Name: quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation
Uploaded: 2021-05-17T15:00:00
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Os autores agradecem ao Dr. Getúlio Pereira pela ajuda com o trabalho de vesícula extracelular.
Este trabalho foi apoiado pelas seguintes bolsas do Instituto Nacional de Saúde ao ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 e UG3TR002881.

O protocolo experimental utilizado neste estudo foi aprovado pelo Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).
1. Configuração do instrumento
NOTA: As células levitando de imagem requer dois ímãs de neodímio de terras raras magnetizados no eixo z para serem colocados com o mesmo polo voltados um para o outro para gerar um campo magnético. A distância entre os ímãs pode ser personalizada dependendo da intensidade do campo magnético ...

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+subtle+changes+in+red+blood+cell+density+using+a+cell+phone.">Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone.</a> Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).</li><li>Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+pinocytosis+in+lymphoid+cells+has+a+low+capacity.">Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity.</a> Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).</li></ol>

Centrifugação gradiente é atualmente a técnica padrão para isolar componentes subcelulares com base em suas densidades únicas. Essa abordagem, no entanto, requer o uso de meios de gradientes especializados, bem como equipamentos de centrífuga. A abordagem de levitação magnética aqui apresentada permite uma investigação detalhada das propriedades morfológicas e funcionais das células circulantes, com mínimo, se alguma manipulação das células, proporcionando um acesso quase in vivo às células c...

Levitação magnética é uma técnica desenvolvida para separar, analisar e identificar os tipos celulares1,2,3, proteínas4,5 e opioides 6 baseadasapenas em sua densidade específica e propriedades paramagnéticas. A densidade celular é uma propriedade única e intrínseca de cada tipo celular diretamente relacionada à sua taxa metabólica e ao estado de diferenciação7,8,9,10,11,12,13,14. Quantificar mudanças sutis e transitórias na densidade celular durante condições de estado constante, e durante uma variedade de processos celulares, poderia permitir uma visão incomparável da fisiologia celular e da fisiopatologia. Alterações na densidade celular estão associadas à diferenciação celular15,16, progressão do ciclo celular9,17,18,19, apoptose20,21,22,23, e transformação maligna24,25,26 . Portanto, a quantificação de alterações específicas na densidade celular, pode ser usada para diferenciar entre células de diferentes tipos, bem como discriminar entre o mesmo tipo de células submetidas a vários processos de ativação. Isso permite experimentos que visam uma determinada subsumão celular, onde mudanças dinâmicas na densidade servem como um indicador do metabolismo celular alterado27. Como foi estabelecido que uma célula pode alterar sua densidade em resposta a um ambiente em mudança7,é imperativo medir a cinética da célula em relação à sua densidade para entendê-la plenamente, que os métodos atuais podem não fornecer12. A levitação magnética, por outro lado, permite uma avaliação dinâmica das células e suas propriedades28.
As células são diamagnéticas, o que significa que elas não têm um momento de dipolo magnético permanente. No entanto, quando exposto a um campo magnético externo, um momento fraco de dipolo magnético é gerado nas células, na direção oposta do campo aplicado. Assim, se as células forem suspensas em uma solução paramagnética e expostas a um forte campo magnético vertical, elas levitarão para longe da fonte magnética e pararão até uma altura, que depende principalmente de sua densidade individual. A levitação diamagnética de um objeto confinado ao mínimo de um campo magnético inhomogenous é possível quando os dois seguintes critérios são cumpridos: 1) a suscetibilidade magnética da partícula deve ser menor do que a do meio circundante, e 2) a força magnética deve ser forte o suficiente para contrabalançar a força de flutuação da partícula. Ambos os critérios podem ser preenchidos suspendendo os RBCs em um buffer magnético e criando fortes gradientes de campo magnético com ímãs permanentes pequenos, baratos e comercialmente disponíveis1. A posição de equilíbrio de uma partícula presa magneticamente em um eixo ao longo da direção da gravidade é determinada por sua densidade (em relação à densidade do tampão), sua suscetibilidade magnética (em relação à suscetibilidade magnética do tampão) e a assinatura do campo magnético aplicado. Como a densidade e as propriedades magnéticas da solução são constantes em todo o sistema, as propriedades de densidade intrínseca das células serão o principal fator determinante da altura de levitação das células, com células mais densas levitando mais baixas em comparação com células menos densas. Esta abordagem utiliza um conjunto de duas contas de referência de densidade (1,05 e 1,2 g/mL) que nos permite usar análises precisas e racionmétricas para medições de densidade. Alterar a concentração da solução magnética permite isolar diferentes populações celulares, como RBCs de WBCs, já que a densidade das células circulantes é específica das células, removendo a necessidade de protocolos de isolamento ou outras manipulações celulares.
A maioria dos métodos de detecção usados em pesquisas de biologia dependem da extrapolação de eventos de ligação específicos em sinais lineares fáceis de quantificar. Esses métodos de leitura são muitas vezes complexos e envolvem equipamentos especializados e pessoal científico dedicado. Uma abordagem destinada à detecção de antígenos encontrados na membrana plasmática das células ou vesículas extracelulares ou que são solúveis no plasma, usando uma ou duas contas revestidas de anticorpos, está aqui descrita. As contas devem ser de densidades diferentes umas das outras e das dos alvos interrogados. A presença do antígeno alvo em qualquer biofluido é traduzida em uma mudança específica e mensurável na altura de levitação de uma célula antígeno positivo que está ligada a uma conta de detecção. No caso de antígenos solúveis ou vesículas extracelulares, eles são obrigados tanto à captura quanto à detecção de contas, formando um complexo de contas de contas em vez de complexo de células de contas. A mudança na altura da levitação depende da nova densidade dos complexos de células de contas ou contas de contas. Além da mudança na altura de levitação dos complexos, o que indica a presença de antígeno no biofluido, o número de complexos também depende da quantidade de destino, tornando a levitação magnética também uma abordagem quantitativa para detecção de antígenos24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-2933</td>
			<td>(MES); component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197&#34;) thickness</td>
			<td>K&#38;J Magnetics</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Magnets used for the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Tube Sealant (Critoseal)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>267620</td>
			<td>Used to cap the ends of the capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS8163</td>
			<td>Used to wash beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Lab Jack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ750</td>
			<td>Used for adjusting the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Solution for bead suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9508-100ML</td>
			<td>Used during a wash step for beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37608</td>
			<td>Used to stain Rh+ cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol Injection</td>
			<td>ProHance</td>
			<td>NDC 0270-1111-03</td>
			<td>Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS++</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td>Solution for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C5b,6 complex</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A122</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C7 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A124</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C8 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A125</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C9 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A126</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Series Post Collar</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSR2</td>
			<td>Used to secure magnetic levitation device to lab jacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1769-10G</td>
			<td>(EDC); used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AB-105-C</td>
			<td>Used to coat beads as a control condition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BM-220</td>
			<td>Component of coupling buffer, used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td>Component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Carboxyl Polymer</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>PC06004</td>
			<td>Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit RhD Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-112694</td>
			<td>Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Grade Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Provis AX-70</td>
			<td>Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Dampening Feet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RDF1</td>
			<td>Used to support the breadboard table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Boro Tubing</td>
			<td>VitroTubes</td>
			<td>8100-050</td>
			<td>Capillary tube used for loading sample into Maglev</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>24510</td>
			<td>Used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translational Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT1</td>
			<td>Used for focusing and for scanning capillary tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation

O método descrito foi desenvolvido com base nos princípios da levitação magnética, que separa células e partículas com base em sua densidade e propriedades magnéticas. Densidade é um tipo de célula que identifica propriedade, diretamente relacionada à sua taxa metabólica, diferenciação e status de ativação. A levitação magnética permite uma abordagem de um passo para separar, imagem e caracterizar com sucesso as células sanguíneas circulantes, e detectar anemia, doença falciforme e células tumorais circulantes com base na densidade e propriedades magnéticas. Esta abordagem também é favorável à detecção de antígenos solúveis presentes em uma solução usando conjuntos de contas de baixa e alta densidade revestidas com anticorpos de captura e detecção, respectivamente. Se o antígeno estiver presente na solução, ele fará a ponte entre os dois conjuntos de contas, gerando um novo complexo de contas de contas, que levitará entre as fileiras de contas revestidas de anticorpos. O aumento da concentração do antígeno alvo na solução gerará um número maior de complexos de contas de contas quando comparados com menores concentrações de antígeno, permitindo assim medições quantitativas do antígeno alvo. A levitação magnética é vantajosa para outros métodos devido ao seu tempo de preparação amostral reduzido e à falta de dependência dos métodos clássicos de leitura. A imagem gerada é facilmente capturada e analisada usando um microscópio padrão ou dispositivo móvel, como um smartphone ou um tablet.

A levitação magnética concentra objetos de diferentes densidades em diferentes alturas de levitação, dependendo da densidade do objeto, sua assinatura magnética, a concentração de solução paramagnética e a força do campo magnético criado por dois ímãs fortes e de terras raras. À medida que os dois ímãs são colocados em cima um do outro, as amostras levitando só podem ser vistas, mantendo a iluminação de Köhler, usando um microscópio virado de lado(Figura 1). A altura ...

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Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Este artigo descreve um método baseado em levitação magnética que pode detectar especificamente a presença de antígenos, solúveis ou ligados à membrana, quantificando mudanças na altura de levitação das contas de captura com densidades fixas.

Quantificação de Densidades Celulares e Propriedades Antigênicas usando Levitação Magnética

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Esta técnica permite a separação de vários tipos celulares e células submetidas a vários processos baseados apenas na densidade com pouca ou nenhuma manipulação em um curto período de tempo. As principais vantagens deste método são que ele, como minimamente invasivo, requer pequenos volumes, proporciona resultados rápidos, não depende de leituras clássicas, e pessoal especializado não é necessário. Essa técnica pode ser aplicada para detectar múltiplas doenças, como anemia e sepse.Para começar a usar o dispositivo de lancing de um clique para picar o dedo do fator rhesus doador positivo de sangue, e coletar 10 microliters de sangue em um mililitro de DPBS. Adicione um microliter de corante fluorescente em uma suspensão mililitro das células positivas do fator resus para manchar fluorescentemente a membrana plasmática e incubar a 37 graus Celsius por 15 minutos. Pelota as células girando a 5.600 vezes G durante 15 segundos e lave a pelota três vezes usando um mililitro de DPBS.Resuspende a pelota em um mililitro de HBSS com cálcio e magnésio. Use o dispositivo de um clique para picar o dedo do fator rhesus negativo doador de sangue e coletar dois microliters de sangue. Para preparar o tubo experimental contendo apenas contas, adicione 174 microliters de HBSS com cálcio e magnésio, um microliter de contas de controle IgG, um microliter de contas pesadas com densidade de 1,2 grama por mililitro, e 24 microliters de 500 milmolares de gadolínio.Para preparar o tubo de controle experimental contendo IgG, adicione 172 microliters de HBSS com cálcio e magnésio, um microliter de contas de controle IgG, um microlitr de contas pesadas, um microliter de sangue negativo fator rhesus, um microlitr de resus fator positivo suspensão sanguínea, e 24 microlitadores de 500 mililitros de gadolinium. Para preparar o tubo experimental da amostra, adicione 172 microliters de HBSS com cálcio e magnésio, um microliter de contas revestidas anti-RhD, um microlitr de contas pesadas, um microliter de sangue negativo do fator resus, um microliter de fator resus manchado de suspensão positiva do sangue, e 24 microliters de 500 mililitros de gadolar de 500 mililitros. Configure o dispositivo de levitação magnética.E carregue 50 microliters da amostra em um tubo capilar até que o tubo esteja cheio. Sele as extremidades do tubo capilar com um selante capilar garantindo que não haja bolhas. Coloque o tubo capilar no suporte capilar entre os ímãs superior e inferior, ajuste o estágio e o foco para uma visualização ideal.Aguarde aproximadamente de 5 a 20 minutos para que as células e contas se instalem em sua posição de equilíbrio magnético. Usando este protocolo, as células sanguíneas foram separadas dependendo da altura da levitação usando o dispositivo de levitação magnética. Contas de baixa e alta densidade foram usadas para fornecer alturas de levitação de densidade e referências de tamanho.As células polimorfonucleares estavam levitando acima dos glóbulos vermelhos em 21 milimônios concentração de íons de gadolinium. Células sanguíneas antigas estavam levitando em 60 milimolars de concentração de íons de gadolinium. Os glóbulos vermelhos, as células polimorfonucleares e os linfócitos foram separados a 40 milimilas de concentração de íons gadolínio com base em suas densidades intrínsecas.O antígeno do fator rhesus foi detectado nos glóbulos vermelhos usando contas revestidas de anticorpos IgG e anti-RhD. Os complexos de células vermelhas não foram gerados na amostra de controle de IgG, mas foram detectados os glóbulos vermelhos fluorescentes capturados pelas contas positivas do fator rhesus. A ligação do anti-RhB às células positivas do fator rhesus criou um complexo de células de contas no centro em densidade intermitente das contas não ligadas e dos glóbulos vermelhos negativos.Além disso, a formação complexa foi confirmada observando a fluorescência emitida. Os complexos de contas B formados entre as contas de alta e baixa densidade revestidas com os anticorpos para CR1 e CD47 indicam a presença de vesículas extracelulares derivadas de glóbulos do sangue vermelho. Cobrir o capilar sem introduzir bolhas é o passo mais desafiador e requer prática.Esse método poderia fornecer insights para a hematologia, especialmente focado em doenças de glóbulos vermelhos.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolamento de proteínas lábeis Multi-Complexos por In vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Imuno-magnética cromatografia de afinidade

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Biologia

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Quantificar mistura usando Ressonância Magnética

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

Mapeamento baseado em AFM das propriedades elásticas de paredes celulares: em tecido, os celulares, e as Resoluções Subcelulares

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Redox Cellular Profiling Usando Microscopia de Alto Conteúdo

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Avaliação do esperma de peixe utilizando Software e dispositivos de refrigeração

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Visualizando estrutura de linfonodos e localização celular usando microscopia confocal ex-vivo

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Amostra criogênica carregando em um espectrômetro de ressonância magnética nuclear de ângulo mágico que preserva a viabilidade celular

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Quantificação da Competição Interbacteriana usando imagens de fluorescência unicelular

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...