Name: preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis
Uploaded: 2021-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Diensten en ondersteuning van het onderzoeksproject werden geleverd door de VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core en de VCU Lipidomics en Metabolomics Core, die gedeeltelijk worden ondersteund door financiering van NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago Lima).

Gedeïdentificeerde menselijke longweefsels werden verkregen van de Virginia Commonwealth University (VCU) Tissue and Data Acquisition and Analysis Core onder een door de Internal Review Board (IRB) goedgekeurd protocol (#HM2471). Het gebruik van muizen voor onderzoek en het oogsten van muizenweefsels is goedgekeurd door de VCU institutional animal care and use committee (IACUC).
1. Voorbereiding van materialen
OPMERKING: Deze stappen moeten een dag voorafgaand aan he...

<ol>
	<li>Maceyka, M., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolites+in+inflammatory+disease.">Sphingolipid metabolites in inflammatory disease.</a> Nature. 510, 58-67 (2014).</li><li>Ogretmen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolism+in+cancer+signalling+and+therapy.">Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Hla, T., Dannenberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+signaling+in+metabolic+disorders.">Sphingolipid signaling in metabolic disorders.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).</li><li>Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+and+Sphingosine+Kinase+1+involvement+in+endocytic+membrane+Trafficking.">Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).</li><li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+is+required+for+BECN1-+and+ATG5-dependent+cell+death+induced+by+sphingosine+kinase+1+inhibition.">TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition.</a> Autophagy. , 1-50 (2018).</li><li>Young, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+Kinase+1+cooperates+with+autophagy+to+maintain+endocytic+membrane+trafficking.">Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking.</a> Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).</li><li>Young, M. M., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+as+regulators+of+autophagy+and+endocytic+trafficking.">Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking.</a> Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+endocytosis+and+sphingosine+kinase+1+recruitment.">Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment.</a> Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).</li><li>Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).</li><li>Rohrbach, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+sphingolipid+analysis+of+tissues+embedded+in+optimal+cutting+temperature+compound.">A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound.</a> Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).</li><li>Weston, L. A., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+LC-MS/MS+analysis+of+optimal+cutting+temperature+(OCT)+compound+removal+for+the+study+of+mammalian+proteomes.">Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes.</a> Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).</li><li>Holfeld, A., Vald&#233;s, A., Malmstr&#246;m, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+proteomic+workflow+for+mass+spectrometric+analysis+of+tissue+samples+preserved+by+different+methods.">Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).</li><li>Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteome+analysis+of+fresh+frozen+and+optimal+cutting+temperature+(OCT)+embedded+primary+non-small+cell+lung+carcinoma+by+LC-MS/MS.">Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS.</a> Methods. 81, 50-55 (2015).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+proteomics+using+chemical+immobilization+and+mass+spectrometry.">Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).</li></ol>

OCT is een veel voorkomend cryoconserveringsmiddel op lange termijn dat wordt gebruikt in biorepositories. OCT kan echter resulteren in ionenonderdrukking wanneer weefsels worden geanalyseerd door verschillende massaspectrometrieplatforms 12,13,14,15, of resulteren in signaalverlies wanneer monsters worden geanalyseerd door LC-ESI-MS / MS 11. OCT in gecryopreserveerde we...

Sfingolipiden zijn bioactieve metabolieten die bekend staan om hun rol in het menselijk metabolisme en ziekte 1,2. Ze reguleren complexe cellulaire processen zoals celmigratie, celoverleving en -dood, celbeweging, vesiculaire handel, cellulaire invasie en metastase, angiogenese en de productie van cytokines 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defecten in de regulatie van het sfingolipidemetabolisme dragen bij aan de initiatie en progressie van kankers, bepalen hoe agressief kankers zijn en hoe kankers reageren op en resistentie ontwikkelen tegen therapie 3,10. Daarom zijn, vanwege deze brede effecten op de etiologie van ziekten, analytische methoden die ziektespecifieke sfingolipideveranderingen nauwkeurig kunnen vaststellen, belangrijke hulpmiddelen. Massaspectrometrie (MS) is de meest nauwkeurige en betrouwbare methode om sfingolipideveranderingen te analyseren.
Menselijke specimens die kunnen worden gebruikt voor de analyse van sfingolipideveranderingen kunnen prospectief worden verkregen uit de chirurgische suite of retrospectief uit weefselbiorepositories. Verse weefsels van een operatie zijn voordelig omdat ze direct kunnen worden geanalyseerd door MS of andere analytische methoden. Het prospectief verkrijgen van weefsels heeft echter administratieve, technische en logistieke hindernissen en het verzamelen van voldoende exemplaren om statistische kracht te bereiken, kan een uitdaging zijn. Het verkrijgen van weefsels uit biorepositories is voordelig omdat ze retrospectief kunnen worden verkregen, in grote aantallen, en biorepositories bevestigen histologie en pathologie, standaard operationele procedures gebruiken om weefsels cryogenisch te bewaren en op te slaan, en kunnen clinicopathologische gegevens opleveren die kunnen worden gebruikt voor correlatieanalyses. Om moleculaire en structurele kenmerken te behouden, kunnen biorepositories echter weefsels cryopreserveren door ze in te bedden in een optimale snijtemperatuurverbinding (OCT), waarvan we hebben aangetoond dat het interfereert met gegevensnormalisatietests en de kwantificering van sfingolipiden door vloeistofchromatografie elektrospray ionisatie tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS / MS)11 . Het is ook aangetoond dat polyvinylalcohol en polyethyleenglycol, de primaire componenten in OCT-verbinding, resulteren in ionenonderdrukking in andere MS-analyseplatforms 12,13,14,15. Daarom moet de OCT-verbinding uit weefsels worden verwijderd voorafgaand aan sfingolipidomische analyse door MS.
In een eerder rapport hebben we een protocol gevalideerd voor de verwijdering van OCT-verbindingen uit menselijke specimens voor LC-ESI-MS / MS-analyse11 en de methodologie die wordt gebruikt voor het wegen van weefsels voor gegevensnormalisatie11. Hier beschrijven we de stappen van het sfingolipidomic OCT compound-removal protocol (sOCTrP) en tonen we representatieve gegevens van menselijke longadenocarcinoomtumoren en normale aangrenzende niet-betrokken weefsels.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL polypropylene pipette tips</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to retrieve specimens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-116</td>
			<td>Used for tube and tissue weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Sciex Analyst 1.6.2</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software to analyze and integrate MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Scale that is accurate to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top dispenser</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-723071</td>
			<td>Used for dispensing solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2212</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#946;-glucosyl-sphing-4-eine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2511</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#223;-lactosyl-sphing-4-ene</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2512</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Sphingomyelin&#160; (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2312</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHLOROFORM OMNISOLV 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1054-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClickSeal Biocontainment Lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75007309</td>
			<td>To prevent biohazard aeresols during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conflikt</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>4101</td>
			<td>Decontaminant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTO-20A/20AC Column Oven</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine;&#160; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2000</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2144</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGU20A5R degasser</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes 13x100mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>13x100 mm screw top tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated water bath</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For overnight lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 150</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-167</td>
			<td>triturate tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-177</td>
			<td>for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>Laboratory grade tissue used to make wicks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS Grade 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0486-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexera LC-30 AD binary pump system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-502</td>
			<td>13x100 mm screw top tube caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>To retrieve specimens from tubes after washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4987000118</td>
			<td>To dispense LC-MS internal standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89239-020</td>
			<td>Autoinjector vial caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Thread Glass Vials with ID Patch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46610-724</td>
			<td>Autoinjector vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIL-30AC autoinjector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD2030P1220</td>
			<td>For drying solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53822-U</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-ESI-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model 2800</td>
			<td>for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For sOCTrP and resuspending dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729572</td>
			<td>13x100 glass culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Hipersolve Chromanorm LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis

Sfingolipiden zijn cellulaire componenten die een gevestigde rol spelen in het menselijk metabolisme en ziekte. Massaspectrometrie kan worden gebruikt om te bepalen of sfingolipiden zijn veranderd in een ziekte en om te onderzoeken of sfingolipiden klinisch kunnen worden gericht. Goed aangedreven prospectieve studies die weefsels rechtstreeks uit de chirurgische suite verkrijgen, kunnen echter tijdrovend en technisch, logistiek en administratief uitdagend zijn. Retrospectieve studies kunnen daarentegen profiteren van gecryopreserveerde menselijke monsters die al beschikbaar zijn, meestal in grote aantallen, bij weefselbiorepositories. Andere voordelen van het verkrijgen van weefsels uit biorepositories zijn toegang tot informatie die verband houdt met de weefselmonsters, waaronder histologie, pathologie en in sommige gevallen clinicopathologische variabelen, die allemaal kunnen worden gebruikt om correlaties met lipidomics-gegevens te onderzoeken. Technische beperkingen met betrekking tot de incompatibiliteit van optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) die wordt gebruikt in de cryopreservatie en massaspectrometrie is echter een technische barrière voor de analyse van lipiden. We hebben echter eerder aangetoond dat OCT gemakkelijk kan worden verwijderd uit menselijke biorepository specimens door cycli van wasbeurten en centrifugatie zonder hun sfingolipidegehalte te veranderen. We hebben ook eerder vastgesteld dat sfingolipiden in menselijke weefsels die in OCT zijn gecryopreserveerd, tot 16 jaar stabiel zijn. In dit rapport schetsen we de stappen en workflow voor het analyseren van sfingolipiden in menselijke weefselmonsters die zijn ingebed in OCT, waaronder het wassen van weefsels, het wegen van weefsels voor gegevensnormalisatie, de extractie van lipiden, voorbereiding van monsters voor analyse door vloeistofchromatografie elektrospray ionisatie tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS / MS), massaspectrometrie data-integratie, gegevensnormalisatie en gegevensanalyse.

In dit protocol beschrijven we in detail een methode om OCT uit cryo-geconserveerde menselijke weefsels te verwijderen en de weefsels te wegen voor analyse door LC-ESI-MS / MS. De materialen die nodig zijn voor deze procedure zijn opgenomen in de materiaaltabel. Getoond in figuur 1 zijn resultaten van een typisch experiment waarbij 10 menselijke longadenocarcinoomtumoren en 10 normale aangrenzende weefsels werden gewassen om OCT te verwijderen en geanalyseerd door LC-ESI-MS ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Sfingolipiden zijn bioactieve metabolieten met gevestigde rollen bij menselijke ziekten. Het karakteriseren van veranderingen in weefsels met massaspectrometrie kan rollen in de ziekte-etiologie onthullen of therapeutische doelen identificeren. De OCT-verbinding die wordt gebruikt voor cryopreservatie in biorepositories interfereert echter met massaspectrometrie. We schetsen methoden om sfingolipiden in menselijke weefsels ingebed in OCT te analyseren met LC-ESI-MS / MS.

Voorbereiding van menselijke weefsels ingebed in optimale snijtemperatuurverbinding voor massaspectrometrie-analyse

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

OCT is een cryoconserveringsmiddel dat niet compatibel is met massaspectrometrie-analyse. Met behulp van dit protocol kunnen onderzoekers OCT uit weefsels verwijderen en sfingolipiden kwantificeren met tandemvloeistofchromatografie massaspectrometrie. De voorbereiding van weefseldrogende lonten, weefselwassen en weefselweging zal worden gedemonstreerd door April Boyd van de Virginia Commonwealth University, en de lipide-extractie zal worden gedemonstreerd door Dr. Jeremy Allegood, directeur van de Virginia Commonwealth Metabolomics en Lipidomics Core.Maak om te beginnen een chirurgische schaar schoon door ze gedurende vijf minuten onder te dompelen in methanol, gevolgd door ze af te vegen met een schoon weefsel van laboratoriumkwaliteit. Draai met poedervrije handschoenen het uiteinde van een weefsel van laboratoriumkwaliteit om een fijn taps toelopende lont van 30 tot 40 millimeter lang te creëren. Knip vervolgens met de methanol gereinigde schaar de lont aan het dikke uiteinde en plaats deze in een schone kartonnen doos.Knip vervolgens met behulp van de methanol gereinigde schaar vier tot vijf millimeter van de punt van een pipetpunt van één milliliter en plaats de punt terug in de tiphouder. Om de OCT uit de weefsels weg te spoelen, voegt u 10 milliliter ijskoud ultrapuur gedeïoniseerd water toe aan elke buis met menselijk longweefsel en sluit u ze stevig af. Laat de buisjes 10 minuten incuberen.Vortex elke buis krachtig totdat al het weefsel dat op de wanden van de buis of de weefselpellet is afgezet, volledig is geresuspendeerd. Centrifugeer vervolgens de buizen in een voorgekoelde zwenkbakcentrifuge op 4.000 tot 5.000 maal G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Zodra de centrifugatie is voltooid, sluit u de buizen op ijs af.Zuig de wasoplossing voorzichtig op, laat ongeveer 0,5 milliliter van het supernatant in de buis achter en sluit de buis vervolgens opnieuw af. Nadat u het supernatant uit alle buizen hebt verwijderd, wast u de weefsels nog twee keer op dezelfde manier. Gebruik na de drie OCT-verwijderingswasbeurten de voorbereide verkorte pipetpunt om 500 microliter ijskoude PBS aan de buis toe te voegen.Gebruik dezelfde punt, resuspendeer de pellet voorzichtig en breng al het geresuspendeerde weefsel over in een vooraf gelabelde en vooraf gewogen centrifugebuis van 1,5 milliliter. Houd de buis op ijs totdat alle weefselmonsters zijn overgedragen. Pelleteer de weefsels door de buizen in een voorgekoelde centrifuge te centrifugeren, aspirateer vervolgens voorzichtig zoveel mogelijk van de PBS zonder de pellet te verstoren en plaats de buizen terug op ijs.Gebruik de eerder bereide weefseldrooglonten, verwijder voorzichtig de resterende wasoplossing, sluit vervolgens de buis en plaats deze op ijs. Om de buizen te wegen, plaatst u één buis tegelijk in een recent gekalibreerde geteerde en nulvormige analytische balans en sluit u de kamerdeur. Zodra het gewicht is gestabiliseerd, registreert u het in een elektronische spreadsheet.Plaats na het wegen de buis weer op ijs en voeg 300 microliter ijskoude PBS toe. Breng met behulp van een verkorte pipetpunt voorzichtig al het weefsel over in twee milliliter ijskoude methanol in een vooraf gelabelde glazen buis met schroeftop. Laat vóór lipide-extractie de interne lipidennormen van weefsels en massaspectrometrie gedurende 20 minuten in evenwicht brengen tot kamertemperatuur, vortex en dompel de interne standaardoplossingen onder in een ultrasoon waterbad totdat de lipidenormen volledig zijn opgelost.Voeg met behulp van een herhalende pipet 250 picomol van de interne massaspectrometriestandaarden toe aan elke buis en vat de buizen licht samen. Om homogenisatie te vergemakkelijken, past u het volume methanol aan op twee milliliter en tritureert u het weefsel vervolgens met behulp van een homogenisator door de homogenisatorpunt in een cirkelvormige beweging te bewegen die zachtjes tegen de buiswand wordt gedrukt. Wanneer klonten niet meer zichtbaar zijn, sluit u de buis opnieuw af.Dompel de buis onder in een hoek van 45 graden in een ultrasoon waterbad gedurende 5 tot 10 seconden. Voeg vervolgens onder een zuurkast chloroform en methanol toe aan elke buis om een methanol-chloroform-waterverhouding van twee tot één tot 0,1 te bereiken. Sluit de buizen goed af en laat ze tot het einde van de dag op de benchtop liggen.Voordat u die avond vertrekt, plaatst u de goed afgedekte buizen in een waterbad van 48 graden Celsius voor een nachtelijke incubatie. Pelleteer de volgende dag elk oplosmiddel en oplosbaar vuil door centrifugering. Decanteer vervolgens in een zuurkast het supernatant voorzichtig in vooraf gelabelde 13 in 100 millimeter borosilicaat glazen reageerbuizen die in een hoek van 30 tot 45 graden zijn gekanteld om het decanteren te vergemakkelijken.Nadat u het supernatant uit alle buizen hebt gedecanteerd, gebruikt u een vacuümconcentrator op maximaal vacuüm met een eerste verwarmingsstap van een uur bij 40 graden Celsius om alle oplosmiddelen te verdampen en voegt u vervolgens 500 microliter methanol toe aan elke buis. Om de gedroogde lipide-extracten te resuspenderen, vortex de buis gedurende 5 tot 10 seconden en dompelt u de buis vervolgens onder in een ultrasoon waterbad in een hoek van 45 graden met rotatie gedurende twee minuten. Vortex de buis gedurende vijf seconden opnieuw en dompel opnieuw onder in het ultrasone waterbad gedurende een extra minuut.Verwijder onoplosbaar vuil door centrifugeren en decanteer het supernatant vervolgens in een vooraf gelabelde injectieflacon met auto-injectoren die in een hoek van 30 tot 45 graden is gekanteld om het decanteren te vergemakkelijken. Sluit de injectieflacons goed af voordat u ze tot de analyse bij min 80 graden Celsius bewaart. Vloeistofchromatografie elektrospray ionisatie tandem massaspectrometrie analyse na OCT verwijdering bevestigt dat verschillende ketenlange soorten ceramiden en monohexosyl-ceramiden significant verhoogd zijn in menselijke longadenocarcinoomtumoren in vergelijking met normale aangrenzende niet-betrokken weefsels.Sfingolipidenormen elueren sequentieel in de volgende volgorde:d17:1 sphingosine, d17:1 sphingosine-1-fosfaat, C12 lactosyl-ceramide, C12 monohexosyl-ceramide, C12 sfingomyelin en C12 ceramide. Voor elk van deze sfingolipidesoorten is er, met behulp van de gradiënt- en instrumentatie-instellingen in de tekst, een geschatte positieve verschuiving van 0,15 minuten in de retentietijd voor elke twee koolstoftoenames in ketenlengte. Langere kettinglange lipiden zoals C24 en C26 kunnen echter grotere retentietijdverschuivingen hebben.Bovendien resulteert een dubbele binding in het vetzuur vaak in een negatieve verschuiving van 0,15 minuut in de retentietijd. C18:1 ceramide zal dus een retentietijd hebben die vergelijkbaar is met C16 ceramide. In plaats van bijna uitsluitend te vertrouwen op vers verzamelde weefsels, breidt dit protocol de weefselbronnen die kunnen worden gebruikt voor massaspectrometrie-analyse uit met die cryogenisch opgeslagen in biorepositories.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Vier-kleur Fluorescentie Immunohistochemie van T-cel Subpopulations in Archival Formalin-Fixed, Paraffine-Embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Monsters

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

Het bepalen van de optimale frequentie voor remmende kankercellen gebruiken Tumor Behandeling Fields (TTFields)

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Twee-dimensionale gelelektroforese gekoppeld aan massaspectrometrie methoden voor een analyse van menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Verrijking van de Phosphopeptide in combinatie met kwantitatieve Label-vrije Spectrometrie van de massa te onderzoeken van de Phosphoproteome in prostaatkanker

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastische kleuring op paraffine-ingesloten Dia's van pT3N0M0 maagkanker weefsel

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Digitale analyse van immunokleuring van ZW10 interactie eiwit in menselijke Long weefsels

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Vastleggen van klein molecuul communicatie tussen de weefsels en cellen met behulp van Imaging massaspectrometrie

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Extractie van waterige metabolieten van gekweekte aanhang cellen voor Metabolomic analyse door capillaire elektroforese-massaspectrometrie

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Bereiding van mitochondriën van ovariële kanker weefsels en controle ovariële weefsels voor kwantitatieve Proteomics analyse

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Celdood evalueren met celvrije supernatant van probiotica in driedimensionale sferoïde culturen van colorectale kankercellen

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...