Name: preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis
Uploaded: 2021-04-27T15:00:00
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Dienstleistungen und Unterstützung des Forschungsprojekts wurden vom VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core und dem VCU Lipidomics and Metabolomics Core bereitgestellt, die teilweise mit Mitteln des NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059 unterstützt werden. Diese Arbeit wurde von National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago Lima) unterstützt.

De-identifiziertes menschliches Lungengewebe wurde vom Tissue and Data Acquisition and Analysis Core der Virginia Commonwealth University (VCU) im Rahmen eines vom internen Prüfungsausschuss (IRB) genehmigten Protokolls (#HM2471) gewonnen. Die Verwendung von Mäusen für die Forschung und Ernte von Mäusegeweben wurde vom VCU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.
1. Vorbereitung der Materialien
HINWEIS: Diese Schritte sollten einen Tag vor de...

<ol>
	<li>Maceyka, M., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolites+in+inflammatory+disease.">Sphingolipid metabolites in inflammatory disease.</a> Nature. 510, 58-67 (2014).</li><li>Ogretmen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolism+in+cancer+signalling+and+therapy.">Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Hla, T., Dannenberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+signaling+in+metabolic+disorders.">Sphingolipid signaling in metabolic disorders.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).</li><li>Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+and+Sphingosine+Kinase+1+involvement+in+endocytic+membrane+Trafficking.">Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).</li><li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+is+required+for+BECN1-+and+ATG5-dependent+cell+death+induced+by+sphingosine+kinase+1+inhibition.">TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition.</a> Autophagy. , 1-50 (2018).</li><li>Young, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+Kinase+1+cooperates+with+autophagy+to+maintain+endocytic+membrane+trafficking.">Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking.</a> Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).</li><li>Young, M. M., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+as+regulators+of+autophagy+and+endocytic+trafficking.">Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking.</a> Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+endocytosis+and+sphingosine+kinase+1+recruitment.">Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment.</a> Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).</li><li>Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).</li><li>Rohrbach, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+sphingolipid+analysis+of+tissues+embedded+in+optimal+cutting+temperature+compound.">A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound.</a> Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).</li><li>Weston, L. A., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+LC-MS/MS+analysis+of+optimal+cutting+temperature+(OCT)+compound+removal+for+the+study+of+mammalian+proteomes.">Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes.</a> Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).</li><li>Holfeld, A., Vald&#233;s, A., Malmstr&#246;m, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+proteomic+workflow+for+mass+spectrometric+analysis+of+tissue+samples+preserved+by+different+methods.">Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).</li><li>Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteome+analysis+of+fresh+frozen+and+optimal+cutting+temperature+(OCT)+embedded+primary+non-small+cell+lung+carcinoma+by+LC-MS/MS.">Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS.</a> Methods. 81, 50-55 (2015).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+proteomics+using+chemical+immobilization+and+mass+spectrometry.">Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).</li></ol>

OCT ist ein gängiges Langzeit-Kryokonservierungsmittel, das in Biorepositorien verwendet wird. OCT kann jedoch zu einer Ionenunterdrückung führen, wenn Gewebe mit verschiedenen Massenspektrometrieplattformen12,13,14,15 analysiert werden, oder zu Signalverlust, wenn Proben mit LC-ESI-MS/MS 11 analysiert werden. OCT in kryokonservierten Geweben kann auch Gewebenormalisi...

Sphingolipide sind bioaktive Metaboliten, die für ihre Rolle im menschlichen Stoffwechsel und bei Krankheiten bekanntsind 1,2. Sie regulieren komplexe zelluläre Prozesse wie Zellmigration, Zellüberleben und -tod, Zellbewegung, vesikulären Transport, Zellinvasion und Metastasierung, Angiogenese und die Produktion von Zytokinen 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defekte in der Regulation des Sphingolipidstoffwechsels tragen zur Entstehung und Progression von Krebserkrankungen bei, bestimmen, wie aggressiv Krebserkrankungen sind und wie Krebserkrankungen auf die Therapie ansprechen und Resistenzen gegen diese entwickeln 3,10. Aufgrund dieser breiten Auswirkungen auf die Ätiologie von Krankheiten sind daher analytische Methoden, die krankheitsspezifische Sphingolipidveränderungen präzise feststellen können, wichtige Werkzeuge. Die Massenspektrometrie (MS) ist die genaueste und zuverlässigste Methode zur Analyse von Sphingolipidveränderungen.
Humanproben, die für die Analyse von Sphingolipidveränderungen verwendet werden können, können prospektiv aus dem OP-Bereich oder retrospektiv aus Gewebe-Biorepositorien gewonnen werden. Frischgewebe aus der Chirurgie sind vorteilhaft, da sie direkt mittels MS oder anderen Analysemethoden analysiert werden können. Der prospektive Erwerb von Geweben birgt jedoch administrative, technische und logistische Hürden, und das Sammeln ausreichender Proben, um statistische Aussagekraft zu erreichen, kann eine Herausforderung sein. Die Gewinnung von Geweben aus Biorepositorien ist vorteilhaft, da sie retrospektiv in großer Zahl erworben werden können und Biorepositorien Histologie und Pathologie bestätigen, Standardarbeitsanweisungen verwenden, um Gewebe kryogen zu konservieren und zu lagern, und klinisch-pathologische Daten liefern können, die für Korrelationsanalysen verwendet werden können. Um jedoch molekulare und strukturelle Merkmale zu erhalten, können Biorepositorien Gewebe kryokonservieren, indem sie sie in eine optimale Schnitttemperatur (OCT) -Verbindung einbetten, was nachweislich die Datennormalisierungsassays und die Quantifizierung von Sphingolipiden durch Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS) stört11 . Es wurde auch gezeigt, dass Polyvinylalkohol und Polyethylenglykol, die Hauptkomponenten in OCT-Verbindungen, zu einer Ionenunterdrückung in anderen MS-Analyseplattformenführen 12,13,14,15. Daher muss die OCT-Verbindung vor der sphingolipidomischen Analyse durch MS aus dem Gewebe entfernt werden.
In einem früheren Bericht haben wir ein Protokoll für die Entfernung von OCT-Verbindungen aus menschlichen Proben für die LC-ESI-MS/MS-Analyse 11 und die Methodik zum Wiegen von Geweben zur Datennormalisierung11 validiert. Hier beschreiben wir die Schritte des sphingolipidomischen OCT-Compound-Removal Protocol (sOCTrP) und zeigen repräsentative Daten von menschlichen Lungenadenokarzinomtumoren und normalen benachbarten unbeteiligten Geweben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL polypropylene pipette tips</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to retrieve specimens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-116</td>
			<td>Used for tube and tissue weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Sciex Analyst 1.6.2</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software to analyze and integrate MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Scale that is accurate to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top dispenser</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-723071</td>
			<td>Used for dispensing solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2212</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#946;-glucosyl-sphing-4-eine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2511</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#223;-lactosyl-sphing-4-ene</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2512</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Sphingomyelin&#160; (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2312</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHLOROFORM OMNISOLV 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1054-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClickSeal Biocontainment Lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75007309</td>
			<td>To prevent biohazard aeresols during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conflikt</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>4101</td>
			<td>Decontaminant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTO-20A/20AC Column Oven</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine;&#160; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2000</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2144</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGU20A5R degasser</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes 13x100mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>13x100 mm screw top tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated water bath</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For overnight lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 150</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-167</td>
			<td>triturate tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-177</td>
			<td>for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>Laboratory grade tissue used to make wicks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS Grade 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0486-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexera LC-30 AD binary pump system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-502</td>
			<td>13x100 mm screw top tube caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>To retrieve specimens from tubes after washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4987000118</td>
			<td>To dispense LC-MS internal standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89239-020</td>
			<td>Autoinjector vial caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Thread Glass Vials with ID Patch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46610-724</td>
			<td>Autoinjector vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIL-30AC autoinjector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD2030P1220</td>
			<td>For drying solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53822-U</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-ESI-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model 2800</td>
			<td>for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For sOCTrP and resuspending dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729572</td>
			<td>13x100 glass culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Hipersolve Chromanorm LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis

Sphingolipide sind zelluläre Komponenten, die eine gut etablierte Rolle im menschlichen Stoffwechsel und bei Krankheiten spielen. Die Massenspektrometrie kann verwendet werden, um festzustellen, ob Sphingolipide bei einer Krankheit verändert sind, und um zu untersuchen, ob Sphingolipide klinisch gezielt eingesetzt werden können. Richtig durchgeführte prospektive Studien, die Gewebe direkt aus dem OP-Bereich gewinnen, können jedoch zeitaufwendig und technisch, logistisch und administrativ herausfordernd sein. Im Gegensatz dazu können retrospektive Studien die Vorteile kryokonservierter menschlicher Proben nutzen, die bereits in großer Anzahl in Gewebebiorepositorien verfügbar sind. Weitere Vorteile der Beschaffung von Geweben aus Biorepositorien sind der Zugang zu Informationen, die mit den Gewebeproben verbunden sind, einschließlich Histologie, Pathologie und in einigen Fällen klinisch-pathologischen Variablen, die alle verwendet werden können, um Korrelationen mit Lipidomics-Daten zu untersuchen. Technische Einschränkungen im Zusammenhang mit der Inkompatibilität der optimalen Schnitttemperaturverbindung (OCT), die in der Kryokonservierung und Massenspektrometrie verwendet wird, stellen jedoch eine technische Barriere für die Analyse von Lipiden dar. Wir haben jedoch bereits gezeigt, dass OCT leicht aus menschlichen Biorepository-Proben durch Wasch- und Zentrifugationszyklen entfernt werden kann, ohne ihren Sphingolipidgehalt zu verändern. Wir haben auch zuvor festgestellt, dass Sphingolipide in menschlichen Geweben, die in OCT kryokonserviert werden, bis zu 16 Jahre stabil sind. In diesem Bericht beschreiben wir die Schritte und den Workflow zur Analyse von Sphingolipiden in menschlichen Gewebeproben, die in OCT eingebettet sind, einschließlich Waschtücher, Wiegen von Geweben zur Datennormalisierung, Extraktion von Lipiden, Vorbereitung von Proben für die Analyse durch Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS / MS), Massenspektrometrie-Datenintegration, Datennormalisierung und Datenanalyse.

In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert eine Methode zur Entfernung von OCT aus kryokonservierten menschlichen Geweben und wiegen die Gewebe für die Analyse durch LC-ESI-MS/MS. Die für dieses Verfahren erforderlichen Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. In Abbildung 1 sind die Ergebnisse eines typischen Experiments dargestellt, bei dem 10 menschliche Lungenadenokarzinom-Tumoren und 10 normale benachbarte Gewebe gewaschen wurden, um OCT zu entfernen und mit LC-ESI-MS / MS analysi...

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Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Sphingolipide sind bioaktive Metaboliten mit einer gut etablierten Rolle bei menschlichen Erkrankungen. Die Charakterisierung von Veränderungen in Geweben mit Massenspektrometrie kann Rollen in der Krankheitsätiologie aufdecken oder therapeutische Ziele identifizieren. Die OCT-Verbindung, die für die Kryokonservierung in Biorepositorien verwendet wird, stört jedoch die Massenspektrometrie. Wir skizzieren Methoden zur Analyse von Sphingolipiden in menschlichen Geweben, die in OCT mit LC-ESI-MS/MS eingebettet sind.

Vorbereitung von menschlichem Gewebe, eingebettet in die optimale Schnitttemperaturmischung für die massenspektrometrische Analyse

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

OCT ist ein Kryokonservierungsmittel, das mit der massenspektrometrischen Analyse nicht kompatibel ist. Mit diesem Protokoll können Forscher OCT aus Geweben entfernen und Sphingolipide mit Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie quantifizieren. Die Herstellung von Gewebetrocknungsdochten, Gewebewaschen und Gewebewiegen wird von April Boyd von der Virginia Commonwealth University demonstriert, und die Lipidextraktion wird von Dr. Jeremy Allegood, Direktor des Virginia Commonwealth Metabolomics and Lipidomics Core, demonstriert.Reinigen Sie zunächst die chirurgische Schere, indem Sie sie fünf Minuten lang in Methanol eintauchen, gefolgt von einem sauberen Laborgewebe. Wirbeln Sie mit puderfreien Handschuhen das Ende eines Laborgewebes zu einem fein konischen 30 bis 40 Millimeter langen Docht. Schneiden Sie dann mit der mit Methanol gereinigten Schere den Docht am dicken Ende ab und legen Sie ihn in einen sauberen Karton.Als nächstes schneiden Sie mit der mit Methanol gereinigten Schere vier bis fünf Millimeter von der Spitze einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze ab und legen Sie die Spitze wieder in den Spitzenhalter. Um das OCT aus dem Gewebe abzuwaschen, fügen Sie 10 Milliliter eiskaltes ultrareines entionisiertes Wasser zu jedem Röhrchen hinzu, das menschliches Lungengewebe enthält, und verschließen Sie sie fest. Lassen Sie die Röhrchen 10 Minuten inkubieren.Wirbeln Sie jedes Röhrchen kräftig durch, bis das gesamte an den Wänden des Röhrchens oder des Gewebepellets abgelagerte Gewebe vollständig resuspendiert ist. Anschließend zentrifugieren Sie die Röhrchen in einer vorgekühlten Schaufelzentrifuge bei 4.000 bis 5.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, öffnen Sie die Röhrchen auf Eis.Saugen Sie die Waschlösung vorsichtig ab, lassen Sie etwa 0,5 Milliliter des Überstands im Röhrchen, und verschließen Sie dann das Röhrchen erneut. Nachdem Sie den Überstand aus allen Röhrchen entfernt haben, waschen Sie das Gewebe noch zweimal auf die gleiche Weise. Nach den drei OCT-Entfernungswäschen verwenden Sie die vorbereitete verkürzte Pipettenspitze, um 500 Mikroliter eiskaltes PBS in das Röhrchen zu geben.Resuspendieren Sie das Pellet mit derselben Spitze vorsichtig und geben Sie das gesamte resuspendierte Gewebe in ein vormarkiertes und vorgewogenes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Halten Sie das Röhrchen auf Eis, bis alle Gewebeproben übertragen sind. Pelletieren Sie das Gewebe, indem Sie die Röhrchen in einer vorgekühlten Zentrifuge zentrifugieren, dann vorsichtig so viel PBS wie möglich absaugen, ohne das Pellet zu stören, und legen Sie die Röhrchen wieder auf Eis.Entfernen Sie mit den zuvor vorbereiteten Gewebetrocknungsdochten vorsichtig die restliche Waschlösung, schließen Sie dann das Röhrchen und legen Sie es auf Eis. Um die Röhrchen zu wiegen, legen Sie jeweils ein Röhrchen in eine kürzlich kalibrierte Teer- und Null-Analysenwaage und schließen Sie die Kammertür. Sobald sich das Gewicht stabilisiert hat, notieren Sie es in einer elektronischen Tabelle.Stellen Sie das Röhrchen nach dem Wiegen wieder auf Eis und fügen Sie 300 Mikroliter eiskaltes PBS hinzu. Übertragen Sie mit einer verkürzten Pipettenspitze vorsichtig das gesamte Gewebe in zwei Milliliter eiskaltes Methanol in einem vorbeschrifteten Glasrohr mit Schraubverschluss. Lassen Sie vor der Lipidextraktion die internen Lipidstandards des Gewebes und der Massenspektrometrie 20 Minuten lang auf Raumtemperatur ausgleichen, dann wirbeln und tauchen Sie die internen Standardlösungen in ein Ultraschallwasserbad, bis sich die Lipidstandards vollständig aufgelöst haben.Fügen Sie mit einer Repetierpipette 250 Picomole der internen Massenspektrometriestandards zu jeder Röhre hinzu und verschließen Sie die Röhrchen leicht. Um die Homogenisierung zu erleichtern, stellen Sie das Methanolvolumen auf zwei Milliliter ein und trituieren Sie dann das Gewebe mit einem Homogenisator, indem Sie die Homogenisatorspitze in einer kreisförmigen Bewegung bewegen, die sanft gegen die Rohrwand gedrückt wird. Wenn Klumpen nicht mehr sichtbar sind, verschließen Sie das Röhrchen erneut.Tauchen Sie die Röhre in einem Winkel von 45 Grad für 5 bis 10 Sekunden in ein Ultraschall-Wasserbad. Fügen Sie dann unter einem Abzug Chloroform und Methanol zu jedem Röhrchen hinzu, um ein Verhältnis von Methanol zu Chloroform zu Wasser von zwei zu eins zu 0,1 zu erreichen. Verschließen Sie die Tuben fest und lassen Sie sie bis zum Ende des Tages auf dem Tisch.Bevor Sie an diesem Abend gehen, legen Sie die dicht verschlossenen Röhrchen in ein 48 Grad Celsius warmes Wasserbad für eine Inkubation über Nacht. Am folgenden Tag werden Lösungsmittel und lösliche Ablagerungen durch Zentrifugieren pelletiert. Dekantieren Sie dann in einem Abzug den Überstand vorsichtig in vorbeschriftete 13 bis 100 Millimeter Borosilikatglas-Reagenzgläser, die in einem Winkel von 30 bis 45 Grad geneigt sind, um das Dekantieren zu erleichtern.Verwenden Sie nach dem Dekantieren des Überstands aus allen Röhrchen einen Vakuumkonzentrator bei maximalem Vakuum mit einem anfänglichen einstündigen Heizschritt bei 40 Grad Celsius, um das gesamte Lösungsmittel zu verdampfen, und fügen Sie dann 500 Mikroliter Methanol zu jeder Röhre hinzu. Um die getrockneten Lipidextrakte zu resuspendieren, wirbeln Sie das Röhrchen für 5 bis 10 Sekunden und tauchen Sie das Röhrchen dann in ein Ultraschall-Wasserbad in einem 45-Grad-Winkel mit Drehung für zwei Minuten. Wirbeln Sie das Rohr fünf Sekunden lang erneut und tauchen Sie für eine weitere Minute in das Ultraschall-Wasserbad ein.Entfernen Sie unlösliche Ablagerungen durch Zentrifugation und dekantieren Sie dann den Überstand in eine vormarkierte Autoinjektordurchstechflasche, die in einem Winkel von 30 bis 45 Grad geneigt ist, um das Dekantieren zu erleichtern. Verschließen Sie die Durchstechflaschen fest, bevor Sie sie bis zur Analyse bei minus 80 Grad Celsius lagern. Die Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie-Analyse nach OCT-Entfernung bestätigt, dass verschiedene kettenlange Spezies von Ceramiden und Monohexosyl-Ceramiden in menschlichen Lungenadenokarzinom-Tumoren im Vergleich zu normalen benachbarten unbeteiligten Geweben signifikant erhöht sind.Sphingolipid-Standards eluieren nacheinander in der folgenden Reihenfolge:d17:1 Sphingosin, d17:1 Sphingosin-1-phosphat, C12 Lactosyl-Ceramid, C12 Monohexosyl-Ceramid, C12 Sphingomyelin und C12 Ceramid. Für jede dieser Sphingolipidspezies ergibt sich unter Verwendung der Gradienten- und Instrumentierungseinstellungen im Text eine ungefähre positive Verschiebung der Retentionszeit um 0,15 Minuten für jede zweite Kohlenstoffzunahme der Kettenlänge. Längere kettenlange Lipide wie C24 und C26 können jedoch größere Verschiebungen der Retentionszeit aufweisen.Darüber hinaus führt eine Doppelbindung in der Fettsäure oft zu einer negativen Verschiebung der Retentionszeit um 0,15 Minuten. Daher hat C18:1-Ceramid eine ähnliche Retentionszeit wie C16-Ceramid. Anstatt sich fast ausschließlich auf frisch gesammeltes Gewebe zu verlassen, erweitert dieses Protokoll die Gewebequellen, die für die massenspektrometrische Analyse verwendet werden können, um diejenigen, die kryogen in Biorepositorien gelagert werden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Vier-Farb-Fluoreszenz-Immunhistochemie von T-Zell-Subpopulationen im Archiv Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete menschliche Oropharynx-Plattenepithelkarzinom-Proben

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Forschung

Krebsforschung

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

Die Bestimmung der optimalen inhibitorische Frequenz für Krebszellen mit Tumor Behandlung Fields (TTFields)

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Zweidimensionaler Gelelektrophorese gekoppelt mit Massenspektrometrie Methoden für eine Analyse der menschlichen Hypophyse Adenom Gewebe Proteom

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide Bereicherung gepaart mit quantitativen markierungsfreie Massenspektrometrie zu untersuchen, die Phosphoproteome bei Prostatakrebs

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastische Färbung auf Paraffin-eingebetteten Dias von pT3N0M0 Magenkrebsgewebe

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Digitale Analyse der Immunostainierung von ZW10 Interacting Protein in menschlichen Lungengeweben

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Erfassung von niedermolekularer Kommunikation zwischen Gewebe und Zellen mit Hilfe von Imaging-Massenspektrometrie

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Gewinnung von wässrigen Metaboliten aus kultivierten Adherenten Zellen für die metabolomische Analyse durch die kapitänische Spektrometrie Elektrophoresis-Mass

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Vorbereitung von Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und Kontrolle von Ovarialgeweben für die quantitative Proteomik-Analyse

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluierung des Zelltods mit zellfreiem Überstand von Probiotika in dreidimensionalen sphäroiden Kulturen von Darmkrebszellen

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...