Name: preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis
Uploaded: 2021-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

I servizi e il supporto del progetto di ricerca sono stati forniti dal VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core e dal VCU Lipidomics and Metabolomics Core, che sono supportati in parte con il finanziamento del NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago Lima).

I tessuti polmonari umani de-identificati sono stati ottenuti dal Tissue and Data Acquisition and Analysis Core della Virginia Commonwealth University (VCU) nell'ambito di un protocollo approvato (#HM2471) dal comitato di revisione interno (IRB). L'uso di topi per la ricerca e la raccolta di tessuti di topi è stato approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della VCU (IACUC).
1. Preparazione dei materiali
NOTA: Questi passaggi devono esser...

<ol>
	<li>Maceyka, M., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolites+in+inflammatory+disease.">Sphingolipid metabolites in inflammatory disease.</a> Nature. 510, 58-67 (2014).</li><li>Ogretmen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolism+in+cancer+signalling+and+therapy.">Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Hla, T., Dannenberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+signaling+in+metabolic+disorders.">Sphingolipid signaling in metabolic disorders.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).</li><li>Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+and+Sphingosine+Kinase+1+involvement+in+endocytic+membrane+Trafficking.">Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).</li><li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+is+required+for+BECN1-+and+ATG5-dependent+cell+death+induced+by+sphingosine+kinase+1+inhibition.">TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition.</a> Autophagy. , 1-50 (2018).</li><li>Young, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+Kinase+1+cooperates+with+autophagy+to+maintain+endocytic+membrane+trafficking.">Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking.</a> Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).</li><li>Young, M. M., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+as+regulators+of+autophagy+and+endocytic+trafficking.">Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking.</a> Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+endocytosis+and+sphingosine+kinase+1+recruitment.">Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment.</a> Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).</li><li>Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).</li><li>Rohrbach, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+sphingolipid+analysis+of+tissues+embedded+in+optimal+cutting+temperature+compound.">A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound.</a> Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).</li><li>Weston, L. A., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+LC-MS/MS+analysis+of+optimal+cutting+temperature+(OCT)+compound+removal+for+the+study+of+mammalian+proteomes.">Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes.</a> Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).</li><li>Holfeld, A., Vald&#233;s, A., Malmstr&#246;m, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+proteomic+workflow+for+mass+spectrometric+analysis+of+tissue+samples+preserved+by+different+methods.">Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).</li><li>Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteome+analysis+of+fresh+frozen+and+optimal+cutting+temperature+(OCT)+embedded+primary+non-small+cell+lung+carcinoma+by+LC-MS/MS.">Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS.</a> Methods. 81, 50-55 (2015).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+proteomics+using+chemical+immobilization+and+mass+spectrometry.">Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).</li></ol>

L'OCT è un comune agente di crioconservazione a lungo termine utilizzato nei biorepository. Tuttavia, l'OCT può provocare la soppressione ionica quando i tessuti vengono analizzati da varie piattaforme di spettrometria di massa12,13,14,15, o provocare la perdita di segnale quando i campioni vengono analizzati da LC-ESI-MS/MS 11. L'OCT nei tessuti crioconservati può an...

Gli sfingolipidi sono metaboliti bioattivi noti per il loro ruolo nel metabolismo umano e nella malattia 1,2. Regolano processi cellulari complessi come la migrazione cellulare, la sopravvivenza e la morte cellulare, il movimento cellulare, il traffico vescicolare, l'invasione cellulare e le metastasi, l'angiogenesi e la produzione di citochine 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . I difetti nella regolazione del metabolismo degli sfingolipidi contribuiscono all'inizio e alla progressione dei tumori, determinano quanto siano aggressivi i tumori e come i tumori rispondano e sviluppino resistenza alla terapia 3,10. Pertanto, a causa di questi ampi impatti sull'eziologia della malattia, i metodi analitici che possono stabilire con precisione le alterazioni degli sfingolipidi specifici della malattia sono strumenti importanti. La spettrometria di massa (MS) è il metodo più accurato e affidabile per analizzare le alterazioni degli sfingolipidi.
I campioni umani che possono essere utilizzati per l'analisi delle alterazioni degli sfingolipidi possono essere ottenuti prospetticamente dalla suite chirurgica o retrospettivamente dai biodepositi tissutali. I tessuti freschi della chirurgia sono vantaggiosi perché possono essere analizzati direttamente dalla SM o da altri metodi analitici. Tuttavia, l'acquisizione prospettica di tessuti presenta ostacoli amministrativi, tecnici e logistici e la raccolta di campioni sufficienti per raggiungere il potere statistico può essere difficile. Ottenere tessuti da biorepository è vantaggioso perché possono essere acquisiti retrospettivamente, in gran numero, e i biorepository confermano istologia e patologia, utilizzano procedure operative standard per conservare e conservare criogenicamente i tessuti e possono fornire dati clinicopatologici che possono essere utilizzati per analisi di correlazione. Tuttavia, per preservare le caratteristiche molecolari e strutturali, i biorepository possono crioconservare i tessuti incorporandoli in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT), che abbiamo dimostrato interferisce con i saggi di normalizzazione dei dati e la quantificazione degli sfingolipidi mediante cromatografia liquida elettrospray ionizzazione tandem spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS)11 . È stato inoltre dimostrato che l'alcol polivinilico e il glicole polietilenico, i componenti primari del composto OCT, determinano la soppressione ionica in altre piattaforme di analisi della SM12,13,14,15. Pertanto, il composto OCT deve essere rimosso dai tessuti prima dell'analisi sfingolipidomica mediante SM.
In un precedente rapporto, abbiamo convalidato un protocollo per la rimozione del composto OCT da campioni umani per l'analisi LC-ESI-MS/MS11 e la metodologia utilizzata per la pesatura dei tessuti per la normalizzazione dei dati11. Qui, descriviamo in dettaglio le fasi del protocollo di rimozione del composto OCT sfingolipidomico (sOCTrP) e mostriamo dati rappresentativi da tumori dell'adenocarcinoma polmonare umano e normali tessuti adiacenti non coinvolti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL polypropylene pipette tips</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to retrieve specimens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-116</td>
			<td>Used for tube and tissue weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Sciex Analyst 1.6.2</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software to analyze and integrate MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Scale that is accurate to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top dispenser</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-723071</td>
			<td>Used for dispensing solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2212</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#946;-glucosyl-sphing-4-eine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2511</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#223;-lactosyl-sphing-4-ene</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2512</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Sphingomyelin&#160; (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2312</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHLOROFORM OMNISOLV 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1054-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClickSeal Biocontainment Lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75007309</td>
			<td>To prevent biohazard aeresols during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conflikt</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>4101</td>
			<td>Decontaminant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTO-20A/20AC Column Oven</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine;&#160; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2000</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2144</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGU20A5R degasser</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes 13x100mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>13x100 mm screw top tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated water bath</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For overnight lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 150</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-167</td>
			<td>triturate tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-177</td>
			<td>for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>Laboratory grade tissue used to make wicks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS Grade 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0486-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexera LC-30 AD binary pump system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-502</td>
			<td>13x100 mm screw top tube caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>To retrieve specimens from tubes after washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4987000118</td>
			<td>To dispense LC-MS internal standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89239-020</td>
			<td>Autoinjector vial caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Thread Glass Vials with ID Patch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46610-724</td>
			<td>Autoinjector vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIL-30AC autoinjector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD2030P1220</td>
			<td>For drying solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53822-U</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-ESI-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model 2800</td>
			<td>for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For sOCTrP and resuspending dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729572</td>
			<td>13x100 glass culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Hipersolve Chromanorm LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis

Gli sfingolipidi sono componenti cellulari che hanno ruoli ben consolidati nel metabolismo umano e nella malattia. La spettrometria di massa può essere utilizzata per determinare se gli sfingolipidi sono alterati in una malattia e indagare se gli sfingolipidi possono essere mirati clinicamente. Tuttavia, studi prospettici adeguatamente alimentati che acquisiscono tessuti direttamente dalla suite chirurgica possono richiedere molto tempo e impegnativi dal punto di vista tecnico, logistico e amministrativo. Al contrario, gli studi retrospettivi possono trarre vantaggio da campioni umani crioconservati già disponibili, di solito in gran numero, presso i biodepositi tissutali. Altri vantaggi dell'approvvigionamento di tessuti da biorepository includono l'accesso alle informazioni associate ai campioni di tessuto, tra cui istologia, patologia e in alcuni casi variabili clinicopatologiche, che possono essere utilizzate per esaminare le correlazioni con i dati lipidomici. Tuttavia, le limitazioni tecniche legate all'incompatibilità del composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) utilizzato nella crioconservazione e nella spettrometria di massa rappresentano un ostacolo tecnico per l'analisi dei lipidi. Tuttavia, abbiamo precedentemente dimostrato che l'OCT può essere facilmente rimosso dai campioni di biorepository umani attraverso cicli di lavaggi e centrifugazione senza alterare il loro contenuto di sfingolipidi. Abbiamo anche precedentemente stabilito che gli sfingolipidi nei tessuti umani crioconservati nell'OCT sono stabili fino a 16 anni. In questo rapporto, delineiamo i passaggi e il flusso di lavoro per analizzare gli sfingolipidi nei campioni di tessuto umano incorporati nell'OCT, inclusi il lavaggio dei tessuti, la pesatura dei tessuti per la normalizzazione dei dati, l'estrazione dei lipidi, la preparazione di campioni per l'analisi mediante cromatografia liquida elettrospray ionizzazione tandem spettrometria di massa (LC-ESI-MS / MS), integrazione dei dati di spettrometria di massa, normalizzazione dei dati e analisi dei dati.

In questo protocollo, descriviamo in dettaglio un metodo per rimuovere l'OCT dai tessuti umani crioconservati e pesare i tessuti per l'analisi mediante LC-ESI-MS / MS. I materiali necessari per questa procedura sono elencati nella tabella dei materiali. Mostrati nella Figura 1 sono i risultati di un tipico esperimento in cui 10 tumori dell'adenocarcinoma polmonare umano e 10 tessuti normali adiacenti sono stati lavati per rimuovere l'OCT e analizzati da LC-ESI-MS / MS. È im...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Gli sfingolipidi sono metaboliti bioattivi con ruoli ben consolidati nelle malattie umane. La caratterizzazione delle alterazioni nei tessuti con spettrometria di massa può rivelare ruoli nell'eziologia della malattia o identificare bersagli terapeutici. Tuttavia, il composto OCT utilizzato per la crioconservazione nei biodepositi interferisce con la spettrometria di massa. Descriviamo metodi per analizzare gli sfingolipidi nei tessuti umani incorporati nell'OCT con LC-ESI-MS / MS.

Preparazione di tessuti umani incorporati in un composto di temperatura di taglio ottimale per l'analisi della spettrometria di massa

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

L'OCT è un agente di crioconservazione incompatibile con l'analisi di spettrometria di massa. Utilizzando questo protocollo, i ricercatori possono rimuovere l'OCT dai tessuti e quantificare gli sfingolipidi con la spettrometria di massa per cromatografia liquida tandem. La preparazione degli stoppini per l'essiccazione dei tessuti, il lavaggio dei tessuti e la pesatura dei tessuti saranno dimostrati da April Boyd della Virginia Commonwealth University, e l'estrazione dei lipidi sarà dimostrata dal Dr.Jeremy Allegood, direttore del Virginia Commonwealth Metabolomics and Lipidomics Core.Per iniziare, pulire le forbici chirurgiche immergendole nel metanolo per cinque minuti, seguite da pulirle con un tessuto pulito di laboratorio. Utilizzando guanti senza polvere, ruotare l'estremità di un tessuto di laboratorio per creare uno stoppino finemente affusolato lungo da 30 a 40 millimetri. Quindi usando le forbici pulite al metanolo, tagliare lo stoppino all'estremità spessa e metterlo in una scatola di cartone pulita.Quindi, utilizzando le forbici pulite a metanolo, tagliare da quattro a cinque millimetri dalla punta di una punta di pipetta da un millilitro e riposizionare la punta nel supporto della punta. Per lavare via l'OCT dai tessuti, aggiungere 10 millilitri di acqua deionizzata ultrapura ghiacciata a ciascun tubo contenente tessuto polmonare umano e coprirli ermeticamente. Lasciare incubare i tubi per 10 minuti.Vortice vigorosamente ogni tubo fino a quando tutto il tessuto depositato sulle pareti del tubo o del pellet di tessuto è completamente sospeso. Quindi centrifugare i tubi in una centrifuga a secchio oscillante pre-raffreddata a 4.000 a 5.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Una volta completata la centrifugazione, aprire i tubi sul ghiaccio.Aspirare con cura la soluzione di lavaggio, lasciando circa 0,5 millilitri di surnatante nel tubo, quindi ricapitolare il tubo. Dopo aver rimosso il surnatante da tutti i tubi, lavare i tessuti altre due volte nello stesso modo. Dopo i tre lavaggi di rimozione OCT, utilizzare la punta della pipetta accorciata preparata per aggiungere 500 microlitri di PBS ghiacciato al tubo.Utilizzando la stessa punta, risospendere delicatamente il pellet e trasferire tutto il tessuto risospeso in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri pre-etichettata e pre-pesata. Tenere il tubo sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni di tessuto sono trasferiti. Pellettare i tessuti centrifugando i tubi in una centrifuga pre-refrigerata, quindi aspirare con cura quanto più PBS possibile senza disturbare il pellet e riposizionare i tubi sul ghiaccio.Utilizzando gli stoppini di asciugatura del tessuto preparati in precedenza, rimuovere delicatamente qualsiasi soluzione di lavaggio rimanente, quindi chiudere il tubo e posizionarlo sul ghiaccio. Per pesare i tubi, posizionare un tubo alla volta in una bilancia analitica tarata tarata e azzerata di recente e chiudere lo sportello della camera. Una volta che il peso si è stabilizzato, registralo in un foglio di calcolo elettronico.Dopo la pesatura, riposizionare il tubo sul ghiaccio e aggiungere 300 microlitri di PBS ghiacciato. Utilizzando una punta di pipetta accorciata, trasferire con cura tutto il tessuto in due millilitri di metanolo ghiacciato in un tubo di vetro a vite preetichettato. Prima dell'estrazione dei lipidi, lasciare che i tessuti e gli standard lipidici interni della spettrometria di massa si equilibrino a temperatura ambiente per 20 minuti, quindi vortice e immergere le soluzioni standard interne in un bagno d'acqua ad ultrasuoni fino a quando gli standard lipidici non si sono completamente dissolti.Utilizzando una pipetta a ripetizione, aggiungere 250 picomoli degli standard di spettrometria di massa interna a ciascun tubo e ricapitolare leggermente i tubi. Per facilitare l'omogeneizzazione, regolare il volume di metanolo a due millilitri, quindi triturare il tessuto utilizzando un omogeneizzatore spostando la punta dell'omogeneizzatore con un movimento circolare premuto delicatamente contro la parete del tubo. Quando i grumi non sono più visibili, richiudere il tubo.Immergere il tubo con un angolo di 45 gradi in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 5-10 secondi. Quindi, sotto una cappa aspirante, aggiungere cloroformio e metanolo a ciascun tubo per ottenere un rapporto metanolo/cloroformio / acqua di due a uno a 0,1. Sigillare saldamente i tubi e lasciarli sul banco fino alla fine della giornata.Prima di partire quella sera, posizionare i tubi strettamente coperti in un bagno d'acqua a 48 gradi Celsius per un'incubazione notturna. Il giorno seguente, pellettare eventuali solventi e detriti solubili mediante centrifugazione. Quindi, in una cappa aspirante, decantare accuratamente il surnatante in provette di vetro borosilicato pre-etichettate da 13 a 100 millimetri inclinate con un angolo da 30 a 45 gradi per facilitare la decantazione.Dopo aver decantato il surnatante da tutti i tubi, utilizzare un concentratore di vuoto al massimo vuoto con una fase iniziale di riscaldamento di un'ora a 40 gradi Celsius per far evaporare tutto il solvente, quindi aggiungere 500 microlitri di metanolo a ciascun tubo. Per risospendere gli estratti lipidici essiccati, vortice il tubo per 5-10 secondi, quindi immergere il tubo in un bagno d'acqua ad ultrasuoni con un angolo di 45 gradi con rotazione per due minuti. Ri-vortice il tubo per cinque secondi e re-immergere nel bagno d'acqua ad ultrasuoni per un altro minuto.Rimuovere eventuali detriti insolubili mediante centrifugazione, quindi decantare il surnatante in una fiala di autoiniettore pre-etichettata inclinata con un angolo da 30 a 45 gradi per facilitare la decantazione. Chiudere saldamente i flaconcini prima di conservarli a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi. L'analisi della spettrometria di massa tandem a ionizzazione elettrospray per cromatografia liquida dopo la rimozione dell'OCT conferma che varie specie di ceramidi e monoesosil-ceramidi a lunghezza di catena sono significativamente elevate nei tumori dell'adenocarcinoma polmonare umano rispetto ai normali tessuti adiacenti non coinvolti.Gli standard degli sfingolipidi eluiscono sequenzialmente nel seguente ordine: d17: 1 sfingosina, d17: 1 sfingosina-1-fosfato, C12 lattosil-ceramide, C12 monoesosil-ceramide, C12 sfingomielina e C12 ceramide. Per ciascuna di queste specie di sfingolipidi, utilizzando le impostazioni del gradiente e della strumentazione nel testo, c'è uno spostamento positivo approssimativo di 0,15 minuti nel tempo di ritenzione per ogni aumento di due atomi di carbonio nella lunghezza della catena. Tuttavia, i lipidi a catena più lunga come C24 e C26 possono avere spostamenti di tempo di ritenzione maggiori.Inoltre, un doppio legame nell'acido grasso spesso si traduce in uno spostamento negativo di 0,15 minuti nel tempo di ritenzione. Pertanto, la ceramide C18: 1 avrà un tempo di ritenzione simile alla ceramide C16. Piuttosto che basarsi quasi esclusivamente su tessuti appena raccolti, questo protocollo espande le fonti di tessuto che possono essere utilizzate per l'analisi della spettrometria di massa per includere quelle criogenicamente conservate nei biorepository.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Immunohistochemia di fluorescenza a quattro colori delle sottopopolazioni delle cellule T in campioni di carcinoma a cellule squamose orofaringe umane incorporate in paraffina

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

Determinare la frequenza inibitorio ottimale per le cellule cancerose del tumore Uso Trattare Fields (TTFields)

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Elettroforesi bidimensionale accoppiata con spettrometria di massa per un'analisi del proteoma di tessuto umano Adenoma pituitario

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Fosfopeptide arricchimento accoppiata alla spettrometria di massa privo di etichetta quantitativa per indagare il Phosphoproteome nel carcinoma della prostata

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Colorazione elastica su vetrini di tessuto gastrico pT3N0M0 gastrico

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Analisi digitale dell'immunostaining delle proteine che interagiscono con la W10 nei tessuti polmonari umani

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Acquisizione di piccola molecola comunicazione tra tessuti e cellule mediante spettrometria di massa di Imaging

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Estrazione di metaboliti acquosi da cellule aderenti coltivate per l'analisi metabolomica mediante elettroforesi capillare-spettrometria di massa

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Preparazione dei mitocondri dai tessuti del cancro ovarico e dai tessuti ovarici di controllo per l'analisi quantitativa proteomica

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Valutazione della morte cellulare utilizzando un surnatante privo di cellule di probiotici in colture sferoidali tridimensionali di cellule tumorali del colon-retto

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...