620</td>
			<td>Used to cap the ends of the capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS8163</td>
			<td>Used to wash beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Lab Jack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ750</td>
			<td>Used for adjusting the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Solution for bead suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9508-100ML</td>
			<td>Used during a wash step for beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37608</td>
			<td>Used to stain Rh+ cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol Injection</td>
			<td>ProHance</td>
			<td>NDC 0270-1111-03</td>
			<td>Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS++</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td>Solution for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C5b,6 complex</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A122</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C7 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A124</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C8 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A125</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C9 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A126</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Series Post Collar</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSR2</td>
			<td>Used to secure magnetic levitation device to lab jacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1769-10G</td>
			<td>(EDC); used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AB-105-C</td>
			<td>Used to coat beads as a control condition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BM-220</td>
			<td>Component of coupling buffer, used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td>Component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Carboxyl Polymer</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>PC06004</td>
			<td>Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit RhD Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-112694</td>
			<td>Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Grade Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Provis AX-70</td>
			<td>Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Dampening Feet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RDF1</td>
			<td>Used to support the breadboard table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Boro Tubing</td>
			<td>VitroTubes</td>
			<td>8100-050</td>
			<td>Capillary tube used for loading sample into Maglev</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>24510</td>
			<td>Used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translational Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT1</td>
			<td>Used for focusing and for scanning capillary tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation

Il metodo descritto è stato sviluppato sulla base dei principi della levitazione magnetica, che separa cellule e particelle in base alla loro densità e proprietà magnetiche. La densità è una proprietà identificativa del tipo cellulare, direttamente correlata al suo tasso metabolico, differenziazione e stato di attivazione. La levitazione magnetica consente un approccio in un unico passaggio per separare, visualizzare e caratterizzare con successo le cellule del sangue circolanti e rilevare anemia, anemia falciforme e cellule tumorali circolanti in base alla densità e alle proprietà magnetiche. Questo approccio è anche suscettibile di rilevare antigeni solubili presenti in una soluzione utilizzando set di perline a bassa e alta densità rivestite rispettivamente con anticorpi di cattura e rilevamento. Se l'antigene è presente in soluzione, colmerà le due serie di pere, generando un nuovo complesso perla-perla, che levita tra le file di pere rivestite di anticorpi. L'aumento della concentrazione dell'antigene bersaglio in soluzione genererà un numero maggiore di complessi pere-pere rispetto a concentrazioni inferiori di antigene, consentendo così misurazioni quantitative dell'antigene bersaglio. La levitazione magnetica è vantaggiosa per altri metodi a causa della diminuzione del tempo di preparazione del campione e della mancanza di dipendenza dai metodi di lettura classici. L'immagine generata viene facilmente catturata e analizzata utilizzando un microscopio standard o un dispositivo mobile, come uno smartphone o un tablet.

La levitazione magnetica focalizza oggetti di densità diverse a diverse altezze di levitazione a seconda della densità dell'oggetto, della sua firma magnetica, della concentrazione di soluzione paramagnetica e della forza del campo magnetico creato da due forti magneti in terre rare. Poiché i due magneti sono posizionati uno sopra l'altro, i campioni levitanti possono essere visualizzati solo, pur mantenendo l'illuminazione di Köhler, utilizzando un microscopio girato su un lato (Figura 1</strong...

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Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Questo documento descrive un metodo basato sulla levitazione magnetica in grado di rilevare specificamente la presenza di antigeni, solubili o legati alla membrana, quantificando i cambiamenti nell'altezza di levitazione delle perle di cattura con densità fisse.

Quantificazione delle densità cellulari e delle proprietà antigeniche mediante levitazione magnetica

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Questa tecnica consente la separazione di vari tipi di cellule e cellule sottoposte a vari processi basati esclusivamente sulla densità con poca o nessuna manipolazione in un breve periodo di tempo. I principali vantaggi di questo metodo sono che è minimamente invasivo, richiede piccoli volumi, fornisce risultati rapidi, non dipende dalle classiche lettura e non è richiesto personale specializzato. Questa tecnica può essere applicata per rilevare più malattie, ad esempio anemia e sepsi.Per iniziare utilizzare il dispositivo di lancing con un clic per pungere il dito del donatore di sangue positivo al fattore rhesus e raccogliere 10 microlitri di sangue in un millilitro di DPBS. Aggiungere un microlitro di colorante fluorescente in una sospensione millilitro delle cellule positive al fattore rhesus per colorare fluorescentemente la membrana plasmatica e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Pellet le celle ruotando a 5.600 volte G per 15 secondi e lavare il pellet tre volte usando un millilitro di DPBS.Spese di sospensione del pellet in un millilitro di HBSS con calcio e magnesio. Utilizzare il dispositivo di lancing con un clic per pungere il dito del donatore di sangue negativo al fattore rhesus e raccogliere due microlitri di sangue. Per preparare il tubo sperimentale contenente solo perdole, aggiungere 174 microlitri di HBSS con calcio e magnesio, un microlitro di perli di controllo IgG, un microlitro di pere pesanti con una densità di 1,2 grammi per millilitro e 24 microlitri di gadolinio da 500 millimolari.Per preparare il tubo di controllo sperimentale contenente IgG, aggiungere 172 microlitri di HBSS con calcio e magnesio, un microlitro di perli di controllo IgG, un microlitro di pere pesanti, un microlitro di sangue negativo a fattore rhesus, un microlitro di sospensione di sangue positiva al fattore rhesus colorato e 24 microlitri di gadolinio millimolare da 500 millimolari. Per preparare il tubo sperimentale del campione, aggiungere 172 microlitri di HBSS con calcio e magnesio, un microlitro di pere rivestite di anti-RhD, un microlitro di pere pesanti, un microlitro di sangue negativo al fattore rhesus, un microlitro di sospensione di sangue positivo al fattore rhesus colorato e 24 microlitri di gadolinio millimolare da 500 millimolari. Impostare il dispositivo di levitazione magnetica.E caricare 50 microlitri del campione in un tubo capillare fino a quando il tubo non viene riempito. Sigillare le estremità del tubo capillare con un sigillante capillare assicurandosi che non ci siano bolle. Posizionare il tubo capillare nel supporto capillare tra i magneti superiore e inferiore, regolare il palco e la messa a fuoco per una visione ottimale.Attendere circa cinque o 20 minuti affinché le cellule e le perle si depositino nella loro posizione di equilibrio magnetico. Utilizzando questo protocollo, le cellule del sangue sono state separate a seconda dell'altezza di levitazione utilizzando il dispositivo di levitazione magnetica. Sono state utilizzate perle a bassa e alta densità per fornire altezze di levitazione della densità e riferimenti dimensionali.Le cellule polimorfonucleate levitavano sopra i globuli rossi a 21 millimolari di concentrazione di ioni gadolinio. Le vecchie cellule del sangue levitavano a 60 millimolari di concentrazione di ioni gadolinio. I globuli rossi, le cellule polimorfonucleate e i linfociti sono stati separati a 40 millimolari di concentrazione di ioni gadolinio in base alle loro densità intrinseche.L'antigene del fattore rhesus è stato rilevato sui globuli rossi utilizzando pere rivestite di anticorpi IgG e anti-RhD. I complessi di globuli rossi di perla non sono stati generati nel campione di controllo IgG, ma sono stati rilevati i globuli rossi colorati fluorescente catturati dalle pere positive al fattore rhesus. Il legame dell'anti-RhB alle cellule positive del fattore rhesus ha creato un complesso di cellule di perla al centro a densità intermittente delle pere non legate e dei globuli rossi negativi.Inoltre, la complessa formazione è stata confermata osservando la fluorescenza emessa. I complessi di perle B formati tra le perle ad alta e bassa densità rivestite con gli anticorpi per CR1 e CD47 indicano la presenza di vescicole extracellulari derivate dai globuli rossi. Tappare il capillare senza introdurre bolle è il passo più impegnativo e richiede pratica.Questo metodo potrebbe fornire informazioni per l'ematologia, in particolare focalizzato sulle malattie dei globuli rossi.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Ricerca

Biologia

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Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione

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