Name: preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis
Uploaded: 2021-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

연구 프로젝트의 서비스 및 지원은 VCU Massey Cancer Center 조직 및 데이터 수집 및 분석 코어와 VCU 지질체학 및 대사체학 코어에서 제공했으며, 이는 NIH-NCI 암 센터 지원 보조금 P30CA016059의 자금으로 부분적으로 지원됩니다. 이 작업은 국립 보건원 보조금 R21CA232234 (산티아고 리마)의 지원을 받았습니다.

식별되지 않은 인간 폐 조직은 내부 검토 위원회(IRB) 승인 프로토콜(#HM2471)에 따라 버지니아 커먼웰스 대학교(VCU) 조직 및 데이터 수집 및 분석 코어에서 얻었습니다. 마우스 조직의 연구 및 수확을 위한 마우스의 사용은 VCU 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 재료 준비
알림: 이 단계는 티슈 세척 하루 전에 수행해야 합니다.
<...

<ol>
	<li>Maceyka, M., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolites+in+inflammatory+disease.">Sphingolipid metabolites in inflammatory disease.</a> Nature. 510, 58-67 (2014).</li><li>Ogretmen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolism+in+cancer+signalling+and+therapy.">Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Hla, T., Dannenberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+signaling+in+metabolic+disorders.">Sphingolipid signaling in metabolic disorders.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).</li><li>Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+and+Sphingosine+Kinase+1+involvement+in+endocytic+membrane+Trafficking.">Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).</li><li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+is+required+for+BECN1-+and+ATG5-dependent+cell+death+induced+by+sphingosine+kinase+1+inhibition.">TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition.</a> Autophagy. , 1-50 (2018).</li><li>Young, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+Kinase+1+cooperates+with+autophagy+to+maintain+endocytic+membrane+trafficking.">Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking.</a> Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).</li><li>Young, M. M., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+as+regulators+of+autophagy+and+endocytic+trafficking.">Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking.</a> Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+endocytosis+and+sphingosine+kinase+1+recruitment.">Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment.</a> Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).</li><li>Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).</li><li>Rohrbach, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+sphingolipid+analysis+of+tissues+embedded+in+optimal+cutting+temperature+compound.">A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound.</a> Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).</li><li>Weston, L. A., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+LC-MS/MS+analysis+of+optimal+cutting+temperature+(OCT)+compound+removal+for+the+study+of+mammalian+proteomes.">Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes.</a> Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).</li><li>Holfeld, A., Vald&#233;s, A., Malmstr&#246;m, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+proteomic+workflow+for+mass+spectrometric+analysis+of+tissue+samples+preserved+by+different+methods.">Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).</li><li>Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteome+analysis+of+fresh+frozen+and+optimal+cutting+temperature+(OCT)+embedded+primary+non-small+cell+lung+carcinoma+by+LC-MS/MS.">Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS.</a> Methods. 81, 50-55 (2015).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+proteomics+using+chemical+immobilization+and+mass+spectrometry.">Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).</li></ol>

OCT는 생물 저장소에 사용되는 일반적인 장기 냉동 보존제입니다. 그러나, OCT는 조직이 다양한 질량 분석 플랫폼(12,13,14,15)에 의해 분석될 때 이온 억제를 초래하거나, 샘플이 LC-ESI-MS/MS 11에 의해 분석될 때 신호의 손실을 초래할 수 있다. 동결 보존 조직의 OCT는 또한 Bradford 및 BCA<sup cl...

Sphingolipids는 인간 대사 및 질병 1,2에서 역할로 알려진 생리 활성 대사 산물입니다. 그들은 세포 이동, 세포 생존 및 죽음, 세포 이동, 수포 트래피킹, 세포 침윤 및 전이, 혈관 신생 및 사이토 카인 1,2,3,4,5,6,7,8,9 생성과 같은 복잡한 세포 과정을 조절합니다. . 스핑고지질 대사 조절의 결함은 암의 시작과 진행에 기여하고, 암이 얼마나 공격적인지, 암이 치료에 어떻게 반응하고 내성을 발달시키는지를 결정합니다3,10. 따라서 질병의 원인에 대한 이러한 광범위한 영향 때문에 질병 특이 적 스핑 고지 질 변화를 정확하게 확립 할 수있는 분석 방법이 중요한 도구입니다. 질량 분석법(MS)은 스핑고지질의 변화를 분석하는 가장 정확하고 신뢰할 수 있는 방법입니다.
스핑고지질 변화 분석에 사용할 수 있는 인간 표본은 수술실에서 전향적으로 또는 조직 생체 저장소에서 후향적으로 얻을 수 있습니다. 수술로 인한 신선한 조직은 MS 또는 다른 분석 방법으로 직접 분석 할 수 있기 때문에 유리합니다. 그러나 전향적으로 조직을 획득하는 것은 행정적, 기술적, 물류적 장애물이 있으며 통계적 검정력에 도달하기에 충분한 표본을 수집하는 것은 어려울 수 있습니다. 생물 저장소에서 조직을 얻는 것은 소급 적으로 대량으로 획득 할 수 있고 생물 저장소가 조직학 및 병리를 확인하고 표준 운영 절차를 사용하여 극저온 적으로 조직을 보존 및 저장하며 상관 분석에 사용할 수있는 임상 병리학 적 데이터를 제공 할 수 있기 때문에 유리합니다. 그러나 분자 및 구조적 특징을 보존하기 위해 생물 저장소는 조직을 최적 절단 온도(OCT) 화합물에 내장하여 조직을 냉동 보존할 수 있으며, 이는 데이터 정규화 분석 및 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량분석법(LC-ESI-MS/MS)에 의한 스핑고지질의 정량화를 방해하는 것으로 나타났습니다.11 . 또한 OCT 화합물의 주성분인 폴리비닐알코올과 폴리에틸렌글리콜이 다른 MS 분석 플랫폼12,13,14,15에서 이온 억제를 초래하는 것으로 나타났습니다. 따라서 OCT 화합물은 MS에 의한 스핑고지혈증 분석 전에 조직에서 제거되어야 합니다.
이전 보고서에서 우리는 LC-ESI-MS/MS 분석11 을 위해 인간 표본에서 OCT 화합물을 제거하기 위한 프로토콜과 데이터 정규화11을 위해 조직 칭량에 사용되는 방법론을검증했습니다. 여기에서는 스핑고지혈증성 OCT 화합물 제거 프로토콜(sOCTrP)의 단계를 자세히 설명하고 인간 폐 선암 종양 및 정상 인접 비관련 조직의 대표 데이터를 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL polypropylene pipette tips</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to retrieve specimens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-116</td>
			<td>Used for tube and tissue weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Sciex Analyst 1.6.2</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software to analyze and integrate MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Scale that is accurate to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top dispenser</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-723071</td>
			<td>Used for dispensing solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2212</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#946;-glucosyl-sphing-4-eine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2511</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#223;-lactosyl-sphing-4-ene</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2512</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Sphingomyelin&#160; (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2312</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHLOROFORM OMNISOLV 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1054-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClickSeal Biocontainment Lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75007309</td>
			<td>To prevent biohazard aeresols during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conflikt</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>4101</td>
			<td>Decontaminant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTO-20A/20AC Column Oven</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine;&#160; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2000</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2144</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGU20A5R degasser</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes 13x100mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>13x100 mm screw top tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated water bath</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For overnight lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 150</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-167</td>
			<td>triturate tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-177</td>
			<td>for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>Laboratory grade tissue used to make wicks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS Grade 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0486-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexera LC-30 AD binary pump system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-502</td>
			<td>13x100 mm screw top tube caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>To retrieve specimens from tubes after washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4987000118</td>
			<td>To dispense LC-MS internal standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89239-020</td>
			<td>Autoinjector vial caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Thread Glass Vials with ID Patch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46610-724</td>
			<td>Autoinjector vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIL-30AC autoinjector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD2030P1220</td>
			<td>For drying solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53822-U</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-ESI-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model 2800</td>
			<td>for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For sOCTrP and resuspending dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729572</td>
			<td>13x100 glass culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Hipersolve Chromanorm LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis

Sphingolipids는 인간의 신진 대사와 질병에서 잘 확립 된 역할을하는 세포 구성 요소입니다. 질량 분석법은 스핑고지질이 질병에서 변경되었는지 여부를 결정하고 스핑고지질이 임상적으로 표적화될 수 있는지 여부를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 수술실에서 직접 조직을 획득하는 적절하게 전원이 공급되는 전향적 연구는 시간이 많이 걸리고 기술적, 물류적, 행정적으로 어려울 수 있습니다. 대조적으로, 후향적 연구는 조직 생물 저장소에서 이미 많은 수의 냉동 보존된 인간 표본을 활용할 수 있습니다. 생물 저장소에서 조직을 조달하는 다른 이점은 조직학, 병리학 및 일부 경우 임상 병리학 변수를 포함하여 조직 표본과 관련된 정보에 대한 액세스를 포함하며, 이들 모두는 지질체학 데이터와의 상관 관계를 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 동결보존 및 질량분석에 사용되는 최적 절단 온도 화합물(OCT)의 비호환성과 관련된 기술적 한계는 지질 분석의 기술적 장벽입니다. 그러나 우리는 이전에 OCT가 스핑고지질 함량을 변경하지 않고 세척 및 원심분리의 주기를 통해 인간 생물 저장소 표본에서 쉽게 제거될 수 있음을 보여주었습니다. 우리는 또한 이전에 OCT에서 동결 보존 된 인간 조직의 스핑 고지 질이 최대 16 년 동안 안정적이라는 것을 확립했습니다. 이 보고서에서는 조직 세척, 데이터 정규화를 위한 조직 칭량, 지질 추출, 액체 크로마토그래피 전기분무 이온화 탠덤 질량분석법(LC-ESI-MS/MS)으로 분석할 샘플 준비, 질량분석법 데이터 통합, 데이터 정규화 및 데이터 분석을 포함하여 OCT에 내장된 인체 조직 표본에서 스핑고지질을 분석하는 단계와 워크플로를 간략하게 설명합니다.

이 프로토콜에서는 냉동 보존된 인간 조직에서 OCT를 제거하고 LC-ESI-MS/MS로 분석하기 위해 조직의 무게를 측정하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 절차에 필요한 재료는 재료 표에 나열되어 있습니다. 도 1 에 도시된 것은 10개의 인간 폐 선암 종양과 10개의 정상 인접 조직을 세척하여 OCT를 제거하고 LC-ESI-MS/MS로 분석한 전형적인 실험의 결과이다. 중요하게도, 우?...

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Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

스핑 고지 질은 인간 질병에서 잘 확립 된 역할을 가진 생리 활성 대사 산물입니다. 질량 분석법으로 조직의 변화를 특성화하면 질병 병인학에서 역할을 밝히거나 치료 표적을 식별할 수 있습니다. 그러나 생물 저장소에서 냉동 보존에 사용되는 OCT 화합물은 질량 분석을 방해합니다. OCT에 내장된 인간 조직의 스핑고지질을 LC-ESI-MS/MS로 분석하는 방법을 간략하게 설명합니다.

질량분석 분석을 위한 최적의 절단 온도 화합물에 내장된 인체 조직의 준비

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

OCT는 질량 분석과 호환되지 않는 저온 보존제입니다. 이 프로토콜을 사용하여 연구원들은 조직에서 OCT를 제거하고 탠덤 액체 크로마토그래피 질량분석법으로 스핑고지질을 정량화할 수 있습니다. 조직 건조 심지, 조직 세척 및 조직 칭량의 준비는 버지니아 커먼 웰스 대학의 April Boyd가 시연하고 지질 추출은 버지니아 커먼 웰스 대사체학 및 지질체학 코어의 책임자 인 Jeremy Allegood 박사가 시연합니다.시작하려면 수술 용 가위를 메탄올에 5 분 동안 담가 닦은 다음 깨끗한 실험실 등급 티슈로 닦으십시오. 파우더가 없는 장갑을 사용하여 실험실 등급 티슈의 끝을 빙글빙글 돌려 30-40mm 길이의 미세하게 가늘어진 심지를 만듭니다. 그런 다음 메탄올로 청소 한 가위를 사용하여 두꺼운 끝 부분의 심지를 자르고 깨끗한 판지 상자에 넣으십시오.다음으로, 메탄올 세척 가위를 사용하여 1 밀리리터 피펫 팁의 끝에서 4-5 밀리미터를 자르고 팁을 팁 홀더에 다시 놓습니다. 조직에서 OCT를 씻어 내려면 인간의 폐 조직이 들어있는 각 튜브에 얼음처럼 차가운 초순수 탈 이온수 10 밀리리터를 넣고 단단히 덮으십시오. 튜브를 10 분 동안 배양하십시오.튜브 또는 조직 펠릿의 벽에 침착된 모든 조직이 완전히 재부유될 때까지 각 튜브를 격렬하게 소용돌이합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 10 분 동안 4, 000에서 5, 000 배 G에서 사전 냉각 된 스윙 버킷 원심 분리기에서 튜브를 원심 분리합니다. 원심분리가 완료되면 얼음 위의 튜브의 뚜껑을 풉니다.세척 용액을 조심스럽게 흡인하여 튜브에 약 0.5 밀리리터의 상청액을 남긴 다음 튜브를 다시 덮습니다. 모든 튜브에서 상청액을 제거한 후 동일한 방법으로 조직을 두 번 더 씻으십시오. 세 번의 OCT 제거 세척 후 준비된 단축 피펫 팁을 사용하여 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 튜브에 추가합니다.동일한 팁을 사용하여 펠릿을 부드럽게 재현탁하고 재현 된 모든 조직을 사전 라벨링되고 사전 무게가 측정 된 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 모든 조직 샘플이 옮겨 질 때까지 튜브를 얼음 위에 두십시오. 사전 냉각된 원심분리기에서 튜브를 원심분리하여 조직을 펠릿화한 다음 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 PBS를 조심스럽게 흡입하고 튜브를 다시 얼음 위에 놓습니다.앞서 준비한 티슈 건조 심지를 사용하여 남아 있는 세척액을 부드럽게 제거한 다음 튜브를 닫고 얼음 위에 놓습니다. 튜브를 칭량하려면 최근에 보정된 타르 및 영점 분석 저울에 한 번에 하나의 튜브를 놓고 챔버 도어를 닫습니다. 무게가 안정되면 전자 스프레드 시트에 기록하십시오.칭량 후 튜브를 얼음 위에 다시 놓고 300마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 추가합니다. 단축 된 피펫 팁을 사용하여 모든 조직을 미리 라벨이 붙은 스크류 탑 유리 튜브에 2 밀리리터의 얼음처럼 차가운 메탄올로 조심스럽게 옮깁니다. 지질 추출 전에 조직 및 질량 분석법 내부 지질 표준물이 20분 동안 실온과 평형을 이루도록 한 다음 지질 표준물이 완전히 용해될 때까지 내부 표준 용액을 초음파 수조에 와동시키고 담그십시오.반복 피펫을 사용하여 내부 질량 분석 표준물질의 피코몰 250개를 각 튜브에 추가하고 튜브를 가볍게 다시 닫습니다. 균질화를 용이하게하기 위해, 메탄올의 부피를 2 밀리리터로 조정 한 다음, 튜브 벽에 부드럽게 눌려진 원형 운동으로 균질 기 팁을 움직여 균질 기를 사용하여 조직을 분쇄한다. 덩어리가 더 이상 보이지 않으면 튜브를 다시 덮으십시오.튜브를 초음파 수조에 45도 각도로 5-10 초 동안 담그십시오. 그런 다음 흄 후드 아래에서 각 튜브에 클로로포름과 메탄올을 추가하여 메탄올 대 클로로포름 대 물 비율이 2 대 1 대 0.1입니다. 튜브를 단단히 밀봉하고 하루가 끝날 때까지 벤치 탑에 두십시오.그날 저녁 떠나기 전에 단단히 덮인 튜브를 섭씨 48도의 수조에 넣어 밤새 배양합니다. 다음날, 원심분리를 통해 용매와 용해성 파편을 펠릿화합니다. 그런 다음 흄 후드에서 상청액을 미리 라벨링된 13으로 조심스럽게 디캔팅하여 디캔팅을 용이하게 하기 위해 30-45도 각도로 기울어진 100mm 붕규산 유리 시험관으로 기울입니다.모든 튜브에서 상청액을 디캔팅한 후 섭씨 40도에서 초기 1시간 가열 단계와 함께 최대 진공에서 진공 농축기를 사용하여 모든 용매를 증발시킨 다음 각 튜브에 500마이크로리터의 메탄올을 추가합니다. 건조된 지질 추출물을 재현탁하려면 튜브를 5-10초 동안 와동시킨 다음 튜브를 45도 각도로 초음파 수조에 2분 동안 회전시킵니다. 튜브를 5 초 동안 다시 소용돌이 치고 초음파 수조에 1 분 더 담그십시오.원심분리에 의해 임의의 불용성 파편을 제거하고, 디캔팅을 용이하게 하기 위해 30 내지 45도 각도로 기울어진 사전 라벨링된 자동주입기 바이알에 상청액을 디캔팅한다. 분석될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하기 전에 바이알을 단단히 덮으십시오. OCT 제거 후 액체 크로마토 그래피 전기 분무 이온화 탠덤 질량 분석법 분석은 다양한 사슬 길이의 세라마이드 및 모노 헥 소실-세라마이드가 정상적인 인접 비 관련 조직에 비해 인간 폐 선암 종양에서 유의하게 상승한다는 것을 확인합니다.스핑고지질 표준물질은 d17:1 스핑고신, d17:1 스핑고신-1-포스페이트, C12 락토실-세라마이드, C12 모노헥소실-세라마이드, C12 스핑고미엘린 및 C12 세라마이드의 순서로 순차적으로 용리됩니다. 이러한 스핑고지질 종 각각에 대해 텍스트의 기울기 및 계측 설정을 사용하면 사슬 길이가 두 번 증가할 때마다 머무름 시간이 대략 0.15분 정도 이동합니다. 그러나 C24 및 C26과 같은 더 긴 사슬 길이의 지질은 머무름 시간 이동이 더 클 수 있습니다.또한, 지방산의 이중 결합은 종종 머무름 시간의 음의 0.15 분 변화를 초래합니다. 따라서 C18:1 세라마이드는 C16 세라마이드와 유사한 머무름 시간을 갖습니다. 이 프로토콜은 거의 독점적으로 새로 수집된 조직에 의존하는 대신 질량 분석에 사용할 수 있는 조직 소스를 확장하여 생물 저장소에 극저온으로 저장된 조직을 포함합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

포르말린 - 고정, 파라핀 - 임베디드 인간 구강 성 편평 세포 암종 샘플에서의 T 세포 아군의 4 색 형광 면역 조직 화학

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

연구

암 연구학

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

필드를 치료 종양을 사용하여 암 세포에 대한 최적의 억제 주파수 (TTFields를) 결정

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

2 차원 젤 전기 이동 법 질량 분석 방법으로 인간의 뇌 Adenoma 조직 프로테옴의 분석에 대 한 결합

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

전립선 암에 있는 Phosphoproteome를 조사 하기 위해 양적 라벨 무료 질량 분석으로 결합 된 Phosphopeptide 농축

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

pT3N0M0 위암 조직의 파라핀 내장 슬라이드에 탄성 염색

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

인간 폐 조직에서 ZW10 상호 작용 단백질의 면역 염색의 디지털 분석

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

조직 및 질량 분석 이미징 사용 하 여 셀 사이의 작은 분자 통신 캡처

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

모 세관 전기 영동-질량 분 광 법에의 한 대사체학 분석을 위해 배양 된 부착 세포 로부터 수성 대사 산물의 추출

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

난소암 조직에서 미토콘드리아의 준비 및 정량적 프로테오믹스 분석을 위한 난소 조직 제어

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

대장암세포의 3차원 스페로이드 배양에서 프로바이오틱스의 세포없는 슈퍼네탄을 사용하여 세포 사멸 평가

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...