Name: preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis
Uploaded: 2021-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

השירותים והתמיכה של פרויקט המחקר סופקו על ידי מרכז הסרטן VCU מאסי רקמות ואיסוף וניתוח נתונים הליבה והליבה של VCU Lipidomics and Metabolomics, הנתמכים בחלקם במימון מענק התמיכה של מרכז הסרטן NIH-NCI P30CA016059. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים של מענקי בריאות R21CA232234 (סנטיאגו לימה).

רקמות ריאה אנושיות שעברו דה-זיהוי התקבלו מליבת האיסוף והניתוח של רקמות ונתונים של אוניברסיטת וירג'יניה (VCU) תחת פרוטוקול מאושר (#HM2471) של ועדת בדיקה פנימית (IRB). השימוש בעכברים למחקר וקציר רקמות עכברים אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של VCU (IACUC).
1. הכנת חומרים...

<ol>
	<li>Maceyka, M., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolites+in+inflammatory+disease.">Sphingolipid metabolites in inflammatory disease.</a> Nature. 510, 58-67 (2014).</li><li>Ogretmen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolism+in+cancer+signalling+and+therapy.">Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Hla, T., Dannenberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+signaling+in+metabolic+disorders.">Sphingolipid signaling in metabolic disorders.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).</li><li>Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+and+Sphingosine+Kinase+1+involvement+in+endocytic+membrane+Trafficking.">Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).</li><li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+is+required+for+BECN1-+and+ATG5-dependent+cell+death+induced+by+sphingosine+kinase+1+inhibition.">TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition.</a> Autophagy. , 1-50 (2018).</li><li>Young, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+Kinase+1+cooperates+with+autophagy+to+maintain+endocytic+membrane+trafficking.">Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking.</a> Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).</li><li>Young, M. M., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+as+regulators+of+autophagy+and+endocytic+trafficking.">Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking.</a> Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+endocytosis+and+sphingosine+kinase+1+recruitment.">Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment.</a> Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).</li><li>Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).</li><li>Rohrbach, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+sphingolipid+analysis+of+tissues+embedded+in+optimal+cutting+temperature+compound.">A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound.</a> Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).</li><li>Weston, L. A., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+LC-MS/MS+analysis+of+optimal+cutting+temperature+(OCT)+compound+removal+for+the+study+of+mammalian+proteomes.">Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes.</a> Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).</li><li>Holfeld, A., Vald&#233;s, A., Malmstr&#246;m, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+proteomic+workflow+for+mass+spectrometric+analysis+of+tissue+samples+preserved+by+different+methods.">Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).</li><li>Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteome+analysis+of+fresh+frozen+and+optimal+cutting+temperature+(OCT)+embedded+primary+non-small+cell+lung+carcinoma+by+LC-MS/MS.">Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS.</a> Methods. 81, 50-55 (2015).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+proteomics+using+chemical+immobilization+and+mass+spectrometry.">Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).</li></ol>

OCT הוא חומר שימור קריו נפוץ לטווח ארוך המשמש בביו-ריפוזיטורים. עם זאת, OCT יכול לגרום לדיכוי יונים כאשר רקמות מנותחות על ידי פלטפורמות ספקטרומטריית מסהשונות 12,13,14,15, או לגרום לאובדן אות כאשר דגימות מנותחות על ידי LC-ESI-MS/...

ספינגוליפידים הם מטבוליטים ביו-אקטיביים הידועים בתפקידם בחילוף החומרים האנושי ובמחלות 1,2. הם מווסתים תהליכים תאיים מורכבים כגון נדידת תאים, הישרדות תאים ומוות, תנועת תאים, סחר בשלפוחית, פלישה תאית וגרורות, אנגיוגנזה וייצור ציטוקינים 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . פגמים בוויסות חילוף החומרים של ספינגוליפידים תורמים לייזום והתקדמות של סרטן, קובעים עד כמה סוגי סרטן אגרסיביים, וכיצד סוגי סרטן מגיבים ומפתחים עמידות לטיפול 3,10. לכן, בגלל ההשפעות הרחבות הללו על האטיולוגיה של המחלה, שיטות אנליטיות שיכולות לקבוע במדויק שינויים sphingolipid ספציפיים למחלה הם כלים חשובים. ספקטרומטריית מסות (MS) היא השיטה המדויקת והאמינה ביותר לניתוח שינויים ספינגוליפידים.
דגימות אנושיות שניתן להשתמש בהן לניתוח של שינויים sphingolipid ניתן להשיג באופן פרוספקטיבי מן הסוויטה כירורגית או בדיעבד מן biorepositories רקמות. רקמות טריות מניתוח הן יתרון מכיוון שניתן לנתח אותן ישירות על ידי טרשת נפוצה או שיטות אנליטיות אחרות. עם זאת, רכישת רקמות באופן פרוספקטיבי כוללת מכשולים אדמיניסטרטיביים, טכניים ולוגיסטיים, ואיסוף דגימות מספיקות כדי להגיע לעוצמה סטטיסטית יכול להיות מאתגר. קבלת רקמות מביו-רפוזיטורים היא יתרון מכיוון שניתן לרכוש אותן בדיעבד, במספרים גדולים, וביו-רפוזיטורים מאשרים היסטולוגיה ופתולוגיה, משתמשים בהליכי הפעלה סטנדרטיים כדי לשמר ולאחסן רקמות באופן קריוגני, ויכולים לספק נתונים קליניים-פתולוגיים שיכולים לשמש לניתוחי קורלציה. עם זאת, כדי לשמר תכונות מולקולריות ומבניות, ביו-רפוזיטורים עשויים להקפיא רקמות על ידי הטמעתן בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), אשר הראינו מפריעה למבחני נורמליזציה של נתונים ולכימות של ספינגוליפידים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אלקטרוספריי יינון טנדם ספקטרומטריית מסה (LC-ESI-MS/MS)11 . כמו כן, הוכח כי אלכוהול פוליוויניל ופוליאתילן גליקול, המרכיבים העיקריים בתרכובת OCT, גורמים לדיכוי יונים בפלטפורמות ניתוח אחרות של טרשת נפוצה12,13,14,15. לכן, יש להסיר תרכובת OCT מהרקמות לפני ניתוח ספינגוליפידומי על ידי טרשת נפוצה.
בדו"ח קודם, אימתנו פרוטוקול להסרת תרכובת OCT מדגימות אנושיות לניתוח LC-ESI-MS/MS 11 ואת המתודולוגיה המשמשת לשקילת רקמות לנורמליזציה של נתונים11. כאן, אנו מפרטים את השלבים של פרוטוקול הסרת תרכובת OCT sphingolipidomic (sOCTrP) ומראים נתונים מייצגים מגידולי אדנוקרצינומה של ריאה אנושית ורקמות לא מעורבות סמוכות רגילות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL polypropylene pipette tips</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to retrieve specimens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-116</td>
			<td>Used for tube and tissue weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Sciex Analyst 1.6.2</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software to analyze and integrate MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Scale that is accurate to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top dispenser</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-723071</td>
			<td>Used for dispensing solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2212</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#946;-glucosyl-sphing-4-eine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2511</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#223;-lactosyl-sphing-4-ene</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2512</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Sphingomyelin&#160; (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2312</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHLOROFORM OMNISOLV 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1054-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClickSeal Biocontainment Lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75007309</td>
			<td>To prevent biohazard aeresols during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conflikt</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>4101</td>
			<td>Decontaminant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTO-20A/20AC Column Oven</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine;&#160; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2000</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2144</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGU20A5R degasser</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes 13x100mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>13x100 mm screw top tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated water bath</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For overnight lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 150</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-167</td>
			<td>triturate tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-177</td>
			<td>for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>Laboratory grade tissue used to make wicks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS Grade 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0486-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexera LC-30 AD binary pump system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-502</td>
			<td>13x100 mm screw top tube caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>To retrieve specimens from tubes after washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4987000118</td>
			<td>To dispense LC-MS internal standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89239-020</td>
			<td>Autoinjector vial caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Thread Glass Vials with ID Patch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46610-724</td>
			<td>Autoinjector vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIL-30AC autoinjector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD2030P1220</td>
			<td>For drying solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53822-U</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-ESI-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model 2800</td>
			<td>for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For sOCTrP and resuspending dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729572</td>
			<td>13x100 glass culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Hipersolve Chromanorm LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis

ספינגוליפידים הם מרכיבים תאיים שיש להם תפקידים מבוססים היטב בחילוף החומרים ובמחלות אנושיות. ניתן להשתמש בספקטרומטריית מסות כדי לקבוע אם ספינגוליפידים משתנים במחלה ולחקור אם ספינגוליפידים יכולים להיות ממוקדים קלינית. עם זאת, מחקרים פרוספקטיביים המופעלים כראוי הרוכשים רקמות ישירות מחדר הניתוח עשויים לגזול זמן רב, ומאתגרים מבחינה טכנית, לוגיסטית ומנהלית. לעומת זאת, מחקרים רטרוספקטיביים יכולים לנצל דגימות אנושיות בהקפאה שכבר זמינות, בדרך כלל במספרים גדולים, בביו-רפוזיטוריות של רקמות. יתרונות נוספים של רכישת רקמות מביו-רפוזיטוריות כוללים גישה למידע הקשור לדגימות הרקמות, כולל היסטולוגיה, פתולוגיה, ובמקרים מסוימים משתנים קליניים-פתולוגיים, שכולם יכולים לשמש לבחינת קורלציות עם נתוני ליפידומיקה. עם זאת, מגבלות טכניות הקשורות לחוסר תאימות של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) המשמשת בהקפאה ובספקטרומטריית מסה היא מחסום טכני לניתוח שומנים. עם זאת, הראינו בעבר כי OCT ניתן להסיר בקלות מדגימות biorepository אנושי באמצעות מחזורים של שטיפות וצנטריפוגות מבלי לשנות את התוכן sphingolipid שלהם. כמו כן, קבענו בעבר כי ספינגוליפידים ברקמות אנושיות המוקפאים ב-OCT יציבים עד 16 שנים. בדו"ח זה, אנו מתארים את השלבים ואת זרימת העבודה לניתוח sphingolipids בדגימות רקמות אנושיות המוטמעות ב- OCT, כולל רקמות שטיפה, שקילת רקמות לנורמליזציה של נתונים, מיצוי שומנים, הכנת דגימות לניתוח על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אלקטרוספריי יינון טנדם ספקטרומטריית מסה (LC-ESI-MS/MS), אינטגרציה של נתוני ספקטרומטריית מסה, נורמליזציה של נתונים וניתוח נתונים.

בפרוטוקול זה אנו מתארים בפירוט שיטה להסרת OCT מרקמות אנושיות שהשתמרו בקריו ושוקלים את הרקמות לניתוח על ידי LC-ESI-MS/MS. החומרים הנדרשים להליך זה מפורטים בטבלת החומרים. מוצגות באיור 1 תוצאות של ניסוי טיפוסי שבו 10 גידולי אדנוקרצינומה של ריאות אנושיות ו-10 רקמות סמוכות נור?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

ספינגוליפידים הם מטבוליטים ביו-אקטיביים בעלי תפקידים מבוססים היטב במחלות אנושיות. אפיון שינויים ברקמות עם ספקטרומטריית מסה יכול לחשוף תפקידים באטיולוגיה של מחלות או לזהות מטרות טיפוליות. עם זאת, תרכובת ה-OCT המשמשת לשימור בהקפאה בביו-רפוזיטורים מפריעה לספקטרומטריית מסה. אנו מתארים שיטות לניתוח ספינגוליפידים ברקמות אנושיות המוטמעות ב-OCT עם LC-ESI-MS/MS.

הכנת רקמות אנושיות משובצות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית לניתוח ספקטרומטריית מסה

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

OCT הוא סוכן שימור קריו שאינו עולה בקנה אחד עם ניתוח ספקטרומטריית מסות. באמצעות פרוטוקול זה, חוקרים יכולים להסיר OCT מרקמות ולכמת ספינגוליפידים באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית טנדם. הכנת פתילות לייבוש רקמות, שטיפת רקמות ושקילת רקמות תודגם על ידי אפריל בויד מאוניברסיטת וירג'יניה, ומיצוי השומנים יודגם על ידי ד"ר ג'רמי אלגוד, מנהל ליבת המטבולומיקה והליפידומיקה של חבר העמים של וירג'יניה.כדי להתחיל, לנקות מספריים כירורגיים על ידי טבילתם במתנול במשך חמש דקות, ולאחר מכן ניגוב אותם עם רקמה מעבדה נקייה כיתה. באמצעות כפפות נטולות אבקה, סובבו את הקצה של רקמה ברמת מעבדה כדי ליצור פתיל מחודד דק באורך 30 עד 40 מילימטרים. לאחר מכן באמצעות מספריים מנוקים מתנול, לחתוך את הפתיל בקצה עבה ומניחים אותו בקופסת קרטון נקייה.לאחר מכן, באמצעות מספריים מנוקים מתנול, לחתוך ארבעה עד חמישה מילימטרים מקצה של קצה פיפטה מיליליטר אחד ולהניח את הקצה בחזרה במחזיק הקצה. כדי לשטוף את ה-OCT מהרקמות, הוסיפו 10 מיליליטר של מים דה-יוניים קרים כקרח לכל צינור המכיל רקמת ריאה אנושית וכסו אותם בחוזקה. אפשר את הצינורות לדגור במשך 10 דקות.מערבלת במרץ כל צינור עד שכל הרקמה שהופקדה על קירות הצינור או גלולת הרקמה מתחדשת לחלוטין. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינורות בצנטריפוגת דלי מתנדנדת מקוררת מראש ב 4, 000 עד 5, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלמת הצנטריפוגה, פתחו את הצינורות על הקרח.בזהירות לשאוף את תמיסת לשטוף, משאיר כ 0.5 מיליליטר של supernatant בצינור, ולאחר מכן לסכם את הצינור. לאחר הסרת supernatant מכל הצינורות, לשטוף את הרקמות פעמיים נוספות באותו אופן. לאחר שלוש השטיפות להסרת OCT, השתמש בקצה הפיפטה המקוצר המוכן כדי להוסיף 500 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח לצינור.באמצעות אותו קצה, יש להשעות בעדינות את הכדור ולהעביר את כל הרקמה שעברה החייאה לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר מסומן מראש ומשוקל מראש. שמור את הצינור על הקרח עד שכל דגימות הרקמה מועברות. גלולו את הרקמות על ידי צנטריפוגה של הצינורות בצנטריפוגה מקוררת מראש, ואז שאפו בזהירות כמה שיותר מה-PBS מבלי להפריע לכדור והניחו את הצינורות בחזרה על קרח.באמצעות פתילות ייבוש הרקמות שהוכנו קודם לכן, הסר בעדינות את כל תמיסת הכביסה שנותרה, ולאחר מכן סגור את הצינור והנח אותו על קרח. כדי לשקול את הצינורות, הנח צינור אחד בכל פעם באיזון אנליטי מכויל לאחרונה ואפס וסגור את דלת התא. לאחר שהמשקל התייצב, רשום אותו בגיליון אלקטרוני אלקטרוני.לאחר השקילה, החזירו את הצינור לקרח והוסיפו 300 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח. באמצעות קצה פיפטה מקוצר, העבירו בזהירות את כל הרקמה לשני מיליליטר של מתנול קר כקרח בצינור זכוכית עליון עם הברגה עם תווית מראש. לפני מיצוי השומנים, אפשרו לרקמות ולתקני השומנים הפנימיים של ספקטרומטריית המסות להתאזן לטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, ולאחר מכן מערבלים וטובלים את התמיסות הסטנדרטיות הפנימיות באמבט מים על-קולי עד לפירוק מלא של תקני השומנים.באמצעות פיפטה חוזרת, הוסף 250 פיקומולים של תקני ספקטרומטריית המסות הפנימית לכל צינור וסכם קלות את הצינורות. כדי להקל על הומוגניזציה, להתאים את נפח המתנול לשני מיליליטר, ולאחר מכן triturate את הרקמה באמצעות homogenizer על ידי הזזת קצה הומוגנייזר בתנועה מעגלית שנלחץ בעדינות על דופן הצינור. כאשר גושים אינם נראים עוד, יש לסכם את הצינור.לטבול את הצינור בזווית של 45 מעלות באמבט מים קולי למשך 5 עד 10 שניות. לאחר מכן, מתחת למכסה אדים, הוסיפו כלורופורם ומתנול לכל צינור כדי להשיג יחס מתנול לכלורופורם למים של שניים לאחד ל-0.1. אטמו את הצינורות בחוזקה והשאירו אותם על הספסל עד סוף היום.לפני היציאה באותו ערב, הניחו את הצינורות הסגורים היטב באמבט מים של 48 מעלות צלזיוס לדגירת לילה. ביום שלמחרת, גלולה כל ממס ופסולת מסיסה על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, במכסה אדים, הדקיטו בזהירות את הסופר-נאטנט לתוך מבחנות זכוכית בורוסיליקטיות מסומנות מראש בגודל 13 עד 100 מילימטר המוטות בזווית של 30 עד 45 מעלות כדי להקל על ההדחה.לאחר ניתוק הסופר-נטנט מכל הצינורות, השתמש ברכז ואקום בוואקום מקסימלי עם שלב חימום ראשוני של שעה אחת בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס כדי לאדות את כל הממס, ולאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של מתנול לכל צינור. כדי להשעות את תמציות השומנים המיובשים, מערבלים את הצינור למשך 5 עד 10 שניות, ולאחר מכן לטבול את הצינור באמבט מים קולי בזווית של 45 מעלות עם סיבוב במשך שתי דקות. מערבלים מחדש את הצינור במשך חמש שניות וטבולים מחדש באמבט המים הקוליים למשך דקה נוספת.הסר כל פסולת בלתי מסיסה על ידי צנטריפוגה, ולאחר מכן דקר את הסופרנטנט לתוך בקבוקון autoinjector מסומן מראש מוטה בזווית של 30 עד 45 מעלות כדי להקל על decanting. מכסים את הבקבוקונים היטב לפני אחסונם במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח. כרומטוגרפיה נוזלית אלקטרוספריי יינון טנדם ניתוח ספקטרומטריית מסה לאחר הסרת OCT מאשר כי מינים שונים באורך שרשרת של סרמידים ומונוהקסוזיל-סרמידים גבוהים באופן משמעותי בגידולי אדנוקרצינומה של ריאה אנושית בהשוואה לרקמות לא מעורבות סמוכות רגילות.תקני ספינגוליפיד מתחמקים ברצף בסדר הבא:d17:1 ספינגוזין, d17:1 ספינגוזין-1-פוספט, C12 לקטוזיל-סרמיד, C12 מונוהקסוזיל-סרמיד, C12 ספינגומיאלין וסרמיד C12. עבור כל אחד ממיני הספינגוליפידים האלה, באמצעות הגדרות השיפוע והמכשור בטקסט, יש תזוזה חיובית משוערת של 0.15 דקות בזמן השמירה עבור כל עלייה של שני פחמנים באורך השרשרת. עם זאת, ליפידים ארוכים יותר באורך השרשרת כגון C24 ו- C26 עשויים להיות בעלי משמרות זמן שימור גדולות יותר.יתר על כן, קשר כפול בחומצת השומן גורם לעתים קרובות לשינוי שלילי של 0.15 דקות בזמן השמירה. לפיכך, C18:1 סרמיד יהיה זמן שמירה דומה C16 סרמיד. במקום להסתמך כמעט אך ורק על רקמות טריות שנאספו, פרוטוקול זה מרחיב את מקורות הרקמה שיכולים לשמש לניתוח ספקטרומטריית מסה כך שיכללו את אלה המאוחסנים באופן קריוגני בביו-ריפוזיטורים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

ארבע צבע הקרינה אימונוהיסטוכימיה של T- תאים subpopulations ב פורמולה קבוע פורמאלית, פרפין, מוטבע האדם דגימות שלפוחית ​​השתן דגימות קרצינומה של תאי קשקש

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

קביעת תדירות המעכבות האופטימלית עבור תאים סרטניים באמצעות גידול טיפול פילדס (TTFields)

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל בשילוב עם שיטות ספקטרומטר מסה על ניתוח של רקמת גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי פרוטאום

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

העשרה Phosphopeptide בשילוב עם ספקטרומטר מסה ללא תווית כמותיים כדי לחקור את Phosphoproteome סרטן הערמונית

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

מכתים אלסטי על פרפין-שקופיות מוטבעות של רקמת סרטן pT3N0M0 קיבה

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

ניתוח דיגיטלי של מעטפת חיסונית של חלבון ZW10 אינטראקציה רקמות ריאות האדם

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

לכידת תקשורת מולקולה קטנה בין רקמות ותאים באמצעות הדמיה ספקטרומטר מסה

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

הפקת מיכלי מטבוליטים מחומרים מתורבתים מMetabolomic לניתוח באמצעות אלקטרופורזה בספקטרומטר המסה

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

הכנת מיטוכונמיטומיה של רקמות סרטן השחלות בקרת רקמות השחלות עבור ניתוח פרוטאומוניקס כמותיים

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

הערכת מוות תאים באמצעות Supernatant ללא תאים של פרוביוטיקה בתרביות כדוריות תלת מימדיות של תאים סרטניים המעי הגס

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...