Name: quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation
Uploaded: 2021-05-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Жетулио Перейру за помощь во внеклеточной работе с везикулами.
Эта работа была поддержана следующими грантами Национального института здравоохранения для МКГ: RO1CA218500, UG3HL147353 и UG3TR002881.

Экспериментальный протокол, используемый в этом исследовании, был одобрен Институциональным наблюдательным советом Медицинского центра диакониссы Бет Исраэль (IRB).
1. Настройка приборов
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация левитирующих клеток требует, чтобы два редк?...

<ol>
	<li>Tasoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levitational+Image+Cytometry+with+Temporal+Resolution.">Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution.</a> Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).</li><li>Durmus, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+levitation+of+single+cells.">Magnetic levitation of single cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (28), 3661-3668 (2015).</li><li>Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart-Phone+Based+Magnetic+Levitation+for+Measuring+Densities.">Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities.</a> PLoS One. 10 (8), 0134400 (2015).</li><li>Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+Levitated+Plasma+Proteins.">Magnetically Levitated Plasma Proteins.</a> Analytical Chemistry. 92 (2), 1663-1668 (2020).</li><li>Yaman, S., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+Susceptibility-Based+Protein+Detection+Using+Magnetic+Levitation.">Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation.</a> Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).</li><li>Abrahamsson, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Powders+Containing+Illicit+Drugs+Using+Magnetic+Levitation.">Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation.</a> Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).</li><li>Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+cell+density+alter+protein+markers+of+multiple+cellular+compartments,+confounding+experimental+outcomes.">Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes.</a> PLoS One. 14 (2), 02117227 (2019).</li><li>Hart, A., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+fluctuations+during+the+cell+cycle+of+Bacillus+subtilis.">Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis.</a> Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).</li><li>Poole, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+buoyant+density+during+the+cell+cycle+of+Escherichia+coli+K12:+significance+for+the+preparation+of+synchronous+cultures+by+age+selection.">Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection.</a> The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).</li><li>Cass, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density-dependent+fluctuations+in+membrane+permeability+in+logarithmically+growing+cell+cultures.">Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures.</a> Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).</li><li>Grover, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single-cell+density.">Measuring single-cell density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 10992-10996 (2011).</li><li>Bryan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+single+cell+mass,+volume,+and+density+with+dual+suspended+microchannel+resonators.">Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators.</a> Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).</li><li>Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+sensing+and+size+determination.">Cell density sensing and size determination.</a> Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).</li><li>Neurohr, G. E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+and+Regulation+of+Cell+Density.">Relevance and Regulation of Cell Density.</a> Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).</li><li>Maric, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+gradients+in+proliferation+and+differentiation+of+embryonic+rat+CNS+accessed+by+buoyant+density+fractionation:+alpha+3,+beta+3+and+gamma+2+GABAA+receptor+subunit+co-expression+by+post-mitotic+neocortical+neurons+correlates+directly+with+cell+buoyancy.">Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy.</a> European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).</li><li>Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+gradient+fractionation+and+flow+cytometric+analysis+of+embryonic+rat+cortical+neurons+and+progenitor+cells.">Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells.</a> Methods. 16 (3), 247-259 (1998).</li><li>Wolff, D. A., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+HeLa+cells+by+colloidal+silica+density+gradient+centrifugation.+I.+Separation+and+partial+synchrony+of+mitotic+cells.">Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells.</a> Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).</li><li>Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+replication,+cytopathology,+and+lysosomal+enzyme+response+of+mitotic+and+interphase+Hep-2+cells+infected+with+poliovirus.">Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus.</a> Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).</li><li>Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyant+density+variation+during+the+cell+cycle+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).</li><li>Yurinskaya, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymocyte+K+,+Na++and+water+balance+during+dexamethasone-+and+etoposide-induced+apoptosis.">Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).</li><li>Wyllie, A. H., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-induced+cell+death.+Purification+ad+properties+of+thymocytes+undergoing+apoptosis+after+glucocorticoid+treatment.">Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment.</a> American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).</li><li>Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone-induced+cell+death.+2.+Surface+changes+in+thymocytes+undergoing+apoptosis.">Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis.</a> American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).</li><li>Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cell+volume+loss+in+CEM-C7A+cells+during+dexamethasone-induced+apoptosis.">Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis.</a> American Journal of Physiology. 270 (4), 1190-1203 (1996).</li><li>Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+density+and+volume+in+normal+subjects+and+in+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia.">Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 48 (3), 361-371 (1976).</li><li>Huber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+the+buoyant+density+distribution+of+normal+and+malignant+lymphocytes.">A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes.</a> British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).</li><li>Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunological+enrichment+method+for+epithelial+cells+from+peripheral+blood.">An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood.</a> Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).</li><li>Andersen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Implementation+of+Magnetic+Levitation+to+Quantify+Leukocyte+Size,+Morphology,+and+Magnetic+Properties+to+Identify+Patients+with+Sepsis.">A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis.</a> Shock. , (2018).</li><li>Felton, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+subtle+changes+in+red+blood+cell+density+using+a+cell+phone.">Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone.</a> Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).</li><li>Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+pinocytosis+in+lymphoid+cells+has+a+low+capacity.">Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity.</a> Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).</li></ol>

Градиентное центрифугирование в настоящее время является стандартным методом выделения субклеточных компонентов на основе их уникальных плотностей. Этот подход, однако, требует использования специализированных градиентных сред, а также центрифужного оборудования. Представленный з...

Магнитная левитация - это метод, разработанный для разделения, анализа и идентификации типов клеток1,2,3,белков4,5 и опиоидов 6 наоснове исключительно их удельной плотности и парамагнитных свойств. Плотность клетокявляется уникальным, неотъемлемым свойством каждого типа клеток, непосредственно связанным с ее скоростью метаболизма и статусом дифференцировки7,8,9,10, 11,12,13,14. Количественная оценка тонких и преходящих изменений плотности клеток во время стационарных условий и во время различных клеточных процессов может позволить себе непревзойденное понимание физиологии и патофизиологии клеток. Изменения плотности клеток связаны с дифференцировкой клеток15,16,прогрессированием клеточного цикла9,17,18,19,апоптозом20,21,22,23и злокачественной трансформацией24,25,26 . Поэтому количественная оценка специфических изменений плотности клеток может быть использована для дифференциации клеток разных типов, а также для различения между клетками одного и того же типа, подвергающимися различным процессам активации. Это позволяет проводить эксперименты, нацеленные на конкретную клеточную субпуплощадию, где динамические изменения плотности служат индикатором измененного клеточного метаболизма27. Поскольку было установлено, что клетка может изменять свою плотность в ответ на изменение среды7,необходимо измерить кинетику клетки по отношению к ее плотности, чтобы полностью понять ее, что современные методы могут не обеспечить12. Магнитная левитация, с другой стороны, позволяет динамически оценить клетки и их свойства28.
Клетки являются диамагнитными, что означает, что они не имеют постоянного магнитного дипольного момента. Однако при воздействии внешнего магнитного поля в ячейках генерируется слабый магнитный дипольный момент, в направлении, противоположном приложенного поля. Таким образом, если ячейки суспендировать в парамагнитном растворе и подвергнуть воздействию сильного вертикального магнитного поля, они будут левитировать в сторону от магнитного источника и останавливаться на высоте, которая зависит в первую очередь от их индивидуальной плотности. Диамагнитная левитация объекта, ограниченного минимумом неоднородного магнитного поля, возможна при выполнении двух следующих критериев: 1) магнитная восприимчивость частицы должна быть меньше, чем у окружающей среды, и 2) магнитная сила должна быть достаточно сильной, чтобы уравновесить силу плавучести частицы. Оба критерия могут быть выполнены путем приостановки эритроцитов в магнитном буфере и путем создания сильных градиентов магнитного поля с небольшими, недорогими, коммерчески доступными постоянными магнитами1. Равновесное положение магнитно захваченной частицы на оси вдоль направления гравитации определяется ее плотностью (относительно плотности буфера), ее магнитной восприимчивостью (относительно магнитной восприимчивости буфера) и сигнатурой приложенного магнитного поля. Поскольку плотность и магнитные свойства раствора постоянны во всей системе, свойства внутренней плотности клеток будут основным фактором, определяющим высоту левитации клеток, причем более плотные клетки левитируют ниже по сравнению с менее плотными клетками. Этот подход использует набор из двух эталонных шариков плотности (1,05 и 1,2 г / мл), что позволяет нам использовать точный логометрический анализ для измерения плотности. Изменение концентрации магнитного раствора позволяет изолировать различные клеточные популяции, такие как эритроциты, от WBC, поскольку плотность циркулирующих клеток специфична для клеток, устраняя необходимость в протоколах изоляции или других клеточных манипуляциях.
Большинство методов обнаружения, используемых в биологических исследованиях, основаны на экстраполяции конкретных событий связывания в простые для количественной оценки линейные сигналы. Эти методы считывания часто являются сложными и включают специализированное оборудование и специализированный научный персонал. В настоящем описан подход, направленный на обнаружение антигенов, обнаруженных либо на плазматической мембране клеток или внеклеточных везикул, либо растворимых в плазме, с использованием одного или двух шариков, покрытых антителами. Бусины должны быть разной плотности друг от друга и от плотности опрашиваемых целей. Присутствие антигена-мишени в любой данной биожидкости переводится в специфическое, измеримое изменение высоты левитации антиген-положительной клетки, которая связана с обнаруженной шариком. В случае растворимых антигенов или внеклеточных везикул они связаны как с захватом, так и с обнаружением бусин, образуя комплекс бисера-шарик, а не комплекс бисероплетение-клетка. Изменение высоты левитации зависит от новой плотности комплексов бисероплетение или бисероплетение. Помимо изменения высоты левитации комплексов, что указывает на наличие антигена в биожидкости, количество комплексов также зависит от количества мишени, что делает магнитную левитацию также количественным подходом для обнаружения антигена24.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-2933</td>
			<td>(MES); component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197&#34;) thickness</td>
			<td>K&#38;J Magnetics</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Magnets used for the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Tube Sealant (Critoseal)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>267620</td>
			<td>Used to cap the ends of the capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS8163</td>
			<td>Used to wash beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Lab Jack</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LJ750</td>
			<td>Used for adjusting the magnetic levitation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>Solution for bead suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9508-100ML</td>
			<td>Used during a wash step for beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37608</td>
			<td>Used to stain Rh+ cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol Injection</td>
			<td>ProHance</td>
			<td>NDC 0270-1111-03</td>
			<td>Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS++</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td>Solution for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C5b,6 complex</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A122</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C7 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A124</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C8 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A125</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human C9 protein</td>
			<td>Complement Technology, Inc</td>
			<td>A126</td>
			<td>Used to generate RBC Evs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Series Post Collar</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSR2</td>
			<td>Used to secure magnetic levitation device to lab jacks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1769-10G</td>
			<td>(EDC); used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AB-105-C</td>
			<td>Used to coat beads as a control condition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4)</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BM-220</td>
			<td>Component of coupling buffer, used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td>Component of activation buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Carboxyl Polymer</td>
			<td>Bangs Laboratories</td>
			<td>PC06004</td>
			<td>Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit RhD Polyclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-112694</td>
			<td>Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Grade Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Provis AX-70</td>
			<td>Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Dampening Feet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RDF1</td>
			<td>Used to support the breadboard table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Boro Tubing</td>
			<td>VitroTubes</td>
			<td>8100-050</td>
			<td>Capillary tube used for loading sample into Maglev</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>24510</td>
			<td>Used in antibody coupling reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translational Stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT1</td>
			<td>Used for focusing and for scanning capillary tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cellular densities and antigenic properties using magnetic levitation

Описанный метод был разработан на основе принципов магнитной левитации, которая разделяет клетки и частицы на основе их плотности и магнитных свойств. Плотность — это свойство, идентифицирующее тип клетки, напрямую связанное с ее скоростью метаболизма, дифференцировкой и статусом активации. Магнитная левитация позволяет использовать одношаговый подход к успешному разделению, визуализации и характеристике циркулирующих клеток крови, а также к обнаружению анемии, серповидно-клеточной анемии и циркулирующих опухолевых клеток на основе плотности и магнитных свойств. Этот подход также поддается обнаружению растворимых антигенов, присутствующих в растворе, с использованием наборов бусин низкой и высокой плотности, покрытых антителами захвата и обнаружения, соответственно. Если антиген присутствует в растворе, он соединит два набора бусин, создавая новый комплекс бусины-шарик, который будет левитировать между рядами бусин, покрытых антителами. Повышенная концентрация антигена-мишени в растворе будет генерировать большее количество комплексов бисера-шарик по сравнению с более низкими концентрациями антигена, что позволит проводить количественные измерения антигена-мишени. Магнитная левитация выгодна для других методов из-за сокращения времени подготовки образца и отсутствия зависимости от классических методов считывания. Сгенерированное изображение легко захватывается и анализируется с помощью стандартного микроскопа или мобильного устройства, такого как смартфон или планшет.

Магнитная левитация фокусирует объекты разной плотности на разных высотах левитации в зависимости от плотности объекта, его магнитной сигнатуры, концентрации парамагнитного раствора и силы магнитного поля, создаваемого двумя сильными редкоземельными магнитами. Поскольку два магнит...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation at JoVE.com

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

В этой статье описывается метод на основе магнитной левитации, который может специфически обнаруживать присутствие антигенов, растворимых или связанных с мембраной, путем количественной оценки изменений высоты левитации бусин захвата с фиксированной плотностью.

Количественная оценка клеточных плотностей и антигенных свойств с использованием магнитной левитации

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Этот метод позволяет разделять различные типы клеток и клетки, подвергающиеся различным процессам исключительно на основе плотности, практически без манипуляций за короткий промежуток времени. Основные преимущества данного метода заключаются в том, что он как малоинвазивный, требует небольших объемов, обеспечивает быстрый результат, не зависит от классических считывания, а специализированный персонал не требуется. Этот метод может быть применен для выявления множественных заболеваний, например анемии и сепсиса.Для начала используют устройство для прокалывания одним щелчком мыши, чтобы уколоть палец резус-фактора положительного донора крови, и собрать 10 микролитров крови в одном миллилитрах DPBS. Добавьте один микролитр флуоресцентного красителя в один миллилитр суспензии положительных клеток резус-фактора для флуоресцентного окрашивания плазматической мембраны и инкубируют при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут. Гранулируют ячейки, вращаясь при 5 600 G в течение 15 секунд и промывая гранулу три раза, используя один миллилитр DPBS.Повторно суспендируют гранулу в одном миллилитрах HBSS с кальцием и магнием. Используйте устройство для прокалывания одним щелчком мыши, чтобы уколоть палец отрицательного донора крови с резус-фактором и собрать два микролитра крови. Чтобы подготовить экспериментальную трубку, содержащую только бусины, добавьте 174 микролитра HBSS с кальцием и магнием, один микролитр контрольных шариков IgG, один микролитр тяжелых бусин плотностью 1,2 грамма на миллилитр и 24 микролитра 500 миллимоляров гадолиния.Для подготовки экспериментальной контрольной трубки, содержащей IgG, добавьте 172 микролитра HBSS с кальцием и магнием, один микролитр контрольных шариков IgG, один микролитр тяжелых шариков, один микролитр отрицательной крови с резус-фактором, один микролитр окрашенной положительной суспензии крови с резус-фактором и 24 микролитра 500 миллимоляров гадолиния. Для подготовки образца экспериментальной пробирки добавьте 172 микролитра HBSS с кальцием и магнием, один микролитр бусин с анти-RhD-покрытием, один микролитр тяжелых шариков, один микролитр отрицательной крови с резус-фактором, один микролитр окрашенной положительной суспензии крови с резус-фактором и 24 микролитра 500 миллимоляров гадолиния. Настройте устройство магнитной левитации.И загрузите 50 микролитров образца в капиллярную трубку до тех пор, пока трубка не будет заполнена. Запечатайте концы капиллярной трубки капиллярным герметиком, гарантируя, что пузырьков не будет. Поместите капиллярную трубку в капиллярный держатель между верхним и нижним магнитами, отрегулируйте сцену и фокусировку для оптимального просмотра.Подождите примерно от пяти до 20 минут, пока клетки и шарики осядет в их магнитном равновесии. Используя этот протокол, клетки крови были разделены в зависимости от высоты левитации с помощью магнитного устройства левитации. Бусины низкой и высокой плотности использовались для обеспечения высоты левитации плотности и ссылок на размер.Полиморфноядерные клетки левитировали над эритроцитами при концентрации 21 миллимолярного иона гадолиния. Старые клетки крови левитировали при концентрации ионов гадолиния 60 миллимоляров. Эритроциты, полиморфноядерные клетки и лимфоциты были разделены при концентрации ионов гадолиния 40 миллимоляров на основе их внутренней плотности.Антиген резус-фактора был обнаружен на красных кровяных клетках с использованием бусин, покрытых IgG и анти-RhD антителами. Комплексы эритроцитов бусин не были сгенерированы в контрольном образце IgG, но были обнаружены флуоресцентно окрашенные эритроциты, захваченные положительными шариками резус-фактора. Связывание анти-RhB с положительными клетками резус-фактора создало клеточный комплекс шариков в центре при прерывистой плотности несвязаных шариков и отрицательных эритроцитов.Далее образование комплекса было подтверждено наблюдением за испускаемой флуоресценцией. Комплексы шариков B, образованные между бусинами высокой и низкой плотности, покрытыми антителами к CR1 и CD47, указывают на наличие внеклеточных везикул, полученных из эритроцитов. Укупорка капилляра без введения пузырьков является самым сложным шагом и требует практики.Этот метод может дать представление о гематологии, особенно ориентированной на заболевания эритроцитов.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Выделение лабильной Multi-белковые комплексы по В естественных условиях Контролируемые Сотовая сшивания и иммуно-магнитного аффинной хроматографии

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Количественная оценка Белки Использование пептидов обогащению иммуноаффинной В сочетании с масс-спектрометрии

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Количественная Смешивание использованием магнитно-резонансная томография

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

АСМ на основе карт из упругих свойств клеточных стенок: на ткани, клеточном, и субклеточных резолюций

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Выбранный мониторинга реакций масс-спектрометрии для абсолютного белка количественной

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Сотовая редокс-профилирование с использованием высококонцентрированной микроскопии

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Рыбы спермы оценки с использованием программного обеспечения и охлаждающих устройств

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Визуализация структуры лимфатических узлов и клеточной локализации с помощью ex-Vivo Confocal Микроскопии

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Криогенная загрузка образца в вращающийся ядерный магнитно-резонансный спектрометр под магическим углом, который сохраняет жизнеспособность клеток

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Количественная оценка межбактериальной конкуренции с использованием одноклеточной флуоресцентной визуализации

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...