Name: preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis
Uploaded: 2021-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Tjenester og støtte til forskningsprosjektet ble levert av VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core og VCU Lipidomics and Metabolomics Core, som støttes delvis med finansiering fra NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago Lima).

Avidentifisert humant lungevev ble hentet fra Virginia Commonwealth University (VCU) Tissue and Data Acquisition and Analysis Core under en intern gjennomgangstavle (IRB) godkjent protokoll (#HM2471). Bruken av mus til forskning og høsting av musevev ble godkjent av VCU institutional animal care and use committee (IACUC).
1. Forberedelse av materialer
MERK: Disse trinnene bør utføres en dag før vevsvasken.
<ol><li>Formerke og veie 1,5 ml polypropylensentrifuge...

<ol>
	<li>Maceyka, M., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolites+in+inflammatory+disease.">Sphingolipid metabolites in inflammatory disease.</a> Nature. 510, 58-67 (2014).</li><li>Ogretmen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolism+in+cancer+signalling+and+therapy.">Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Hla, T., Dannenberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+signaling+in+metabolic+disorders.">Sphingolipid signaling in metabolic disorders.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).</li><li>Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+and+Sphingosine+Kinase+1+involvement+in+endocytic+membrane+Trafficking.">Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).</li><li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+is+required+for+BECN1-+and+ATG5-dependent+cell+death+induced+by+sphingosine+kinase+1+inhibition.">TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition.</a> Autophagy. , 1-50 (2018).</li><li>Young, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+Kinase+1+cooperates+with+autophagy+to+maintain+endocytic+membrane+trafficking.">Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking.</a> Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).</li><li>Young, M. M., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+as+regulators+of+autophagy+and+endocytic+trafficking.">Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking.</a> Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+endocytosis+and+sphingosine+kinase+1+recruitment.">Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment.</a> Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).</li><li>Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).</li><li>Rohrbach, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+sphingolipid+analysis+of+tissues+embedded+in+optimal+cutting+temperature+compound.">A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound.</a> Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).</li><li>Weston, L. A., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+LC-MS/MS+analysis+of+optimal+cutting+temperature+(OCT)+compound+removal+for+the+study+of+mammalian+proteomes.">Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes.</a> Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).</li><li>Holfeld, A., Vald&#233;s, A., Malmstr&#246;m, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+proteomic+workflow+for+mass+spectrometric+analysis+of+tissue+samples+preserved+by+different+methods.">Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).</li><li>Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteome+analysis+of+fresh+frozen+and+optimal+cutting+temperature+(OCT)+embedded+primary+non-small+cell+lung+carcinoma+by+LC-MS/MS.">Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS.</a> Methods. 81, 50-55 (2015).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+proteomics+using+chemical+immobilization+and+mass+spectrometry.">Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).</li></ol>

OCT er et vanlig langsiktig kryo-bevaringsmiddel som brukes i biorepositorier. OCT kan imidlertid resultere i ioneundertrykkelse når vev analyseres av forskjellige massespektrometriplattformer12,13,14,15, eller resultere i tap av signal når prøver analyseres av LC-ESI-MS / MS 11. OCT i kryopreservert vev kan også forstyrre vevsnormaliseringsmetoder som veiing og prot...

Sfingolipider er bioaktive metabolitter kjent for sine roller i human metabolisme og sykdom 1,2. De regulerer komplekse cellulære prosesser som cellemigrasjon, celleoverlevelse og død, cellebevegelse, vesikulær handel, cellulær invasjon og metastase, angiogenese og produksjon av cytokiner 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defekter i reguleringen av sfingolipidmetabolisme bidrar til initiering og progresjon av kreft, bestemmer hvor aggressive kreftformer er, og hvordan kreft reagerer på og utvikler motstand mot terapi 3,10. Derfor, på grunn av disse brede effektene på sykdommens etiologi, er analytiske metoder som nettopp kan etablere sykdomsspesifikke sfingolipidendringer, viktige verktøy. Massespektrometri (MS) er den mest nøyaktige og pålitelige metoden for å analysere sfingolipidendringer.
Humane prøver som kan brukes til analyse av sfingolipidendringer, kan oppnås prospektivt fra kirurgisk suite eller retrospektivt fra vevsbiorepositorier. Friskt vev fra kirurgi er fordelaktig fordi de kan analyseres direkte ved MS eller andre analysemetoder. Imidlertid har anskaffelse av vev prospektivt administrative, tekniske og logistiske hindringer, og det kan være utfordrende å samle tilstrekkelige prøver for å nå statistisk styrke. Innhenting av vev fra biorepositorier er fordelaktig fordi de kan anskaffes retrospektivt, i stort antall, og biorepositorier bekrefter histologi og patologi, bruker standard operasjonsprosedyrer for å kryogenisk bevare og lagre vev, og kan gi kliniskpatologiske data som kan brukes til korrelasjonsanalyser. For å bevare molekylære og strukturelle egenskaper kan biorepositorier imidlertid kryopreservere vev ved å legge dem inn i optimal skjæretemperatur (OCT) forbindelse, som vi har vist forstyrrer datanormaliseringsanalyser og kvantifisering av sfingolipider ved væskekromatografi elektrosprayionisering tandem massespektrometri (LC-ESI-MS / MS)11 . Det har også vist seg at polyvinylalkohol og polyetylenglykol, de primære komponentene i OCT-forbindelsen, resulterer i ionundertrykkelse i andre MS-analyseplattformer12,13,14,15. Derfor må OCT-forbindelsen fjernes fra vev før sfingolipidomisk analyse ved MS.
I en tidligere rapport har vi validert en protokoll for fjerning av OCT-forbindelse fra humane prøver for LC-ESI-MS / MS-analyse11 og metoden som brukes for veiing av vev for datanormalisering11. Her beskriver vi trinnene i den sfingolipidomiske OCT-forbindelsesfjerningsprotokollen (sOCTrP) og viser representative data fra humane lungeadenokarsinomtumorer og normale tilstøtende uinvolverte vev.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL polypropylene pipette tips</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to retrieve specimens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-116</td>
			<td>Used for tube and tissue weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Sciex Analyst 1.6.2</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software to analyze and integrate MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Scale that is accurate to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top dispenser</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-723071</td>
			<td>Used for dispensing solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2212</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#946;-glucosyl-sphing-4-eine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2511</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#223;-lactosyl-sphing-4-ene</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2512</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Sphingomyelin&#160; (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2312</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHLOROFORM OMNISOLV 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1054-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClickSeal Biocontainment Lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75007309</td>
			<td>To prevent biohazard aeresols during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conflikt</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>4101</td>
			<td>Decontaminant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTO-20A/20AC Column Oven</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine;&#160; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2000</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2144</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGU20A5R degasser</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes 13x100mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>13x100 mm screw top tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated water bath</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For overnight lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 150</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-167</td>
			<td>triturate tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-177</td>
			<td>for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>Laboratory grade tissue used to make wicks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS Grade 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0486-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexera LC-30 AD binary pump system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-502</td>
			<td>13x100 mm screw top tube caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>To retrieve specimens from tubes after washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4987000118</td>
			<td>To dispense LC-MS internal standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89239-020</td>
			<td>Autoinjector vial caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Thread Glass Vials with ID Patch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46610-724</td>
			<td>Autoinjector vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIL-30AC autoinjector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD2030P1220</td>
			<td>For drying solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53822-U</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-ESI-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model 2800</td>
			<td>for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For sOCTrP and resuspending dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729572</td>
			<td>13x100 glass culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Hipersolve Chromanorm LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis

Sfingolipider er cellulære komponenter som har veletablerte roller i menneskelig metabolisme og sykdom. Massespektrometri kan brukes til å bestemme om sfingolipider endres i en sykdom og undersøke om sfingolipider kan målrettes klinisk. Imidlertid kan riktig drevne prospektive studier som anskaffer vev direkte fra kirurgisk suite være tidkrevende og teknisk, logistisk og administrativt utfordrende. I motsetning til dette kan retrospektive studier dra nytte av kryopreserverte menneskelige prøver som allerede er tilgjengelige, vanligvis i stort antall, ved vevsbiorepositorier. Andre fordeler ved å anskaffe vev fra biorepositorier inkluderer tilgang til informasjon knyttet til vevsprøver, inkludert histologi, patologi og i noen tilfeller kliniskpatologiske variabler, som alle kan brukes til å undersøke korrelasjoner med lipidomikkdata. Imidlertid er tekniske begrensninger knyttet til inkompatibiliteten til optimal skjæretemperaturforbindelse (OCT) som brukes i kryopreservering og massespektrometri en teknisk barriere for analyse av lipider. Imidlertid har vi tidligere vist at OCT lett kan fjernes fra humane biorepository prøver gjennom sykluser av vasker og sentrifugering uten å endre deres sfingolipidinnhold. Vi har også tidligere fastslått at sfingolipider i humant vev kryopreservert i OCT er stabile i opptil 16 år. I denne rapporten skisserer vi trinnene og arbeidsflyten for å analysere sfingolipider i humane vevsprøver som er innebygd i OCT, inkludert vasking av vev, veiing av vev for datanormalisering, ekstraksjon av lipider, fremstilling av prøver for analyse ved væskekromatografi elektrosprayionisering tandemmassespektrometri (LC-ESI-MS / MS), massespektrometridataintegrasjon, datanormalisering og dataanalyse.

I denne protokollen beskriver vi i detalj en metode for å fjerne OCT fra kryokonservert menneskelig vev og veie vevet for analyse av LC-ESI-MS / MS. Materialene som kreves for denne prosedyren er oppført i materialtabell. Vist i figur 1 er resultater av et typisk eksperiment der 10 humane lungeadenokarsinomtumorer og 10 normale tilstøtende vev ble vasket for å fjerne OCT og analysert av LC-ESI-MS / MS. Viktigere, som vi tidligere har vist11, er de...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Sfingolipider er bioaktive metabolitter med veletablerte roller i human sykdom. Karakterisering av endringer i vev med massespektrometri kan avsløre roller i sykdomsetiologi eller identifisere terapeutiske mål. Imidlertid forstyrrer OCT-forbindelsen som brukes til kryopreservering i biorepositorier massespektrometri. Vi skisserer metoder for å analysere sfingolipider i humant vev innebygd i OCT med LC-ESI-MS / MS.

Fremstilling av menneskelig vev innebygd i optimal skjæretemperaturforbindelse for massespektrometrianalyse

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

OCT er et kryokonserveringsmiddel som er uforenlig med massespektrometrianalyse. Ved hjelp av denne protokollen kan forskere fjerne OCT fra vev og kvantifisere sfingolipider med tandem væskekromatografi massespektrometri. Fremstillingen av vevstørkeveker, vevsvask og vevsveiing vil bli demonstrert av April Boyd fra Virginia Commonwealth University, og lipidekstraksjonen vil bli demonstrert av Dr.Jeremy Allegood, direktør for Virginia Commonwealth Metabolomics og Lipidomics Core.For å begynne, rengjør kirurgisk saks ved å senke dem i metanol i fem minutter, etterfulgt av å tørke dem med et rent laboratorievev. Bruk pulverfrie hansker til å snurre enden av et vev av laboratoriekvalitet for å lage en finkonisk 30 til 40 millimeter lang veke. Bruk deretter den metanolrensede saksen, klipp veken i den tykke enden og legg den i en ren pappkasse.Deretter klipper du fire til fem millimeter av tuppen på en milliliter pipettespiss ved hjelp av den metanolrensede saksen og plasserer spissen tilbake i spissholderen. For å vaske bort OCT fra vevet, tilsett 10 milliliter iskaldt ultrarent avionisert vann til hvert rør som inneholder menneskelig lungevev og dekk dem tett. La rørene inkubere i 10 minutter.Vortex hvert rør kraftig til alt vevet som er avsatt på rørets vegger eller vevpelleten er fullstendig resuspendert. Sentrifuger deretter rørene i en forkjølt svingende bøtte sentrifuge ved 4.000 til 5.000 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Når sentrifugeringen er fullført, løsner du rørene på is.Aspirer vaskeoppløsningen forsiktig, og la ca. 0,5 ml av supernatanten ligge i røret, og hopp deretter røret på nytt. Etter å ha fjernet supernatanten fra alle rør, vask vevet to ganger til på samme måte. Etter de tre OCT-fjerningsvaskene, bruk den tilberedte forkortede pipettespissen for å tilsette 500 mikroliter iskald PBS til røret.Bruk samme spiss, forsiktig resuspend pelleten og overfør alt det resuspended vevet til et forhåndsmerket og forhåndsveid 1,5 milliliter sentrifugerør. Hold røret på is til alle vevsprøvene er overført. Pellet vevet ved å sentrifugere rørene i en forkjølt sentrifuge, aspirer deretter forsiktig så mye av PBS som mulig uten å forstyrre pelleten og legg rørene tilbake på is.Bruk vevstørkevekene som er tilberedt tidligere, fjern forsiktig gjenværende vaskeoppløsning, lukk deretter røret og legg det på is. For å veie rørene, plasser ett rør om gangen i en nylig kalibrert tared og nullet analytisk balanse og lukk kammerdøren. Når vekten har stabilisert seg, registrer den i et elektronisk regneark.Etter veiing, legg røret tilbake på is og tilsett 300 mikroliter iskald PBS. Ved hjelp av en forkortet pipettespiss overfører du forsiktig alt vev til to milliliter iskald metanol i et forhåndsmerket skrueglassrør. Før lipidekstraksjon, la vev og massespektrometri interne lipidstandarder balansere til romtemperatur i 20 minutter, deretter hvirvel og fordyp de interne standardløsningene i et ultralydvannbad til lipidstandardene er fullstendig oppløst.Ved hjelp av en repeterende pipette, legg til 250 picomoles av de interne massespektrometristandardene til hvert rør og lett oppsummere rørene. For å lette homogenisering, juster volumet av metanol til to milliliter, og triturer deretter vevet ved hjelp av en homogenisator ved å flytte homogenisatorspissen i en sirkulær bevegelse forsiktig presset mot rørveggen. Når klumper ikke lenger er synlige, må du dekke røret på nytt.Senk røret i en 45 graders vinkel i et ultralydvannbad i 5 til 10 sekunder. Deretter tilsettes kloroform og metanol til hvert rør under en avtrekkshette for å oppnå et metanol til kloroform til vannforhold på to til en til 0,1. Forsegl rørene tett og la dem ligge på benken til slutten av dagen.Før du drar den kvelden, plasser de tett kappede rørene i et 48 grader Celsius vannbad for en inkubasjon over natten. Neste dag, pellet noe løsningsmiddel og løselig rusk ved sentrifugering. Deretter dekanteres supernatanten forsiktig i en avtrekkshette til forhåndsmerkede 13 til 100 millimeter borosilikatglassreagensrør vippet i en 30 til 45 graders vinkel for å lette dekanteringen.Etter å ha dekantert supernatanten fra alle rør, bruk en vakuumkonsentrator ved maksimalt vakuum med et første en times oppvarmingstrinn ved 40 grader Celsius for å fordampe alt løsningsmiddel, og tilsett deretter 500 mikroliter metanol til hvert rør. For å resuspendere de tørkede lipidekstraktene, hvirvel røret i 5 til 10 sekunder, og senk deretter røret i et ultralydvannbad i en 45 graders vinkel med rotasjon i to minutter. Re-vortex røret i fem sekunder og re-nedsenk i ultralyd vannbad i et ekstra minutt.Fjern uoppløselig rusk ved sentrifugering, og dekanter deretter supernatanten i et forhåndsmerket autoinjektorhetteglass vippet i en 30 til 45 graders vinkel for å lette dekanteringen. Sett hetteglassene godt på før de oppbevares ved minus 80 grader Celsius frem til analyse. Væskekromatografi elektrosprayionisering tandem massespektrometrianalyse etter OCT-fjerning bekrefter at forskjellige kjedelengdearter av ceramider og monoheksosyl-ceramider er signifikant forhøyet i humane lungeadenokarsinomtumorer sammenlignet med normale tilstøtende ikke-involverte vev.Sfingolipidstandarder eluerer sekvensielt i følgende rekkefølge: d17: 1 sfingosin, d17: 1 sfingosin-1-fosfat, C12 laktosyl-ceramid, C12 monoheksosyl-ceramid, C12 sfingomyelin og C12 ceramid. For hver av disse sfingolipidartene, ved hjelp av gradient- og instrumenteringsinnstillingene i teksten, er det en omtrentlig positiv 0,15 minutters forskyvning i retensjonstiden for hver to karbonøkning i kjedelengde. Imidlertid kan lengre kjedelengde lipider som C24 og C26 ha større retensjonstidsforskyvninger.Videre resulterer en dobbeltbinding i fettsyren ofte i et negativt 0,15 minutters skift i retensjonstid. Dermed vil C18:1 ceramid ha en retensjonstid som ligner på C16 ceramid. I stedet for å stole nesten utelukkende på nyoppsamlet vev, utvider denne protokollen vevskildene som kan brukes til massespektrometrianalyse for å inkludere de kryogenisk lagret ved biorepositorier.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Fargelysfluorescensimmunohistokjemi av T-celle-subpopulasjoner i Archival Formalin-fikserte, paraffin-innebygde humane Orofaryngeale Squamous Cell Karsinomeksempler

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

Bestemme Optimal Hemmende Frekvens for kreftceller Bruke Tumor Behandling av Fields (TTFields)

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Todimensjonal Gel geleelektroforese kombinert med massespektrometri metoder for en analyse av menneskelige hypofysen adenom vev proteom

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide berikelse kombinert med etikett-fri kvantitative massespektrometri å undersøke Phosphoproteome i prostatakreft

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastisk farging på parafin-embedded lysbilder av pT3N0M0 magekreft vev

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Digital analyse av Immunostaining av ZW10 samspill protein i Human Lung vev

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Fange små molekyl kommunikasjon mellom vev og celler ved hjelp av Imaging massespektrometri

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Ekstraksjon av vandig metabolitter fra kultivert tilhenger Cells for Metabolomic analyse av kapillær elektroforese-Mass massespektrometri

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Utarbeidelse av mitokondrier fra eggstokkene Cancer vev og kontroll eggstokkene vev for kvantitativ Proteomikk analyse

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering av celledød ved hjelp av cellefri supernatant av probiotika i tredimensjonale sfæroidkulturer av kolorektale kreftceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...