Name: preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis
Uploaded: 2021-04-27T15:00:00
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该研究项目的服务和支持由VCU Massey癌症中心组织和数据采集和分析核心以及VCU脂质组学和代谢组学核心提供，部分资金来自NIH-NCI癌症中心支持拨款P30CA016059。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R21CA232234（圣地亚哥利马）的支持。

根据内部审查委员会（IRB）批准的协议（#HM2471），从弗吉尼亚联邦大学（VCU）组织和数据采集和分析核心获得去识别的人肺组织。使用小鼠研究和收获小鼠组织得到了VCU机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 材料准备
注意：这些步骤应在纸巾清洗前一天进行。
<ol><li>对 1.5 mL 聚丙烯离心管进行预标记和称量，并为第二天处理的每个样品提供简?...

<ol>
	<li>Maceyka, M., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolites+in+inflammatory+disease.">Sphingolipid metabolites in inflammatory disease.</a> Nature. 510, 58-67 (2014).</li><li>Ogretmen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolism+in+cancer+signalling+and+therapy.">Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Hla, T., Dannenberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+signaling+in+metabolic+disorders.">Sphingolipid signaling in metabolic disorders.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).</li><li>Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+and+Sphingosine+Kinase+1+involvement+in+endocytic+membrane+Trafficking.">Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).</li><li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+is+required+for+BECN1-+and+ATG5-dependent+cell+death+induced+by+sphingosine+kinase+1+inhibition.">TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition.</a> Autophagy. , 1-50 (2018).</li><li>Young, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+Kinase+1+cooperates+with+autophagy+to+maintain+endocytic+membrane+trafficking.">Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking.</a> Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).</li><li>Young, M. M., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+as+regulators+of+autophagy+and+endocytic+trafficking.">Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking.</a> Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+endocytosis+and+sphingosine+kinase+1+recruitment.">Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment.</a> Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).</li><li>Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).</li><li>Rohrbach, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+sphingolipid+analysis+of+tissues+embedded+in+optimal+cutting+temperature+compound.">A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound.</a> Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).</li><li>Weston, L. A., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+LC-MS/MS+analysis+of+optimal+cutting+temperature+(OCT)+compound+removal+for+the+study+of+mammalian+proteomes.">Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes.</a> Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).</li><li>Holfeld, A., Vald&#233;s, A., Malmstr&#246;m, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+proteomic+workflow+for+mass+spectrometric+analysis+of+tissue+samples+preserved+by+different+methods.">Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).</li><li>Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteome+analysis+of+fresh+frozen+and+optimal+cutting+temperature+(OCT)+embedded+primary+non-small+cell+lung+carcinoma+by+LC-MS/MS.">Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS.</a> Methods. 81, 50-55 (2015).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+proteomics+using+chemical+immobilization+and+mass+spectrometry.">Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).</li></ol>

OCT是一种常见的长期冷冻保存剂，用于生物储存库。然而，当通过各种质谱平台12、13、14、15分析组织时，OCT会导致离子抑制，或者当通过LC-ESI-MS/MS11分析样品时，会导致信号丢失。冷冻保存组织中的OCT也会干扰组织标准化方法，例如称量和蛋白质定量测定，例如Bradford和BCA<sup class="x...

鞘脂是生物活性代谢物，以其在人体代谢和疾病中的作用而闻名1，2。它们调节复杂的细胞过程，如细胞迁移、细胞存活和死亡、细胞运动、囊泡运输、细胞侵袭和转移、血管生成以及细胞因子的产生1，2，3，4，5，6，7，8，9.鞘脂代谢调节的缺陷有助于癌症的发生和进展，决定癌症的侵袭性，以及癌症如何对治疗产生反应和耐药性3，10。因此，由于这些对疾病病因的广泛影响，能够精确确定疾病特异性鞘脂改变的分析方法是重要的工具。质谱（MS）是分析鞘脂改变的最准确和可靠的方法。
可用于分析鞘脂改变的人类标本可以从手术室前瞻性地获得，也可以从组织生物储存库中回顾性地获得。来自手术的新鲜组织是有利的，因为它们可以通过MS或其他分析方法直接分析。然而，前瞻性地获取组织存在行政、技术和后勤障碍，收集足够的标本以达到统计能力可能具有挑战性。从生物储存库获取组织是有利的，因为它们可以回顾性地大量获取，并且生物储存库确认组织学和病理学，使用标准操作程序低温保存和储存组织，并且可以提供可用于相关性分析的临床病理学数据。然而，为了保留分子和结构特征，生物储存库可以通过将组织嵌入最佳切割温度 （OCT） 化合物来冷冻保存组织，我们已经证明这会干扰数据归一化测定和通过液相色谱电喷雾串联质谱 （LC-ESI-MS/MS） 对鞘脂的定量11.还表明，聚乙烯醇和聚乙二醇（OCT化合物中的主要成分）在其他MS分析平台中导致离子抑制12，13，14，15。因此，在通过MS进行鞘脂组学分析之前，必须从组织中去除OCT化合物。
在之前的报告中，我们验证了从人类标本中去除OCT化合物的方案，用于LC-ESI-MS/MS分析11 ，以及用于称量组织以进行数据归一化的方法11。在这里，我们详细介绍了鞘脂组OCT化合物去除方案（sOCTrP）的步骤，并显示了来自人肺腺癌肿瘤和正常邻近未受累组织的代表性数据。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL polypropylene pipette tips</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to retrieve specimens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-116</td>
			<td>Used for tube and tissue weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Sciex Analyst 1.6.2</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software to analyze and integrate MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Scale that is accurate to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top dispenser</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-723071</td>
			<td>Used for dispensing solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2212</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#946;-glucosyl-sphing-4-eine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2511</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#223;-lactosyl-sphing-4-ene</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2512</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Sphingomyelin&#160; (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2312</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHLOROFORM OMNISOLV 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1054-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClickSeal Biocontainment Lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75007309</td>
			<td>To prevent biohazard aeresols during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conflikt</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>4101</td>
			<td>Decontaminant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTO-20A/20AC Column Oven</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine;&#160; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2000</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2144</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGU20A5R degasser</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes 13x100mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>13x100 mm screw top tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated water bath</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For overnight lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 150</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-167</td>
			<td>triturate tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-177</td>
			<td>for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>Laboratory grade tissue used to make wicks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS Grade 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0486-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexera LC-30 AD binary pump system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-502</td>
			<td>13x100 mm screw top tube caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>To retrieve specimens from tubes after washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4987000118</td>
			<td>To dispense LC-MS internal standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89239-020</td>
			<td>Autoinjector vial caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Thread Glass Vials with ID Patch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46610-724</td>
			<td>Autoinjector vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIL-30AC autoinjector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD2030P1220</td>
			<td>For drying solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53822-U</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-ESI-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model 2800</td>
			<td>for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For sOCTrP and resuspending dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729572</td>
			<td>13x100 glass culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Hipersolve Chromanorm LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis

鞘脂是在人体新陈代谢和疾病中具有明确作用的细胞成分。质谱可用于确定鞘脂在疾病中是否改变，并研究鞘脂是否可以在临床上靶向。然而，直接从手术室获取组织的适当把握度的前瞻性研究可能非常耗时，并且在技术、后勤和行政上具有挑战性。相比之下，回顾性研究可以利用组织生物储存库中已经存在的冷冻保存的人类标本，通常数量很大。从生物储存库采购组织的其他优点包括访问与组织标本相关的信息，包括组织学、病理学以及在某些情况下的临床病理学变量，所有这些都可用于检查与脂质组学数据的相关性。然而，与冷冻保存和质谱中使用的最佳切割温度化合物（OCT）不相容相关的技术限制是脂质分析的技术障碍。然而，我们之前已经证明，OCT可以通过洗涤和离心的循环轻松地从人类生物储存库标本中去除，而不会改变其鞘脂含量。我们之前还确定，在OCT中冷冻保存的人体组织中的鞘脂可以稳定长达16年。在本报告中，我们概述了分析嵌入OCT的人组织标本中鞘脂的步骤和工作流程，包括洗涤组织，称量组织以进行数据归一化，脂质提取，制备用于液相色谱电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS / MS）分析的样品，质谱数据集成，数据归一化和数据分析。

在该协议中，我们详细描述了一种从冷冻保存的人体组织中去除OCT的方法，并称量组织以进行LC-ESI-MS / MS分析。此程序所需的材料列在 材料表中。 图1 所示是一个典型实验的结果，其中洗涤10个人肺腺癌肿瘤和10个正常邻近组织以去除OCT，并通过LC-ESI-MS / MS进行分析。 重要的是，正如我们之前显示的11所示，与正常的相邻未受累组织相比，肺腺?...

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Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

鞘脂是生物活性代谢物，在人类疾病中具有公认的作用。用质谱法表征组织改变可以揭示疾病病因学中的作用或确定治疗靶点。然而，用于生物储存库中冷冻保存的OCT化合物会干扰质谱分析。我们概述了使用LC-ESI-MS / MS分析嵌入OCT的人体组织中鞘脂的方法。

用于质谱分析的最佳切割温度化合物中嵌入的人组织制备

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

OCT是一种冷冻保存剂，与质谱分析不相容。使用该协议，研究人员可以从组织中去除OCT，并使用串联液相色谱质谱法定量鞘脂。组织干燥灯芯的制备，组织清洗和组织称重将由弗吉尼亚联邦大学的April Boyd演示，脂质提取将由弗吉尼亚联邦代谢组学和脂质组学核心主任Jeremy Allegood博士演示。首先，将手术剪刀浸入甲醇中五分钟，然后用干净的实验室级纸巾擦拭，以清洁手术剪刀。使用无粉手套，旋转实验室级纸巾的末端，形成 30 至 40 毫米长的细锥形灯芯。然后使用甲醇清洁的剪刀，在厚端剪下灯芯并将其放入干净的纸板箱中。接下来，使用甲醇清洁的剪刀，从一毫升移液器吸头的尖端切下四到五毫米，然后将吸头放回吸头支架中。为了洗去组织中的OCT，向每个装有人肺组织的管中加入10毫升冰冷的超纯去离子水，并盖紧它们。让试管孵育 10 分钟。剧烈涡旋每个管，直到沉积在管壁或组织沉淀上的所有组织完全重悬。然后将试管在预冷的摆动桶离心机中以4， 000至5， 000倍G离心10分钟，温度为4摄氏度。离心完成后，在冰上打开试管的盖子。小心地吸出洗涤溶液，在管中留下约0.5毫升的上清液，然后重新盖上管。从所有管中取出上清液后，以相同的方式再洗涤组织两次。在三次OCT去除洗涤后，使用准备好的缩短移液器吸头向管中加入500微升冰冷的PBS。使用相同的尖端，轻轻重悬沉淀，并将所有重悬的组织转移到预先标记并预先称重的1.5毫升离心管中。将试管放在冰上，直到转移所有组织样本。通过在预冷离心机中离心管来沉淀组织，然后在不干扰沉淀的情况下小心地吸出尽可能多的PBS，并将管放回冰上。使用之前准备好的纸巾干燥芯，轻轻除去任何剩余的洗涤溶液，然后关闭试管并将其放在冰上。要称量试管，请将一个试管一次放入最近校准的去皮和归零分析天平中，然后关闭腔室门。体重稳定后，将其记录在电子电子表格中。称重后，将试管放回冰上，加入 300 微升冰冷的 PBS。使用缩短的移液器吸头，小心地将所有组织转移到预先标记的螺旋盖玻璃管中的两毫升冰冷甲醇中。在脂质提取之前，让组织和质谱内部脂质标准品平衡至室温20分钟，然后涡旋并将内标溶液浸入超声水浴中，直到脂质标准品完全溶解。使用重复移液器，向每个试管中加入250皮摩尔的内部质谱标准品，并轻轻盖上试管。为了便于均质化，将甲醇的体积调节至两毫升，然后使用均质器通过以圆周运动移动均质器尖端轻轻压在管壁上来研磨组织。当团块不再可见时，重新盖上试管。将管子以 45 度角浸入超声波水浴中 5 到 10 秒。然后在通风橱下，向每个试管中加入氯仿和甲醇，使甲醇与氯仿与水的比例为二比一至0.1。将试管密封紧，并将它们放在工作台上，直到一天结束。在当晚离开之前，将密盖的试管放入48摄氏度的水浴中孵育过夜。第二天，通过离心沉淀任何溶剂和可溶性碎片。然后在通风橱中，小心地将上清液倒入预先标记的13中，放入100毫米硼硅酸盐玻璃试管中，以30至45度角倾斜以方便倾析。从所有试管中倾析上清液后，使用最大真空的真空浓缩器，在40摄氏度下进行初始一小时的加热步骤以蒸发所有溶剂，然后向每个试管中加入500微升甲醇。要重悬干燥的脂质提取物，请涡旋管5至10秒，然后将试管以45度角旋转浸入超声波水浴中两分钟。重新涡旋管子五秒钟，然后重新浸入超声波水浴中一分钟。通过离心除去任何不溶性碎屑，然后将上清液倒入预先标记的自动进样器小瓶中，倾斜30至45度角，以方便倾析。在将小瓶储存在零下80摄氏度直至分析之前，请盖紧小瓶。去除OCT后的液相色谱电喷雾串联质谱分析证实，与正常的相邻未受累组织相比，人肺腺癌肿瘤中各种链长的神经酰胺和单己糖神经酰胺显着升高。鞘脂标准品按以下顺序依次洗脱：d17：1 鞘氨醇、d17：1 鞘氨醇-1-磷酸、C12 乳糖神经酰胺、C12 单己糖基神经酰胺、C12 鞘磷脂和 C12 神经酰胺。对于这些鞘脂种类中的每一种，使用文本中的梯度和仪器设置，链长每增加两次碳，保留时间就会发生大约正 0.15 分钟的偏移。然而，较长的链长脂质（如C24和C26）可能具有较大的保留时间偏移。此外，脂肪酸中的双键通常会导致保留时间发生负0.15分钟的偏移。因此，C18：1神经酰胺的保留时间与C16神经酰胺相似。该协议不是几乎完全依赖于新鲜收集的组织，而是扩展了可用于质谱分析的组织来源，以包括那些低温存储在生物储存库中的组织来源。

Research

JoVE Journal

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