Name: preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis
Uploaded: 2021-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Tjenester og støtte til forskningsprojektet blev leveret af VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core og VCU Lipidomics and Metabolomics Core, som delvist støttes med finansiering fra NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago Lima).

Afidentificerede humane lungevæv blev opnået fra Virginia Commonwealth University (VCU) Tissue and Data Acquisition and Analysis Core under en intern review board (IRB) godkendt protokol (#HM2471). Brugen af mus til forskning og høst af musevæv blev godkendt af VCU institutionelle dyrepleje- og brugsudvalg (IACUC).
1. Forberedelse af materialer
BEMÆRK: Disse trin skal udføres en dag før vævsvask.
<ol><li>Foretiketter og vejer 1,5 ml polypropylencentrifuger...

<ol>
	<li>Maceyka, M., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolites+in+inflammatory+disease.">Sphingolipid metabolites in inflammatory disease.</a> Nature. 510, 58-67 (2014).</li><li>Ogretmen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolism+in+cancer+signalling+and+therapy.">Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Hla, T., Dannenberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+signaling+in+metabolic+disorders.">Sphingolipid signaling in metabolic disorders.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).</li><li>Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+and+Sphingosine+Kinase+1+involvement+in+endocytic+membrane+Trafficking.">Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).</li><li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+is+required+for+BECN1-+and+ATG5-dependent+cell+death+induced+by+sphingosine+kinase+1+inhibition.">TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition.</a> Autophagy. , 1-50 (2018).</li><li>Young, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+Kinase+1+cooperates+with+autophagy+to+maintain+endocytic+membrane+trafficking.">Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking.</a> Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).</li><li>Young, M. M., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+as+regulators+of+autophagy+and+endocytic+trafficking.">Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking.</a> Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+endocytosis+and+sphingosine+kinase+1+recruitment.">Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment.</a> Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).</li><li>Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).</li><li>Rohrbach, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+sphingolipid+analysis+of+tissues+embedded+in+optimal+cutting+temperature+compound.">A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound.</a> Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).</li><li>Weston, L. A., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+LC-MS/MS+analysis+of+optimal+cutting+temperature+(OCT)+compound+removal+for+the+study+of+mammalian+proteomes.">Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes.</a> Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).</li><li>Holfeld, A., Vald&#233;s, A., Malmstr&#246;m, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+proteomic+workflow+for+mass+spectrometric+analysis+of+tissue+samples+preserved+by+different+methods.">Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).</li><li>Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteome+analysis+of+fresh+frozen+and+optimal+cutting+temperature+(OCT)+embedded+primary+non-small+cell+lung+carcinoma+by+LC-MS/MS.">Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS.</a> Methods. 81, 50-55 (2015).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+proteomics+using+chemical+immobilization+and+mass+spectrometry.">Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).</li></ol>

OCT er et almindeligt langsigtet kryokonserveringsmiddel, der anvendes i biorepositorier. OCT kan dog resultere i ionundertrykkelse, når væv analyseres af forskellige massespektrometriplatforme12,13,14,15, eller resultere i tab af signal, når prøver analyseres af LC-ESI-MS / MS 11. OCT i kryopræserveret væv kan også forstyrre vævsnormaliseringsmetoder såsom vejn...

Sphingolipider er bioaktive metabolitter kendt for deres roller i human metabolisme og sygdom 1,2. De regulerer komplekse cellulære processer såsom cellemigration, celleoverlevelse og død, cellebevægelse, vesikulær handel, cellulær invasion og metastase, angiogenese og produktion af cytokiner 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defekter i reguleringen af sphingolipidmetabolisme bidrager til initiering og progression af kræftformer, bestemmer, hvor aggressive kræftformer er, og hvordan kræft reagerer på og udvikler resistens over for terapi 3,10. På grund af disse brede indvirkninger på sygdommens ætiologi er analysemetoder, der præcist kan etablere sygdomsspecifikke sphingolipidændringer, derfor vigtige værktøjer. Massespektrometri (MS) er den mest nøjagtige og pålidelige metode til at analysere sphingolipidændringer.
Humane prøver, der kan bruges til analyse af sphingolipidændringer, kan opnås prospektivt fra den kirurgiske suite eller retrospektivt fra vævsbiorepositorier. Friske væv fra kirurgi er fordelagtige, fordi de kan analyseres direkte ved MS eller andre analysemetoder. Imidlertid har erhvervelse af væv fremadrettet administrative, tekniske og logistiske forhindringer, og det kan være udfordrende at indsamle tilstrækkelige prøver til at nå statistisk magt. At få væv fra biorepositorier er fordelagtigt, fordi de kan erhverves retrospektivt i stort antal, og biorepositorier bekræfter histologi og patologi, bruger standardprocedurer til kryogent at bevare og opbevare væv og kan levere klinikopatologiske data, der kan bruges til korrelationsanalyser. For at bevare molekylære og strukturelle træk kan biorepositorier imidlertid kryopræservere væv ved at indlejre dem i optimal skæretemperatur (OCT) forbindelse, som vi har vist interfererer med datanormaliseringsassays og kvantificering af sphingolipider ved væskekromatografi elektrosprayionisering tandem massespektrometri (LC-ESI-MS / MS)11 . Det har også vist sig, at polyvinylalkohol og polyethylenglycol, de primære komponenter i OCT-forbindelse, resulterer i ionundertrykkelse i andre MS-analyseplatforme12,13,14,15. Derfor skal OCT-forbindelsen fjernes fra væv inden sphingolipidomisk analyse af MS.
I en tidligere rapport har vi valideret en protokol til fjernelse af OCT-forbindelse fra humane prøver til LC-ESI-MS / MS-analyse 11 og den metode, der anvendes til vejning af væv til datanormalisering11. Her beskriver vi trinene i den sphingolipidomiske OCT-forbindelsesfjernelsesprotokol (sOCTrP) og viser repræsentative data fra humane lungeadenocarcinomtumorer og normale tilstødende ikke-involverede væv.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL polypropylene pipette tips</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to retrieve specimens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-116</td>
			<td>Used for tube and tissue weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Sciex Analyst 1.6.2</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software to analyze and integrate MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Scale that is accurate to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top dispenser</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-723071</td>
			<td>Used for dispensing solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2212</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#946;-glucosyl-sphing-4-eine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2511</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#223;-lactosyl-sphing-4-ene</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2512</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Sphingomyelin&#160; (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2312</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHLOROFORM OMNISOLV 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1054-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClickSeal Biocontainment Lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75007309</td>
			<td>To prevent biohazard aeresols during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conflikt</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>4101</td>
			<td>Decontaminant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTO-20A/20AC Column Oven</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine;&#160; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2000</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2144</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGU20A5R degasser</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes 13x100mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>13x100 mm screw top tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated water bath</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For overnight lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 150</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-167</td>
			<td>triturate tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-177</td>
			<td>for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>Laboratory grade tissue used to make wicks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS Grade 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0486-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexera LC-30 AD binary pump system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-502</td>
			<td>13x100 mm screw top tube caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>To retrieve specimens from tubes after washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4987000118</td>
			<td>To dispense LC-MS internal standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89239-020</td>
			<td>Autoinjector vial caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Thread Glass Vials with ID Patch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46610-724</td>
			<td>Autoinjector vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIL-30AC autoinjector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD2030P1220</td>
			<td>For drying solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53822-U</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-ESI-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model 2800</td>
			<td>for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For sOCTrP and resuspending dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729572</td>
			<td>13x100 glass culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Hipersolve Chromanorm LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis

Sphingolipider er cellulære komponenter, der har veletablerede roller i menneskelig metabolisme og sygdom. Massespektrometri kan bruges til at bestemme, om sphingolipider ændres i en sygdom og undersøge, om sphingolipider kan målrettes klinisk. Imidlertid kan korrekt drevne prospektive undersøgelser, der erhverver væv direkte fra den kirurgiske suite, være tidskrævende og teknisk, logistisk og administrativt udfordrende. I modsætning hertil kan retrospektive undersøgelser drage fordel af kryopræserverede humane prøver, der allerede er tilgængelige, normalt i stort antal, ved vævsbiorepositorier. Andre fordele ved at skaffe væv fra biorepositorier omfatter adgang til information forbundet med vævsprøverne, herunder histologi, patologi og i nogle tilfælde klinikopatologiske variabler, som alle kan bruges til at undersøge korrelationer med lipidomics-data. Imidlertid er tekniske begrænsninger relateret til inkompatibiliteten af optimal skæretemperaturforbindelse (OCT), der anvendes i kryopræservering og massespektrometri, en teknisk barriere til analyse af lipider. Vi har dog tidligere vist, at OCT let kan fjernes fra humane biorepositoriprøver gennem cyklusser med vask og centrifugering uden at ændre deres sphingolipidindhold. Vi har også tidligere fastslået, at sphingolipider i humant væv kryopræserveret i OCT er stabile i op til 16 år. I denne rapport skitserer vi trinene og arbejdsgangen til analyse af sphingolipider i humane vævsprøver, der er indlejret i OCT, herunder vaskevæv, vejning af væv til datanormalisering, ekstraktion af lipider, forberedelse af prøver til analyse ved væskekromatografi elektrosprayionisering tandem massespektrometri (LC-ESI-MS / MS), massespektrometridataintegration, datanormalisering og dataanalyse.

I denne protokol beskriver vi detaljeret en metode til at fjerne OCT fra kryokonserverede humane væv og veje vævene til analyse af LC-ESI-MS / MS. De materialer, der kræves til denne procedure, er angivet i Materialefortegnelse. Vist i figur 1 er resultaterne af et typisk eksperiment, hvor 10 humane lungeadenocarcinomtumorer og 10 normale tilstødende væv blev vasket for at fjerne OCT og analyseret af LC-ESI-MS / MS. Det er vigtigt, som vi tidligere har vist11, at der er forsk...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Sphingolipider er bioaktive metabolitter med veletablerede roller i menneskelig sygdom. Karakterisering af ændringer i væv med massespektrometri kan afsløre roller i sygdomsætiologi eller identificere terapeutiske mål. OCT-forbindelsen, der anvendes til kryopræservering i biorepositorier, interfererer imidlertid med massespektrometri. Vi skitserer metoder til at analysere sphingolipider i humant væv indlejret i OCT med LC-ESI-MS / MS.

Fremstilling af humant væv indlejret i optimal skæretemperaturforbindelse til massespektrometrianalyse

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

OCT er et kryokonserveringsmiddel, der er uforeneligt med massespektrometrianalyse. Ved hjælp af denne protokol kan forskere fjerne OCT fra væv og kvantificere sphingolipider med tandem væskekromatografi massespektrometri. Forberedelsen af vævstørringsvæger, vævsvask og vævsvejning vil blive demonstreret af April Boyd fra Virginia Commonwealth University, og lipidekstraktionen vil blive demonstreret af Dr.Jeremy Allegood, direktør for Virginia Commonwealth Metabolomics and Lipidomics Core.Til at begynde med skal du rengøre kirurgisk saks ved at nedsænke dem i methanol i fem minutter efterfulgt af at tørre dem af med et rent laboratoriekvalitetsvæv. Brug pulverfrie handsker til at dreje enden af et væv af laboratoriekvalitet for at skabe en fint tilspidset 30 til 40 millimeter lang væge. Brug derefter den methanolrensede saks, skær vægen i den tykke ende og læg den i en ren papkasse.Brug derefter den methanolrensede saks til at skære fire til fem millimeter af spidsen af en en milliliter pipettespids og placere spidsen tilbage i tipholderen. For at vaske OCT væk fra vævene tilsættes 10 ml iskoldt ultrarent deioniseret vand til hvert rør, der indeholder humant lungevæv, og hætte dem tæt. Lad rørene inkubere i 10 minutter.Virtex kraftigt hvert rør, indtil alt væv, der er deponeret på rørets vægge eller vævspilleren, er fuldstændigt resuspenderet. Centrifuger derefter rørene i en forkølet svingende spandcentrifuge ved 4.000 til 5.000 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Når centrifugeringen er færdig, skal du lukke rørene på is.Opsug forsigtigt vaskeopløsningen, og efterlad ca. 0,5 ml supernatant i røret, og opsæt derefter røret igen. Når du har fjernet supernatanten fra alle rør, skal du vaske vævene to gange mere på samme måde. Efter de tre OCT-fjernelsesvaske skal du bruge den forberedte forkortede pipettespids til at tilføje 500 mikroliter iskold PBS til røret.Brug den samme spids til forsigtigt at suspendere pelleten og overføre alt det resuspenderede væv til et formærket og forvejet 1,5 ml centrifugerør. Hold røret på is, indtil alle vævsprøver er overført. Pellet vævene ved at centrifugere rørene i en forkølet centrifuge, opsug derefter forsigtigt så meget af PBS som muligt uden at forstyrre pelleten, og læg rørene tilbage på is.Brug vævstørringsvægerne, der er fremstillet tidligere, fjern forsigtigt enhver resterende vaskeopløsning, luk derefter røret og læg det på is. For at veje rørene skal du placere et rør ad gangen i en nyligt kalibreret tared og nulstillet analytisk vægt og lukke kammerdøren. Når vægten er stabiliseret, skal du registrere den i et elektronisk regneark.Efter vejning skal du placere røret tilbage på is og tilføje 300 mikroliter iskold PBS. Ved hjælp af en forkortet pipettespids overføres forsigtigt alt væv til to milliliter iskold methanol i et præmærket skrueglasrør. Før lipidekstraktion skal du lade væv og massespektrometri interne lipidstandarder ækvilibrere til stuetemperatur i 20 minutter, derefter hvirvel og nedsænke de interne standardopløsninger i et ultralydvandbad, indtil lipidstandarderne er helt opløst.Brug en gentagende pipette til at tilføje 250 picomoler af de interne massespektrometristandarder til hvert rør og let opsummere rørene. For at lette homogeniseringen skal du justere volumenet af methanol til to milliliter og derefter triturere vævet ved hjælp af en homogenisator ved at flytte homogenisatorspidsen i en cirkulær bevægelse, der forsigtigt presses mod rørvæggen. Når klumper ikke længere er synlige, skal du dække røret igen.Nedsænk røret i en 45 graders vinkel i et ultralydsvandbad i 5 til 10 sekunder. Derefter tilsættes chloroform og methanol under en røghætte til hvert rør for at opnå et methanol til chloroform til vandforhold på to til en til 0,1. Forsegl rørene tæt og lad dem stå på bordpladen indtil slutningen af dagen.Før du forlader den aften, skal du placere de tætlukkede rør i et 48 grader Celsius vandbad til en inkubation natten over. Den følgende dag pelleteres ethvert opløsningsmiddel og opløseligt affald ved centrifugering. Derefter dekanteres supernatanten forsigtigt i formærkede 13 til 100 millimeter borosilikatglasreagensglasrør i en vinkel på 30 til 45 grader for at lette dekanteringen.Efter dekantering af supernatanten fra alle rør skal du bruge en vakuumkoncentrator ved maksimalt vakuum med et indledende en times opvarmningstrin ved 40 grader Celsius for at fordampe alt opløsningsmiddel, og tilsæt derefter 500 mikroliter methanol til hvert rør. For at resuspendere de tørrede lipidekstrakter, hvirvel røret i 5 til 10 sekunder, og nedsænk derefter røret i et ultralydvandbad i en 45 graders vinkel med rotation i to minutter. Hvirvl røret i fem sekunder og nedsænk igen i ultralydsvandbadet i yderligere et minut.Fjern eventuelt uopløseligt affald ved centrifugering, og dekantér derefter supernatanten til et formærket autoinjektorhætteglas vippet i en vinkel på 30 til 45 grader for at lette dekanteringen. Dæk hætteglassene tæt, inden de opbevares ved minus 80 grader Celsius indtil analyse. Væskekromatografi elektrosprayionisering tandem massespektrometrianalyse efter OCT-fjernelse bekræfter, at forskellige kædelængdearter af ceramider og monohexosyl-ceramider er signifikant forhøjet i humane lungeadenocarcinomtumorer sammenlignet med normale tilstødende ikke-involverede væv.Sphingolipidstandarder eluterer sekventielt i følgende rækkefølge:d17:1 sphingosin, d17:1 sphingosin-1-phosphat, C12 lactosyl-ceramid, C12 monohexosyl-ceramid, C12 sphingomyelin og C12 ceramid. For hver af disse sphingolipidarter er der ved hjælp af gradient- og instrumenteringsindstillingerne i teksten et omtrentligt positivt skift på 0,15 minutter i retentionstiden for hver to kulstofforøgelse i kædelængde. Imidlertid kan længere kædelængdelipider som C24 og C26 have større tilbageholdelsestidsskift.Desuden resulterer en dobbeltbinding i fedtsyren ofte i et negativt skift på 0,15 minutter i retentionstid. Således vil C18: 1 ceramid have en retentionstid svarende til C16 ceramid. I stedet for næsten udelukkende at stole på frisk opsamlet væv, udvider denne protokol de vævskilder, der kan bruges til massespektrometrianalyse til at omfatte dem, der kryogent opbevares i biorepositorier.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Four-Color Fluorescence Immunohistochemistry af T-Cell Subpopulations i Archival Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

Bestemmelse af den optimale Inhibitorisk Frequency for kræftceller Brug Tumor Behandling Fields (TTFields)

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

To-dimensionelle gelelektroforese kombineret med massespektrometri metoder til analyse af menneskelige hypofyseadenom væv proteom

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide berigelse kombineret med etiket-fri kvantitativ massespektrometri til at undersøge Phosphoproteome i Prostata Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastisk farvning på paraffin-indlejrede slides af pT3N0M0 gastrisk Cancer væv

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Digital analyse af immun farvning af ZW10 interagerende protein i humant lunge væv

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Indfange små molekyle kommunikation mellem væv og celler ved hjælp af Imaging massespektrometri

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Ekstraktion af vandige metabolitter fra kultiverede Vedklædende celler til Metabolomic analyse af kapillar elektroforese-massespektrometri

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Fremstilling af mitokondrier fra æggestokkene Cancer væv og kontrol ovarie væv til kvantitativ proteomics analyse

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering cell død ved hjælp af cellefri supernatant af probiotika i tre-dimensionelle sfæroid kulturer colorectal cancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...