Name: preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis
Uploaded: 2021-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

تم تقديم الخدمات والدعم للمشروع البحثي من قبل مركز VCU Massey للسرطان للحصول على الأنسجة والبيانات وتحليلها الأساسية و VCU Lipidomics and Metabolomics Core ، والتي يتم دعمها جزئيا بتمويل من منحة دعم مركز السرطان NIH-NCI P30CA016059. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية R21CA232234 (سانتياغو ليما).

تم الحصول على أنسجة الرئة البشرية غير المحددة الهوية من جامعة فرجينيا كومنولث (VCU) الأنسجة والحصول على البيانات وتحليلها الأساسية بموجب بروتوكول (IRB) المعتمد من مجلس المراجعة الداخلية (IRB) (#HM2471). تمت الموافقة على استخدام الفئران للبحث وحصاد أنسجة الفئران من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخ?...

<ol>
	<li>Maceyka, M., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolites+in+inflammatory+disease.">Sphingolipid metabolites in inflammatory disease.</a> Nature. 510, 58-67 (2014).</li><li>Ogretmen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolism+in+cancer+signalling+and+therapy.">Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Hla, T., Dannenberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+signaling+in+metabolic+disorders.">Sphingolipid signaling in metabolic disorders.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).</li><li>Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+and+Sphingosine+Kinase+1+involvement+in+endocytic+membrane+Trafficking.">Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).</li><li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+is+required+for+BECN1-+and+ATG5-dependent+cell+death+induced+by+sphingosine+kinase+1+inhibition.">TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition.</a> Autophagy. , 1-50 (2018).</li><li>Young, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+Kinase+1+cooperates+with+autophagy+to+maintain+endocytic+membrane+trafficking.">Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking.</a> Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).</li><li>Young, M. M., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+as+regulators+of+autophagy+and+endocytic+trafficking.">Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking.</a> Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+endocytosis+and+sphingosine+kinase+1+recruitment.">Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment.</a> Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).</li><li>Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).</li><li>Rohrbach, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+sphingolipid+analysis+of+tissues+embedded+in+optimal+cutting+temperature+compound.">A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound.</a> Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).</li><li>Weston, L. A., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+LC-MS/MS+analysis+of+optimal+cutting+temperature+(OCT)+compound+removal+for+the+study+of+mammalian+proteomes.">Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes.</a> Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).</li><li>Holfeld, A., Vald&#233;s, A., Malmstr&#246;m, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+proteomic+workflow+for+mass+spectrometric+analysis+of+tissue+samples+preserved+by+different+methods.">Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).</li><li>Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteome+analysis+of+fresh+frozen+and+optimal+cutting+temperature+(OCT)+embedded+primary+non-small+cell+lung+carcinoma+by+LC-MS/MS.">Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS.</a> Methods. 81, 50-55 (2015).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+proteomics+using+chemical+immobilization+and+mass+spectrometry.">Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).</li></ol>

OCT هو عامل شائع للحفاظ على التبريد على المدى الطويل يستخدم في المستودعات الحيوية. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي OCT إلى قمع الأيونات عندما يتم تحليل الأنسجة بواسطة منصات قياس الطيف الكتلي المختلفة12،13،14،15 ، أو يؤدي إلى فقدان الإشارة ع?...

Sphingolipids هي مستقلبات نشطة بيولوجيا معروفة بأدوارها في التمثيل الغذائي البشري والمرض 1,2. أنها تنظم العمليات الخلوية المعقدة مثل هجرة الخلايا ، وبقاء الخلية وموتها ، وحركة الخلايا ، والاتجار الحويصلي ، والغزو الخلوي وورم خبيث ، وتكوين الأوعية ، وإنتاج السيتوكينات1،2،3،4،5،6،7،8،9 . تساهم العيوب في تنظيم استقلاب السفينغوليبيد في بدء السرطانات وتطورها ، وتحديد مدى عدوانية السرطانات ، وكيف تستجيب السرطانات للعلاج وتطور مقاومته 3,10. لذلك ، بسبب هذه التأثيرات الواسعة على مسببات المرض ، فإن الطرق التحليلية التي يمكن أن تحدد بدقة تغيرات السفينغوليبيد الخاصة بالمرض هي أدوات مهمة. قياس الطيف الكتلي (MS) هو الطريقة الأكثر دقة وموثوقية لتحليل تغيرات السفينغوليبيد.
يمكن الحصول على العينات البشرية التي يمكن استخدامها لتحليل تغيرات السفينغوليبيد بشكل مستقبلي من الجناح الجراحي أو بأثر رجعي من المستودعات الحيوية للأنسجة. الأنسجة الطازجة من الجراحة مفيدة لأنه يمكن تحليلها مباشرة عن طريق مرض التصلب العصبي المتعدد أو طرق تحليلية أخرى. ومع ذلك ، فإن الحصول على الأنسجة بشكل مستقبلي ينطوي على عقبات إدارية وتقنية ولوجستية ، وقد يكون جمع عينات كافية للوصول إلى القوة الإحصائية أمرا صعبا. يعد الحصول على الأنسجة من المستودعات الحيوية مفيدا لأنه يمكن الحصول عليها بأثر رجعي ، بأعداد كبيرة ، وتؤكد المستودعات الحيوية علم الأنسجة وعلم الأمراض ، وتستخدم إجراءات التشغيل القياسية للحفاظ على الأنسجة وتخزينها بالتبريد ، ويمكن أن توفر بيانات سريرية مرضية يمكن استخدامها لتحليلات الارتباط. ومع ذلك ، للحفاظ على السمات الجزيئية والهيكلية ، قد تحافظ المستودعات الحيوية على الأنسجة بالتبريد عن طريق تضمينها في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، والذي أظهرنا أنه يتداخل مع مقايسات تطبيع البيانات والقياس الكمي للسفينغوليبيدات بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة قياس الطيف الكتلي الترادفي للتأين بالرش الكهربائي (LC-ESI-MS / MS)11 . وقد تبين أيضا أن كحول البولي فينيل والبولي إيثيلين جلايكول ، المكونات الأساسية في مركب OCT ، تؤدي إلى قمع الأيونات في منصات تحليل MS الأخرى12،13،14،15. لذلك ، يجب إزالة مركب OCT من الأنسجة قبل تحليل sphingolipidomic بواسطة مرض التصلب العصبي المتعدد.
في تقرير سابق ، قمنا بالتحقق من صحة بروتوكول لإزالة مركب OCT من العينات البشرية لتحليل LC-ESI-MS / MS11 والمنهجية المستخدمة لوزن الأنسجة لتطبيع البيانات11. هنا ، نقوم بتفصيل خطوات بروتوكول إزالة مركب OCT sphingolipidomic (sOCTrP) ونعرض بيانات تمثيلية من أورام سرطان الرئة الغدي البشري والأنسجة الطبيعية المجاورة غير المصابة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL polypropylene pipette tips</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to retrieve specimens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-116</td>
			<td>Used for tube and tissue weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Sciex Analyst 1.6.2</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software to analyze and integrate MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Scale that is accurate to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top dispenser</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-723071</td>
			<td>Used for dispensing solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2212</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#946;-glucosyl-sphing-4-eine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2511</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#223;-lactosyl-sphing-4-ene</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2512</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Sphingomyelin&#160; (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2312</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHLOROFORM OMNISOLV 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1054-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClickSeal Biocontainment Lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75007309</td>
			<td>To prevent biohazard aeresols during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conflikt</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>4101</td>
			<td>Decontaminant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTO-20A/20AC Column Oven</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine;&#160; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2000</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2144</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGU20A5R degasser</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes 13x100mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>13x100 mm screw top tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated water bath</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For overnight lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 150</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-167</td>
			<td>triturate tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-177</td>
			<td>for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>Laboratory grade tissue used to make wicks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS Grade 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0486-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexera LC-30 AD binary pump system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-502</td>
			<td>13x100 mm screw top tube caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>To retrieve specimens from tubes after washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4987000118</td>
			<td>To dispense LC-MS internal standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89239-020</td>
			<td>Autoinjector vial caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Thread Glass Vials with ID Patch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46610-724</td>
			<td>Autoinjector vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIL-30AC autoinjector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD2030P1220</td>
			<td>For drying solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53822-U</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-ESI-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model 2800</td>
			<td>for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For sOCTrP and resuspending dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729572</td>
			<td>13x100 glass culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Hipersolve Chromanorm LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis

Sphingolipids هي مكونات خلوية لها أدوار راسخة في التمثيل الغذائي البشري والمرض. يمكن استخدام قياس الطيف الكتلي لتحديد ما إذا كانت الدهون السفينغولية تتغير في المرض والتحقيق فيما إذا كان يمكن استهداف السفينغوليبيدات سريريا. ومع ذلك ، فإن الدراسات المستقبلية التي تعمل بالطاقة بشكل صحيح والتي تكتسب الأنسجة مباشرة من الجناح الجراحي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا ، وتحديا تقنيا ولوجستيا وإداريا. في المقابل ، يمكن للدراسات بأثر رجعي الاستفادة من العينات البشرية المحفوظة بالتبريد المتاحة بالفعل ، عادة بأعداد كبيرة ، في المستودعات الحيوية للأنسجة. تشمل المزايا الأخرى لشراء الأنسجة من المستودعات الحيوية الوصول إلى المعلومات المرتبطة بعينات الأنسجة بما في ذلك الأنسجة وعلم الأمراض وفي بعض الحالات المتغيرات السريرية المرضية ، والتي يمكن استخدامها جميعا لفحص الارتباطات مع بيانات الدهون. ومع ذلك ، فإن القيود التقنية المتعلقة بعدم توافق مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) المستخدم في الحفظ بالتبريد وقياس الطيف الكتلي هي حاجز تقني لتحليل الدهون. ومع ذلك ، فقد أظهرنا سابقا أنه يمكن إزالة OCT بسهولة من عينات المستودع الحيوي البشري من خلال دورات الغسيل والطرد المركزي دون تغيير محتواها من السفينغوليبيد. لقد أثبتنا سابقا أن الدهون السفينغولية في الأنسجة البشرية المحفوظة بالتبريد في OCT مستقرة لمدة تصل إلى 16 عاما. في هذا التقرير ، نحدد الخطوات وسير العمل لتحليل الدهون السفينغولية في عينات الأنسجة البشرية المضمنة في OCT ، بما في ذلك أنسجة الغسيل ، ووزن الأنسجة لتطبيع البيانات ، واستخراج الدهون ، وإعداد العينات للتحليل بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة التأين بالرش الكهربائي لقياس الطيف الكتلي الترادفي (LC-ESI-MS / MS) ، تكامل بيانات قياس الطيف الكتلي ، تطبيع البيانات ، وتحليل البيانات.

في هذا البروتوكول ، نصف بالتفصيل طريقة لإزالة OCT من الأنسجة البشرية المحفوظة بالتبريد ووزن الأنسجة لتحليلها بواسطة LC-ESI-MS / MS. يتم سرد المواد المطلوبة لهذا الإجراء في جدول المواد. يظهر في الشكل 1 نتائج تجربة نموذجية حيث تم غسل 10 أورام غدية رئوية بشرية و 10 أنسجة مجاورة طبيعية لإزالة OC...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Sphingolipids هي مستقلبات نشطة بيولوجيا لها أدوار راسخة في الأمراض البشرية. يمكن أن يكشف توصيف التغيرات في الأنسجة باستخدام قياس الطيف الكتلي عن أدوار في مسببات المرض أو تحديد الأهداف العلاجية. ومع ذلك ، فإن مركب OCT المستخدم للحفظ بالتبريد في المستودعات الحيوية يتداخل مع قياس الطيف الكتلي. نحدد طرقا لتحليل الدهون السفينغولية في الأنسجة البشرية المضمنة في OCT باستخدام LC-ESI-MS / MS.

تحضير الأنسجة البشرية المضمنة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل لتحليل مطياف الكتلة

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

OCT هو عامل حفظ بالتبريد لا يتوافق مع تحليل قياس الطيف الكتلي. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين إزالة OCT من الأنسجة وتحديد كمية sphingolipids باستخدام مطياف الكتلة اللوني السائل جنبا إلى جنب. سيتم عرض تحضير فتائل تجفيف الأنسجة وغسل الأنسجة ووزن الأنسجة بواسطة أبريل بويد من جامعة فرجينيا كومنولث ، وسيتم عرض استخراج الدهون من قبل الدكتور جيريمي أليجود ، مدير مركز فرجينيا كومنولث الأيض والدهون الأساسية.للبدء ، قم بتنظيف المقص الجراحي عن طريق غمره في الميثانول لمدة خمس دقائق ، متبوعا بمسحه بنسيج نظيف من الدرجة المختبرية. باستخدام قفازات خالية من البودرة ، قم بتدوير نهاية نسيج من الدرجة المختبرية لإنشاء فتيل مدبب بدقة بطول 30 إلى 40 ملم. ثم باستخدام مقص تنظيف الميثانول ، وقطع الفتيل في النهاية السميكة ووضعه في صندوق من الورق المقوى النظيف.بعد ذلك ، باستخدام مقص الميثانول المنظف ، قم بقطع أربعة إلى خمسة ملليمترات من طرف ماصة ملليلتر واحد ووضع الطرف مرة أخرى في حامل الطرف. لغسل OCT من الأنسجة ، أضف 10 ملليلتر من الماء المنزوع الأيونات عالي النقاء إلى كل أنبوب يحتوي على أنسجة الرئة البشرية وقم بتغطيتها بإحكام. اسمح للأنابيب بالحضانة لمدة 10 دقائق.دوامة بقوة كل أنبوب حتى يتم إعادة إحياء جميع الأنسجة المودعة على جدران الأنبوب أو بيليه الأنسجة بالكامل. ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح مبرد مسبقا عند 4،000 إلى 5،000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، قم بفك الأنابيب الموجودة على الجليد.استنشاق محلول الغسيل بعناية ، وترك ما يقرب من 0.5 ملليلتر من المادة الطافية في الأنبوب ، ثم قم بتغليف الأنبوب. بعد إزالة المادة الطافية من جميع الأنابيب ، اغسل الأنسجة مرتين أخريين بنفس الطريقة. بعد غسل إزالة OCT الثلاثة ، استخدم طرف الماصة المختصر المحضر لإضافة 500 ميكرولتر من PBS المثلج البارد إلى الأنبوب.باستخدام نفس الطرف ، أعد تعليق الحبيبات برفق وانقل جميع الأنسجة المعاد تعليقها إلى أنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر ملصقة مسبقا ووزنها مسبقا. احتفظ بالأنبوب على الثلج حتى يتم نقل جميع عينات الأنسجة. قم بتكوير الأنسجة عن طريق طرد الأنابيب بالطرد المركزي في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا ، ثم استنشاق أكبر قدر ممكن من PBS بعناية دون إزعاج الحبيبات ووضع الأنابيب مرة أخرى على الجليد.باستخدام فتائل تجفيف الأنسجة المعدة مسبقا ، قم بإزالة أي محلول غسيل متبقي برفق ، ثم أغلق الأنبوب وضعه على الثلج. لوزن الأنابيب ، ضع أنبوبا واحدا في كل مرة في ميزان تحليلي تمت معايرته مؤخرا وصفر وأغلق باب الغرفة. بمجرد استقرار الوزن ، قم بتسجيله في جدول بيانات إلكتروني.بعد الوزن ، ضع الأنبوب مرة أخرى على الثلج وأضف 300 ميكرولتر من PBS البارد الجليد. باستخدام طرف ماصة مختصر ، انقل جميع الأنسجة بعناية إلى مليلتر من الميثانول البارد المثلج في أنبوب زجاجي لولبي مذكور مسبقا. قبل استخراج الدهون ، اسمح للأنسجة ومعايير قياس الطيف الكتلي الداخلية للدهون بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ، ثم دوامة وغمر المحاليل القياسية الداخلية في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية حتى تذوب معايير الدهون تماما.باستخدام ماصة متكررة ، أضف 250 بيكومول من معايير قياس الطيف الكتلي الداخلي لكل أنبوب وقم بتلخيص الأنابيب برفق. لتسهيل التجانس ، اضبط حجم الميثانول على ملليلتر ، ثم سحن الأنسجة باستخدام الخالط عن طريق تحريك طرف الخالط بحركة دائرية مضغوطة برفق على جدار الأنبوب. عندما لا تكون الكتل مرئية ، قم بتلخيص الأنبوب.اغمر الأنبوب بزاوية 45 درجة في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة 5 إلى 10 ثوان. ثم تحت غطاء الدخان ، أضف الكلوروفورم والميثانول إلى كل أنبوب لتحقيق نسبة الميثانول إلى الكلوروفورم إلى الماء من اثنين إلى واحد إلى 0.1. أغلق الأنابيب بإحكام واتركها على الطاولة حتى نهاية اليوم.قبل مغادرة ذلك المساء ، ضع الأنابيب المغطاة بإحكام في حمام مائي 48 درجة مئوية لحضانة ليلية. في اليوم التالي, بيليه أي مذيب وحطام قابل للذوبان عن طريق الطرد المركزي. ثم في غطاء الدخان ، قم بصب المادة الطافية بعناية في أنابيب اختبار زجاجية من البورسليكات 13 إلى 100 ملم مائلة بزاوية 30 إلى 45 درجة لتسهيل الصب.بعد صب المادة الطافية من جميع الأنابيب ، استخدم مكثف فراغ بأقصى تفريغ مع خطوة تسخين أولية مدتها ساعة واحدة عند 40 درجة مئوية لتبخير كل المذيبات ، ثم أضف 500 ميكرولتر من الميثانول إلى كل أنبوب. لإعادة تعليق مستخلصات الدهون المجففة ، دوامة الأنبوب لمدة 5 إلى 10 ثوان ، ثم اغمر الأنبوب في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية بزاوية 45 درجة مع الدوران لمدة دقيقتين. أعد دوامة الأنبوب لمدة خمس ثوان وأعد الانغماس في حمام الماء بالموجات فوق الصوتية لمدة دقيقة إضافية.قم بإزالة أي حطام غير قابل للذوبان عن طريق الطرد المركزي ، ثم صب المادة الطافية في قارورة حاقن ذاتي موسومة مسبقا مائلة بزاوية 30 إلى 45 درجة لتسهيل الصب. قم بتغطية القوارير بإحكام قبل تخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى التحليل. يؤكد تحليل مطياف الكتلة الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة بالتأين بالرش الكهربائي بعد إزالة OCT أن الأنواع المختلفة ذات طول السلسلة من السيراميد والسيراميد أحادي الهكسوسيل مرتفعة بشكل ملحوظ في أورام الورم الغدي الرئوي البشري مقارنة بالأنسجة الطبيعية المجاورة غير المعنية.تتلاشى معايير Sphingolipid بالتتابع بالترتيب التالي: d17: 1 سفينغوزين ، d17: 1 سفينغوسين -1-فوسفات ، C12 لاكتوسيل سيراميد ، C12 أحادي هكسوسيل سيراميد ، C12 سفينغوميلين ، وسيراميد C12. لكل نوع من أنواع sphingolipid هذه ، باستخدام إعدادات التدرج والأجهزة في النص ، هناك تحول إيجابي تقريبي 0.15 دقيقة في وقت الاحتفاظ لكل زيادة كربونية في طول السلسلة. ومع ذلك ، قد يكون للدهون ذات طول السلسلة الأطول مثل C24 و C26 تحولات زمنية أكبر للاحتفاظ.علاوة على ذلك ، غالبا ما تؤدي الرابطة المزدوجة في الأحماض الدهنية إلى تحول سلبي لمدة 0.15 دقيقة في وقت الاحتفاظ. وبالتالي ، سيكون للسيراميد C18: 1 وقت احتفاظ مشابه لسيراميد C16. بدلا من الاعتماد بشكل حصري تقريبا على الأنسجة التي تم جمعها حديثا ، يوسع هذا البروتوكول مصادر الأنسجة التي يمكن استخدامها لتحليل قياس الطيف الكتلي لتشمل تلك المخزنة بالتبريد في المستودعات الحيوية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

أربعة ألوان مضان المناعية من الخلايا السكانية الفرعية T- خلية في الأرشيفية الفورمالين ثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين الإنسان البلعوم الخلايا الحرشفية سرطان الخلايا العينات

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

تحديد التردد المثبط الأمثل للخلايا السرطانية باستخدام حقول علاج الورم (تفيلدس)

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

هلام ثنائي الأبعاد التفريد مقترنة بأساليب الطيف الكتلي لتحليل البروتين الأنسجة البشرية الورم الحميد الغدة النخامية

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

تخصيب فوسفوبيبتيدي مقترنة بكمية خالية من تسمية الطيف الكتلي للتحقيق في فوسفوبروتيومي في سرطان البروستاتا

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

تلطيخ مطاطي على الشرائح جزءا لا يتجزأ من البارافين من أنسجة سرطان المعدة pT3N0M0

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

التحليل الرقمي للتلطيخ المناعي للبروتين المتفاعل ZW10 في أنسجة الرئة البشرية

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

التقاط الاتصالات جزيء صغير بين الأنسجة والخلايا باستخدام التصوير الكتلي

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

استخراج الأيض المائي من خلايا ملتصقة مثقفه للتحليل الأيضي بواسطة الكهربائي الكهربي-الطيف الكتلي

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

اعداد الميتوكوندريا من انسجه سرطان المبيض والتحكم في انسجه المبيض للتحليل الكمي للبروبروتيميكس

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

تقييم موت الخلية باستخدام الخلايا الخالية من البروبيوتيك في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية القولون والمستقيم

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...