Name: quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation
Uploaded: 2021-05-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation at JoVE.com

Forfatterne vil takke Dr. Getulio Pereira for hans hjelp med ekstracellulært vesicle-arbeid.
Dette arbeidet ble støttet av følgende National Institute of Health-tilskudd til ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 og UG3TR002881.

Den eksperimentelle protokollen som ble brukt i denne studien ble godkjent av Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).
1. Instrumentoppsett
MERK: Avbildning av leviterende celler krever to sjeldne jordnydymiummagneter magnetisert på z-aksen for å plasseres med samme pol vendt mot hverandre for å generere et magnetfelt. Avstanden mellom magnetene kan tilpasses avhengig av intensiteten til magnetfeltet og tettheten av målene. I dette ti...

<ol>
	<li>Tasoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levitational+Image+Cytometry+with+Temporal+Resolution.">Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution.</a> Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).</li><li>Durmus, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+levitation+of+single+cells.">Magnetic levitation of single cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (28), 3661-3668 (2015).</li><li>Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-Phone+Based+Magnetic+Levitation+for+Measuring+Densities.">Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities.</a> PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).</li><li>Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+Levitated+Plasma+Proteins.">Magnetically Levitated Plasma Proteins.</a> Analytical Chemistry. 92 (2), 1663-1668 (2020).</li><li>Yaman, S., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Susceptibility-Based+Protein+Detection+Using+Magnetic+Levitation.">Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation.</a> Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).</li><li>Abrahamsson, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Powders+Containing+Illicit+Drugs+Using+Magnetic+Levitation.">Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation.</a> Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).</li><li>Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+cell+density+alter+protein+markers+of+multiple+cellular+compartments,+confounding+experimental+outcomes.">Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes.</a> PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).</li><li>Hart, A., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+fluctuations+during+the+cell+cycle+of+Bacillus+subtilis.">Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis.</a> Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).</li><li>Poole, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+buoyant+density+during+the+cell+cycle+of+Escherichia+coli+K12:+significance+for+the+preparation+of+synchronous+cultures+by+age+selection.">Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection.</a> The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).</li><li>Cass, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density-dependent+fluctuations+in+membrane+permeability+in+logarithmically+growing+cell+cultures.">Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures.</a> Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).</li><li>Grover, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+density.">Measuring single-cell density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 10992-10996 (2011).</li><li>Bryan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single+cell+mass,+volume,+and+density+with+dual+suspended+microchannel+resonators.">Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators.</a> Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).</li><li>Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+sensing+and+size+determination.">Cell density sensing and size determination.</a> Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).</li><li>Neurohr, G. E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+and+Regulation+of+Cell+Density.">Relevance and Regulation of Cell Density.</a> Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).</li><li>Maric, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+gradients+in+proliferation+and+differentiation+of+embryonic+rat+CNS+accessed+by+buoyant+density+fractionation:+alpha+3,+beta+3+and+gamma+2+GABAA+receptor+subunit+co-expression+by+post-mitotic+neocortical+neurons+correlates+directly+with+cell+buoyancy.">Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy.</a> European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).</li><li>Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+gradient+fractionation+and+flow+cytometric+analysis+of+embryonic+rat+cortical+neurons+and+progenitor+cells.">Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells.</a> Methods. 16 (3), 247-259 (1998).</li><li>Wolff, D. A., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+HeLa+cells+by+colloidal+silica+density+gradient+centrifugation.+I.+Separation+and+partial+synchrony+of+mitotic+cells.">Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells.</a> Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).</li><li>Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+replication,+cytopathology,+and+lysosomal+enzyme+response+of+mitotic+and+interphase+Hep-2+cells+infected+with+poliovirus.">Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus.</a> Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).</li><li>Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+variation+during+the+cell+cycle+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).</li><li>Yurinskaya, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymocyte+K+,+Na++and+water+balance+during+dexamethasone-+and+etoposide-induced+apoptosis.">Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).</li><li>Wyllie, A. H., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-induced+cell+death.+Purification+ad+properties+of+thymocytes+undergoing+apoptosis+after+glucocorticoid+treatment.">Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment.</a> American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).</li><li>Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-induced+cell+death.+2.+Surface+changes+in+thymocytes+undergoing+apoptosis.">Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis.</a> American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).</li><li>Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cell+volume+loss+in+CEM-C7A+cells+during+dexamethasone-induced+apoptosis.">Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis.</a> American Journal of Physiology. 270 (4), 1190-1203 (1996).</li><li>Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+density+and+volume+in+normal+subjects+and+in+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia.">Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 48 (3), 361-371 (1976).</li><li>Huber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+the+buoyant+density+distribution+of+normal+and+malignant+lymphocytes.">A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes.</a> British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).</li><li>Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunological+enrichment+method+for+epithelial+cells+from+peripheral+blood.">An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood.</a> Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).</li><li>Andersen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Implementation+of+Magnetic+Levitation+to+Quantify+Leukocyte+Size,+Morphology,+and+Magnetic+Properties+to+Identify+Patients+with+Sepsis.">A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis.</a> Shock. , (2018).</li><li>Felton, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+subtle+changes+in+red+blood+cell+density+using+a+cell+phone.">Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone.</a> Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).</li><li>Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+pinocytosis+in+lymphoid+cells+has+a+low+capacity.">Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity.</a> Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).</li></ol>

Gradient sentrifugering er for tiden standardteknikken for å isolere subcellulære komponenter basert på deres unike tettheter. Denne tilnærmingen krever imidlertid bruk av spesialiserte gradientmedier samt sentrifugeringsutstyr. Den magnetiske levitasjonsmetoden som presenteres her, tillater detaljert undersøkelse av de morfologiske og funksjonelle egenskapene til sirkulerende celler, med minimum, om noen manipulering av cellene, noe som gir en nær in vivo-tilgang til sirkulerende celler.
<p class="jov...

Magnetisk levitasjon er en teknikk utviklet for å skille, analysere og identifisere celletyper1,2,3, proteiner4,5 og opioider6 basert utelukkende på deres spesifikke tetthet og paramagnetiske egenskaper. Celletetthet er en unik, innebygd egenskap for hver celletype som er direkte relatert til dens metabolske hastighet og differensieringsstatus7,8,9,10,11,12,13,14. Kvantifisering av subtile og forbigående endringer i celletetthet under stabile tilstandsforhold, og under en rekke celleprosesser, kunne man ha råd til en uovertruffen innsikt i cellefysiologi og patofysiologi. Endringer i celletetthet er knyttet til celledifferensiering15,16, cellesyklusprogresjon9,17,18,19, apoptose20,21,22,23og ondartet transformasjon24,25,26 . Derfor kan kvantifisering av spesifikke endringer i celletetthet brukes til å skille mellom celler av forskjellige typer, samt diskriminere mellom samme type celler som gjennomgår ulike aktiveringsprosesser. Dette muliggjør eksperimenter som retter seg mot en bestemt celleunderpopulasjon, der dynamiske endringer i tetthet fungerer som en indikator på endret cellemetabolisme27. Som det har blitt fastslått at en celle kan endre tettheten som svar på et miljø i endring7, er det viktig å måle cellens kinetikk i forhold til dens tetthet for å forstå den fullt ut, hvilke nåværende metoder som kanskje ikke gir12. Magnetisk levitasjon derimot, gir mulighet for en dynamisk evaluering av celler og deres egenskaper28.
Celler er diamagnetiske, noe som betyr at de ikke har et permanent magnetisk dipolmoment. Men når det blir utsatt for et eksternt magnetfelt, genereres et svakt magnetisk dipolmoment i cellene, i motsatt retning av det påførte feltet. Således, hvis celler er suspendert i en paramagnetisk løsning og utsatt for et sterkt vertikalt magnetfelt, vil de levitere bort fra magnetkilden og stoppe til en høyde, som hovedsakelig avhenger av deres individuelle tetthet. Diamagnetisk levitasjon av et objekt begrenset til minimum et inhomogent magnetfelt er mulig når de to følgende kriteriene er oppfylt: 1) Partikkelens magnetiske følsomhet må være mindre enn det omkringliggende mediet, og 2) den magnetiske kraften må være sterk nok til å motvirke partikkelens oppdriftskraft. Begge kriteriene kan oppfylles ved å suspendere RBCer i en magnetisk buffer og ved å skape sterke magnetfeltgradienter med små, billige, kommersielt tilgjengelige permanente magneter1. Likevektsposisjonen til en magnetisk fanget partikkel på en akse langs tyngdekraften bestemmes av dens tetthet (i forhold til bufferens tetthet), dens magnetiske følsomhet (i forhold til bufferens magnetiske følsomhet), og signaturen til det påførte magnetfeltet. Ettersom tettheten og de magnetiske egenskapene til løsningen er konstante i hele systemet, vil cellenes indre tetthetsegenskaper være den viktigste faktoren som bestemmer cellenes levitasjonshøyde, med tettere celler som levitterer lavere sammenlignet med mindre tette celler. Denne tilnærmingen bruker et sett med to tetthetsreferanseperler (1,05 og 1,2 g/ ml) som lar oss bruke presis, forholdsmetrisk analyse for tetthetsmålinger. Endring av konsentrasjonen av den magnetiske løsningen gjør det mulig å isolere forskjellige cellulære populasjoner, for eksempel RBCer fra WBCer, da tettheten av sirkulerende celler er cellespesifikk, og fjerner behovet for isolasjonsprotokoller eller annen cellemanipulering.
De fleste deteksjonsmetoder som brukes i biologiforskning er avhengige av ekstrapolering av spesifikke bindende hendelser til enkle å kvantifisere lineære signaler. Disse avlesningsmetodene er ofte komplekse og involverer spesialisert utstyr og dedikert vitenskapelig personell. En tilnærming rettet mot påvisning av antigener som finnes enten på plasmamembranen av celler eller ekstracellulære vesikler eller som er løselige i plasma, ved hjelp av enten en eller to antistoffbelagte perler, er heri beskrevet. Perlene må være av forskjellige tettheter fra hverandre og fra de av de forhørte målene. Tilstedeværelsen av målantigenet i en gitt biofluid er oversatt til en bestemt, målbar endring i levitasjonshøyden til en antigenpositiv celle som er bundet til en deteksjonsperle. Når det gjelder løselige antigener eller ekstracellulære vesicles, er de bundet til både fangst- og deteksjonsperler, og danner et perle-perlekompleks i stedet for perlecellekompleks. Endringen i levitasjonshøyde avhenger av den nye tettheten av perlecelle- eller perle-perlekompleksene. I tillegg til endringen i levitasjonshøyden til kompleksene, noe som indikerer tilstedeværelsen av antigen i biofluidet, er antall komplekser også avhengig av mengden mål, noe som gjør magnetisk levitasjon også en kvantitativ tilnærming for antigendeteksjon24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-2933</td>
			<td>(MES); component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197&#34;) thickness</td>
			<td>K&#38;J Magnetics</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Magnets used for the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Tube Sealant (Critoseal)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>267620</td>
			<td>Used to cap the ends of the capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS8163</td>
			<td>Used to wash beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Lab Jack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ750</td>
			<td>Used for adjusting the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Solution for bead suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9508-100ML</td>
			<td>Used during a wash step for beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37608</td>
			<td>Used to stain Rh+ cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol Injection</td>
			<td>ProHance</td>
			<td>NDC 0270-1111-03</td>
			<td>Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS++</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td>Solution for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C5b,6 complex</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A122</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C7 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A124</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C8 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A125</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C9 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A126</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Series Post Collar</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSR2</td>
			<td>Used to secure magnetic levitation device to lab jacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1769-10G</td>
			<td>(EDC); used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AB-105-C</td>
			<td>Used to coat beads as a control condition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BM-220</td>
			<td>Component of coupling buffer, used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td>Component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Carboxyl Polymer</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>PC06004</td>
			<td>Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit RhD Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-112694</td>
			<td>Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Grade Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Provis AX-70</td>
			<td>Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Dampening Feet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RDF1</td>
			<td>Used to support the breadboard table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Boro Tubing</td>
			<td>VitroTubes</td>
			<td>8100-050</td>
			<td>Capillary tube used for loading sample into Maglev</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>24510</td>
			<td>Used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translational Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT1</td>
			<td>Used for focusing and for scanning capillary tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation

Den beskrevne metoden ble utviklet basert på prinsippene for magnetisk levitasjon, som skiller celler og partikler basert på deres tetthet og magnetiske egenskaper. Tetthet er en celletype som identifiserer egenskap, direkte relatert til metabolsk hastighet, differensiering og aktiveringsstatus. Magnetisk levitasjon tillater en ett-trinns tilnærming for å skille, bilde og karakterisere sirkulerende blodlegemer, og å oppdage anemi, sigdcellesykdom og sirkulerende tumorceller basert på tetthet og magnetiske egenskaper. Denne tilnærmingen er også egnet til å oppdage løselige antigener tilstede i en løsning ved å bruke sett med lav- og høy tetthet perler belagt med henholdsvis fangst- og deteksjonsantistoffer. Hvis antigenet er til stede i løsningen, vil det bygge bro over de to settene med perler, og generere et nytt perle-perlekompleks, som vil levitere mellom radene med antistoffbelagte perler. Økt konsentrasjon av målantigenet i løsningen vil generere et større antall perle-perlekomplekser sammenlignet med lavere konsentrasjoner av antigen, og dermed muliggjøre kvantitative målinger av målantigenet. Magnetisk levitasjon er fordelaktig for andre metoder på grunn av redusert prøveforberedelsestid og mangel på avhengighet av klassiske avlesningsmetoder. Bildet som genereres, fanges og analyseres enkelt ved hjelp av et standard mikroskop eller mobilenhet, for eksempel en smarttelefon eller et nettbrett.

Magnetisk levitasjon fokuserer objekter av forskjellige tettheter i forskjellige levitasjonshøyder avhengig av objektets tetthet, den magnetiske signaturen, konsentrasjonen av paramagnetisk løsning og styrken til magnetfeltet skapt av to sterke, sjeldne jordmagneter. Ettersom de to magnetene er plassert oppå hverandre, kan leviterende prøver bare vises, samtidig som Köhler-belysningen opprettholdes ved å bruke et mikroskop som er slått på siden (Figur 1). Den endelige levitasjonshøy...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation at JoVE.com

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Dette papiret beskriver en magnetisk levitasjonsbasert metode som spesifikt kan oppdage tilstedeværelsen av antigener, enten løselige eller membranbundne, ved å kvantifisere endringer i levitasjonshøyden på fangstperler med faste tettheter.

Kvantifisering av cellulære tettheter og antigene egenskaper ved hjelp av magnetisk levitasjon

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Denne teknikken tillater separasjon av ulike celletyper og celler som gjennomgår ulike prosesser basert utelukkende på tetthet med liten eller ingen manipulering på kort tid. De viktigste fordelene ved denne metoden er at den som minimalt invasiv, krever små volumer, gir raske resultater, ikke er avhengig av klassiske avlesninger, og spesialisert personell er ikke nødvendig. Denne teknikken kan brukes til å oppdage flere sykdommer, for eksempel anemi og sepsis.For å begynne å bruke lancing-enheten med ett klikk for å stikke fingeren på rhesusfaktoren positiv blodgiver, og samle 10 mikroliter blod i en milliliter DPBS. Tilsett en mikroliter fluorescerende fargestoff i en milliliter suspensjon av rhesusfaktor positive celler til fluorescerende farget plasmamembranen og inkuber ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Pellet cellene ved å spinne på 5600 ganger G i 15 sekunder og vask pellet tre ganger ved hjelp av en milliliter DPBS.Resuspend pellet i en milliliter HBSS med kalsium og magnesium. Bruk lancing-enheten med ett klikk til å stikke fingeren på rhesusfaktoren negativ blodgiver og samle to mikroliter blod. For å forberede det eksperimentelle røret som bare inneholder perler, tilsett 174 mikroliter HBSS med kalsium og magnesium, en mikroliter IgG-kontrollperler, en mikroliter tunge perler med en 1,2 gram per milliliter tetthet og 24 mikroliter 500 millimolar gadolinium.For å forberede det eksperimentelle kontrollrøret som inneholder IgG, tilsett 172 mikroliter HBSS med kalsium og magnesium, en mikroliter IgG-kontrollperler, en mikroliter tunge perler, en mikroliter rhesusfaktor negativt blod, en mikroliter farget rhesusfaktor positiv blodsuspensjon og 24 mikroliter 500 millimolar gadolinium. For å forberede prøveeksperisjonelt rør, tilsett 172 mikroliter HBSS med kalsium og magnesium, en mikroliter anti-RhD belagt perler, en mikroliter tunge perler, en mikroliter rhesusfaktor negativt blod, en mikroliter farget rhesusfaktor positiv blodoppheng og 24 mikroliter med 500 millimolar gadolinium. Sett opp den magnetiske levitasjonsenheten.Og last 50 mikroliter av prøven inn i et kapillærrør til røret er fylt. Forsegle endene av kapillærrøret med et kapillært tetningsmiddel som sikrer at det ikke er noen bobler. Plasser kapillærrøret i kapillærholderen mellom topp- og bunnmagnetene, juster scenen og fokus for optimal visning.Vent omtrent fem til 20 minutter på at cellene og perlene skal slå seg ned i sin magnetiske likevektsposisjon. Ved hjelp av denne protokollen ble blodcellene skilt avhengig av levitasjonshøyden ved hjelp av den magnetiske levitasjonsanordningen. Lav og høy tetthet perler ble brukt til å gi tetthet levitasjon høyder og størrelse referanser.De polymorforukære cellene leviterte over de røde blodcellene ved 21 millimolar gadoliniumionkonsentrasjon. Gamle blodlegemer leviterte ved 60 millimolar gadoliniumion konsentrasjon. De røde blodcellene, polymorfoukære celler og lymfocytter ble separert ved 40 millimolar gadoliniumionkonsentrasjon basert på deres iboende tettheter.Rhesusfaktorantigenet ble påvist på de røde blodcellene ved hjelp av IgG og anti-RhD antistoffbelagte perler. Perlerøde cellekompleksene ble ikke generert i IgG-kontrollprøven, men de fluorescerende fargede røde blodcellene fanget av rhesusfaktorens positive perler ble oppdaget. Bindingen av anti-RhB til rhesusfaktor positive celler skapte et perlecellekompleks i midten ved periodisk tetthet av de ubundne perlene og de negative røde blodcellene.Videre ble den komplekse formasjonen bekreftet ved å observere den avgitte fluorescensen. B-perlekompleksene dannet mellom de høye og lave tetthetsperlene belagt med antistoffene for CR1 og CD47 indikerer tilstedeværelsen av røde blodlegemer avledet ekstracellulære vesikler. Å kapre kapillæren uten å introdusere bobler er det mest utfordrende trinnet og krever øvelse.Denne metoden kan gi innsikt i hematologi, spesielt fokusert på røde blodlegemer.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Kvantifisering Mixing bruke Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

AFM-baserte Kartlegging av de elastiske egenskapene Cell Vegger: ved Tissue, Cellular, og subcellulære resolusjoner

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Valgt Reaction Monitoring massespektrometri for Absolute Protein Kvantifisering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Cellular Redox Profiling ved hjelp av høy innholdsmikroskopi

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Fisk Sperm vurdering ved hjelp av programvare og kjøling enheter

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Visualisering av lymfe node struktur og Cellular lokalisering bruker ex-vivo Konfokalmikroskopi mikroskopi

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Kryogene prøver som lastes inn i en magisk vinkel som spinner kjernefysisk magnetisk resonansspektrometer som bevarer cellulær levedyktighet

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Kvantifisering av interbakteriell konkurranse ved bruk av encellet fluorescensavbildning

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...