Name: preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis
Uploaded: 2021-04-27T15:00:00
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Os serviços e o apoio ao projeto de pesquisa foram fornecidos pelo VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core e pelo VCU Lipidomics and Metabolomics Core, que são apoiados em parte com financiamento do NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde Grants R21CA232234 (Santiago Lima).

Tecidos pulmonares humanos não identificados foram obtidos do Núcleo de Aquisição e Análise de Tecidos e Dados da Virginia Commonwealth University (VCU) sob um protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Interna (IRB) (#HM2471). O uso de camundongos para pesquisa e colheita de tecidos de camundongos foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da VCU (IACUC).
1. Preparação de materiais
NOTA: Estas etapas devem ser realizadas um dia ante...

<ol>
	<li>Maceyka, M., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolites+in+inflammatory+disease.">Sphingolipid metabolites in inflammatory disease.</a> Nature. 510, 58-67 (2014).</li><li>Ogretmen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolism+in+cancer+signalling+and+therapy.">Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Hla, T., Dannenberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+signaling+in+metabolic+disorders.">Sphingolipid signaling in metabolic disorders.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).</li><li>Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+and+Sphingosine+Kinase+1+involvement+in+endocytic+membrane+Trafficking.">Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).</li><li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+is+required+for+BECN1-+and+ATG5-dependent+cell+death+induced+by+sphingosine+kinase+1+inhibition.">TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition.</a> Autophagy. , 1-50 (2018).</li><li>Young, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+Kinase+1+cooperates+with+autophagy+to+maintain+endocytic+membrane+trafficking.">Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking.</a> Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).</li><li>Young, M. M., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+as+regulators+of+autophagy+and+endocytic+trafficking.">Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking.</a> Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+endocytosis+and+sphingosine+kinase+1+recruitment.">Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment.</a> Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).</li><li>Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).</li><li>Rohrbach, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+sphingolipid+analysis+of+tissues+embedded+in+optimal+cutting+temperature+compound.">A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound.</a> Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).</li><li>Weston, L. A., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+LC-MS/MS+analysis+of+optimal+cutting+temperature+(OCT)+compound+removal+for+the+study+of+mammalian+proteomes.">Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes.</a> Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).</li><li>Holfeld, A., Vald&#233;s, A., Malmstr&#246;m, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+proteomic+workflow+for+mass+spectrometric+analysis+of+tissue+samples+preserved+by+different+methods.">Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).</li><li>Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteome+analysis+of+fresh+frozen+and+optimal+cutting+temperature+(OCT)+embedded+primary+non-small+cell+lung+carcinoma+by+LC-MS/MS.">Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS.</a> Methods. 81, 50-55 (2015).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+proteomics+using+chemical+immobilization+and+mass+spectrometry.">Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).</li></ol>

OCT é um agente de criopreservação comum a longo prazo usado em biorrepositórios. No entanto, a OCT pode resultar em supressão iônica quando os tecidos são analisados por várias plataformas de espectrometria de massa12,13,14,15, ou resultar em perda de sinal quando as amostras são analisadas por LC-ESI-MS/MS11. A OCT em tecidos criopreservados também pode inter...

Os esfingolípidos são metabólitos bioativos conhecidos por seus papéis no metabolismo humano e na doença 1,2. Regulam processos celulares complexos, como migração celular, sobrevivência e morte celular, movimento celular, tráfico vesicular, invasão e metástase celular, angiogênese e produção de citocinas 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defeitos na regulação do metabolismo esfingolipídico contribuem para o início e progressão dos cânceres, determinam o quão agressivos são os cânceres e como os cânceres respondem e desenvolvem resistência à terapia 3,10. Portanto, devido a esses amplos impactos na etiologia da doença, métodos analíticos que possam estabelecer com precisão alterações esfingolipídicas específicas da doença são ferramentas importantes. A espectrometria de massas (EM) é o método mais preciso e confiável para analisar as alterações esfingolipídicas.
Espécimes humanos que podem ser utilizados para a análise de alterações esfingolipídicas podem ser obtidos prospectivamente do conjunto cirúrgico ou retrospectivamente de biorrepositórios teciduais. Tecidos frescos da cirurgia são vantajosos porque podem ser analisados diretamente pela EM ou outros métodos analíticos. No entanto, a aquisição de tecidos prospectivamente tem obstáculos administrativos, técnicos e logísticos, e a coleta de espécimes suficientes para alcançar o poder estatístico pode ser um desafio. A obtenção de tecidos de biorrepositórios é vantajosa porque eles podem ser adquiridos retrospectivamente, em grande número, e os biorrepositórios confirmam histologia e patologia, usam procedimentos operacionais padrão para preservar e armazenar tecidos criogenicamente e podem fornecer dados clínico-patológicos que podem ser usados para análises de correlação. No entanto, para preservar características moleculares e estruturais, os biorrepositórios podem criopreservar tecidos, incorporando-os em composto de temperatura de corte ideal (OCT), que mostramos interferir nos ensaios de normalização de dados e na quantificação de esfingolipídios por cromatografia líquida por espectrometria de massa em tandem de ionização por eletrospray por cromatografia líquida (LC-ESI-MS/MS)11 . Também foi demonstrado que o álcool polivinílico e o polietilenoglicol, os componentes primários do composto OCT, resultam em supressão iônica em outras plataformas de análise de SM12,13,14,15. Portanto, o composto OCT deve ser removido dos tecidos antes da análise esfingolipidômica pela EM.
Em um relatório anterior, validamos um protocolo para a remoção de composto OCT de espécimes humanos para análise LC-ESI-MS/MS11 e a metodologia utilizada para pesagem de tecidos para normalização de dados11. Aqui, detalhamos as etapas do protocolo de remoção de compostos OCT esfingolipidômicos (sOCTrP) e mostramos dados representativos de tumores de adenocarcinoma pulmonar humano e tecidos adjacentes normais não envolvidos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL polypropylene pipette tips</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to retrieve specimens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-116</td>
			<td>Used for tube and tissue weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Sciex Analyst 1.6.2</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software to analyze and integrate MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Scale that is accurate to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top dispenser</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-723071</td>
			<td>Used for dispensing solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2212</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#946;-glucosyl-sphing-4-eine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2511</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#223;-lactosyl-sphing-4-ene</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2512</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Sphingomyelin&#160; (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2312</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHLOROFORM OMNISOLV 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1054-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClickSeal Biocontainment Lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75007309</td>
			<td>To prevent biohazard aeresols during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conflikt</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>4101</td>
			<td>Decontaminant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTO-20A/20AC Column Oven</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine;&#160; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2000</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2144</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGU20A5R degasser</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes 13x100mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>13x100 mm screw top tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated water bath</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For overnight lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 150</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-167</td>
			<td>triturate tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-177</td>
			<td>for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>Laboratory grade tissue used to make wicks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS Grade 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0486-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexera LC-30 AD binary pump system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-502</td>
			<td>13x100 mm screw top tube caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>To retrieve specimens from tubes after washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4987000118</td>
			<td>To dispense LC-MS internal standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89239-020</td>
			<td>Autoinjector vial caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Thread Glass Vials with ID Patch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46610-724</td>
			<td>Autoinjector vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIL-30AC autoinjector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD2030P1220</td>
			<td>For drying solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53822-U</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-ESI-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model 2800</td>
			<td>for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For sOCTrP and resuspending dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729572</td>
			<td>13x100 glass culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Hipersolve Chromanorm LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis

Os esfingolípidos são componentes celulares que têm papéis bem estabelecidos no metabolismo humano e na doença. A espectrometria de massa pode ser usada para determinar se os esfingolipídios estão alterados em uma doença e investigar se os esfingolipídios podem ser direcionados clinicamente. No entanto, estudos prospectivos adequadamente alimentados que adquirem tecidos diretamente do conjunto cirúrgico podem ser demorados e técnico, logístico e administrativamente desafiadores. Em contraste, estudos retrospectivos podem tirar proveito de espécimes humanos criopreservados já disponíveis, geralmente em grande número, em biorrepositórios de tecidos. Outras vantagens de adquirir tecidos de biorrepositórios incluem o acesso a informações associadas aos espécimes de tecido, incluindo histologia, patologia e, em alguns casos, variáveis clínico-patológicas, todas as quais podem ser usadas para examinar correlações com dados lipidômicos. No entanto, limitações técnicas relacionadas à incompatibilidade do composto de temperatura de corte ideal (OCT) utilizado na criopreservação e espectrometria de massas é uma barreira técnica para a análise de lipídios. No entanto, mostramos anteriormente que a OCT pode ser facilmente removida de amostras de biorrepositório humano através de ciclos de lavagens e centrifugação sem alterar seu conteúdo de esfingolipídios. Também estabelecemos anteriormente que os esfingolípidos em tecidos humanos criopreservados em OCT são estáveis por até 16 anos. Neste relatório, descrevemos as etapas e o fluxo de trabalho para analisar esfingolipídios em amostras de tecido humano que estão incorporadas na OCT, incluindo lavagem de tecidos, pesagem de tecidos para normalização de dados, extração de lipídios, preparação de amostras para análise por cromatografia líquida eletrospray ionização em tandem espectrometria de massa (LC-ESI-MS/MS), integração de dados de espectrometria de massa, normalização de dados e análise de dados.

Neste protocolo, descrevemos em detalhes um método para remover OCT de tecidos humanos criopreservados e pesar os tecidos para análise por LC-ESI-MS/MS. Os materiais necessários para este procedimento estão listados na Tabela de Materiais. Na Figura 1 são mostrados os resultados de um experimento típico em que 10 tumores de adenocarcinoma pulmonar humano e 10 tecidos adjacentes normais foram lavados para remover OCT e analisados por LC-ESI-MS/MS. Importante, como mostramos anteriormente<sup class="...

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Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Os esfingolípidos são metabólitos bioativos com papéis bem estabelecidos na doença humana. Caracterizar alterações em tecidos com espectrometria de massa pode revelar papéis na etiologia da doença ou identificar alvos terapêuticos. No entanto, o composto OCT usado para criopreservação em biorrepositórios interfere na espectrometria de massa. Delineamos métodos para analisar esfingolipídios em tecidos humanos incorporados em OCT com LC-ESI-MS/MS.

Preparação de tecidos humanos incorporados em composto de temperatura de corte ideal para análise de espectrometria de massa

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

A OCT é um agente de criopreservação incompatível com a análise de espectrometria de massas. Usando este protocolo, os pesquisadores podem remover OCT dos tecidos e quantificar esfingolipídios com espectrometria de massa por cromatografia líquida tandem. A preparação de mechas de secagem de tecidos, lavagem de tecidos e pesagem de tecidos será demonstrada por April Boyd, da Virginia Commonwealth University, e a extração lipídica será demonstrada pelo Dr. Jeremy Allegood, diretor do Virginia Commonwealth Metabolomics and Lipidomics Core.Para começar, limpe a tesoura cirúrgica imergindo-a em metanol por cinco minutos, seguida de limpá-las com um tecido de grau laboratorial limpo. Usando luvas sem pó, gire a extremidade de um tecido de grau de laboratório para criar um pavio finamente cônico de 30 a 40 milímetros de comprimento. Em seguida, usando a tesoura limpa de metanol, corte o pavio na extremidade grossa e coloque-o em uma caixa de papelão limpa.Em seguida, usando a tesoura limpa de metanol, corte de quatro a cinco milímetros da ponta de uma ponta de pipeta de um mililitro e coloque a ponta de volta no suporte da ponta. Para lavar o OCT dos tecidos, adicione 10 mililitros de água deionizada ultrapura gelada a cada tubo contendo tecido pulmonar humano e cubra-os com força. Deixe os tubos incubarem por 10 minutos.Vórtice vigorosamente cada tubo até que todo o tecido depositado nas paredes do tubo ou no pellet de tecido seja completamente ressuspenso. Em seguida, centrifugar os tubos em uma centrífuga de balde oscilante pré-refrigerada a 4.000 a 5.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Uma vez que a centrifugação esteja completa, destrate os tubos no gelo.Aspirar cuidadosamente a solução de lavagem, deixando aproximadamente 0,5 mililitros do sobrenadante no tubo e, em seguida, reencapa o tubo. Depois de remover o sobrenadante de todos os tubos, lave os tecidos mais duas vezes da mesma maneira. Após as três lavagens de remoção OCT, use a ponta da pipeta encurtada preparada para adicionar 500 microlitros de PBS gelado ao tubo.Usando a mesma ponta, ressuspeite suavemente o pellet e transfira todo o tecido ressuspenso para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro pré-rotulado e pré-pesado. Mantenha o tubo no gelo até que todas as amostras de tecido sejam transferidas. Pellet os tecidos centrifugando os tubos em uma centrífuga pré-refrigerada, em seguida, aspirar cuidadosamente o máximo possível do PBS sem perturbar o pellet e coloque os tubos de volta no gelo.Usando as mechas de secagem de tecido preparadas anteriormente, remova suavemente qualquer solução de lavagem restante, feche o tubo e coloque-o no gelo. Para pesar os tubos, coloque um tubo de cada vez em uma balança analítica alcatroada e zerada recentemente calibrada e feche a porta da câmara. Uma vez que o peso tenha se estabilizado, registre-o em uma planilha eletrônica.Após a pesagem, coloque o tubo de volta no gelo e adicione 300 microlitros de PBS gelado. Usando uma ponta de pipeta encurtada, transfira cuidadosamente todo o tecido em dois mililitros de metanol gelado em um tubo de vidro superior de parafuso pré-rotulado. Antes da extração lipídica, permita que os tecidos e os padrões lipídicos internos de espectrometria de massa se equilibrem à temperatura ambiente por 20 minutos, depois vortex e mergulhem as soluções padrão internas em um banho-maria ultrassônico até que os padrões lipídicos tenham se dissolvido completamente.Usando uma pipeta de repetição, adicione 250 picomoles dos padrões internos de espectrometria de massa a cada tubo e recapitule levemente os tubos. Para facilitar a homogeneização, ajuste o volume de metanol para dois mililitros e, em seguida, triture o tecido usando um homogeneizador movendo a ponta do homogeneizador em um movimento circular suavemente pressionado contra a parede do tubo. Quando os aglomerados não estiverem mais visíveis, recapeie o tubo.Mergulhe o tubo em um ângulo de 45 graus em um banho de água ultra-sônico por 5 a 10 segundos. Em seguida, sob um exaustor, adicione clorofórmio e metanol a cada tubo para obter uma proporção de metanol para clorofórmio para água de dois para um para 0,1. Sele bem os tubos e deixe-os na bancada até o final do dia.Antes de sair naquela noite, coloque os tubos bem tampados em um banho de água de 48 graus Celsius para uma incubação durante a noite. No dia seguinte, pelota qualquer solvente e detritos solúveis por centrifugação. Em seguida, em um exaustor, decante cuidadosamente o sobrenadante em tubos de ensaio de vidro borossilicato de 13 a 100 milímetros pré-rotulados de 13 a 45 graus para facilitar a decantação.Depois de decantar o sobrenadante de todos os tubos, use um concentrador de vácuo no vácuo máximo com uma etapa inicial de aquecimento de uma hora a 40 graus Celsius para evaporar todo o solvente e, em seguida, adicione 500 microlitros de metanol a cada tubo. Para ressuspender os extratos lipídicos secos, vortex o tubo por 5 a 10 segundos, em seguida, mergulhe o tubo em um banho de água ultra-sônico em um ângulo de 45 graus com rotação por dois minutos. Re-vórtice o tubo por cinco segundos e re-imergir no banho de água ultra-sônico por um minuto adicional.Remova quaisquer detritos insolúveis por centrifugação e, em seguida, decante o sobrenadante em um frasco para injetáveis autoinjetor pré-rotulado inclinado em um ângulo de 30 a 45 graus para facilitar a decantação. Tampar os frascos para injetáveis firmemente antes de os armazenar a menos 80 graus Celsius até à análise. A análise de espectrometria de massa em tandem de ionização por cromatografia líquida após a remoção da OCT confirma que várias espécies de ceramidas e monohexosil-ceramidas de comprimento de cadeia estão significativamente elevadas em tumores de adenocarcinoma pulmonar humano em comparação com tecidos adjacentes normais não envolvidos.Os padrões esfingolipídicos eluem sequencialmente na seguinte ordem:d17:1 esfingosina, d17:1 esfingosina-1-fosfato, C12 lactosil-ceramida, C12 monohexosil-ceramida, C12 esfingomielina e C12 ceramida. Para cada uma dessas espécies de esfingolipídios, usando as configurações de gradiente e instrumentação no texto, há um deslocamento positivo aproximado de 0,15 minuto no tempo de retenção para cada dois aumentos de carbono no comprimento da cadeia. No entanto, lipídios de maior comprimento de cadeia, como C24 e C26, podem ter maiores mudanças no tempo de retenção.Além disso, uma ligação dupla no ácido graxo geralmente resulta em uma mudança negativa de 0,15 minuto no tempo de retenção. Assim, a ceramida C18:1 terá um tempo de retenção semelhante à ceramida C16. Em vez de depender quase exclusivamente de tecidos recém-coletados, este protocolo expande as fontes de tecido que podem ser usadas para análise de espectrometria de massa para incluir aquelas criogenicamente armazenadas em biorrepositórios.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Imuno-histoquímica de fluorescência de quatro cores das subpopulações de células T em amostras de carcinoma de células escamosas humano oftaríngeas fixadas em formalina, arquivadas, formadas por formalina

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Pesquisa do câncer

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

Determinação da Frequência Inibitória Óptima para Células Cânceras Utilizando Campos de Tratamento Tumoral (TTFields)

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Eletroforese em Gel bidimensional juntamente com métodos de espectrometria de massa para uma análise do proteoma de tecido humano Adenoma de hipófise

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Enriquecimento de Fosfopeptida acoplado com espectrometria de massa livre de rótulo quantitativa para investigar o Phosphoproteome no câncer de próstata

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Coloração elástica em lâminas de parafina-Embedded de pT3N0M0 tecido de câncer gástrico

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Análise digital de imunocoloração da proteína ZW10 interagindo em tecidos pulmonares humanos

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Capturando a molécula pequena comunicação entre os tecidos e células usando a imagem latente de espectrometria de massa

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Extração de metabólitos aquosos de células aderentes cultivadas para análise Metabolomica por espectrometria de massa eletroforese capilar

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Preparação das mitocôndrias dos tecidos do câncer de ovário e controle dos tecidos ovarianos para análise quantitativa proteômica

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Avaliação da morte celular usando supernanato livre de células de probióticos em culturas esferoides tridimensionais de células cancerígenas colorretais

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...