Name: preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis
Uploaded: 2021-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Услуги и поддержка исследовательского проекта были предоставлены VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core и VCU Lipidomics and Metabolomics Core, которые частично поддерживаются финансированием nih-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Эта работа была поддержана Национальными институтами грантов здравоохранения R21CA232234 (Сантьяго Лима).

Деидентифицированные легочные ткани человека были получены из Университета Содружества Вирджинии (VCU) Tissue and Data Acquisition and Analysis Core в соответствии с протоколом (#HM2471), утвержденным внутренним наблюдательным советом (IRB). Использование мышей для исследования и сбора тканей мышей было одобре?...

<ol>
	<li>Maceyka, M., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolites+in+inflammatory+disease.">Sphingolipid metabolites in inflammatory disease.</a> Nature. 510, 58-67 (2014).</li><li>Ogretmen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolism+in+cancer+signalling+and+therapy.">Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Hla, T., Dannenberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+signaling+in+metabolic+disorders.">Sphingolipid signaling in metabolic disorders.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).</li><li>Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+and+Sphingosine+Kinase+1+involvement+in+endocytic+membrane+Trafficking.">Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).</li><li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+is+required+for+BECN1-+and+ATG5-dependent+cell+death+induced+by+sphingosine+kinase+1+inhibition.">TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition.</a> Autophagy. , 1-50 (2018).</li><li>Young, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+Kinase+1+cooperates+with+autophagy+to+maintain+endocytic+membrane+trafficking.">Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking.</a> Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).</li><li>Young, M. M., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+as+regulators+of+autophagy+and+endocytic+trafficking.">Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking.</a> Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+endocytosis+and+sphingosine+kinase+1+recruitment.">Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment.</a> Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).</li><li>Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).</li><li>Rohrbach, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+sphingolipid+analysis+of+tissues+embedded+in+optimal+cutting+temperature+compound.">A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound.</a> Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).</li><li>Weston, L. A., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+LC-MS/MS+analysis+of+optimal+cutting+temperature+(OCT)+compound+removal+for+the+study+of+mammalian+proteomes.">Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes.</a> Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).</li><li>Holfeld, A., Vald&#233;s, A., Malmstr&#246;m, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+proteomic+workflow+for+mass+spectrometric+analysis+of+tissue+samples+preserved+by+different+methods.">Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).</li><li>Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteome+analysis+of+fresh+frozen+and+optimal+cutting+temperature+(OCT)+embedded+primary+non-small+cell+lung+carcinoma+by+LC-MS/MS.">Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS.</a> Methods. 81, 50-55 (2015).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+proteomics+using+chemical+immobilization+and+mass+spectrometry.">Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).</li></ol>

ОКТ является распространенным долгосрочным криосохраняющим агентом, используемым в биорепозиториях. Однако ОКТ может привести к подавлению ионов, когда ткани анализируются различными масс-спектрометрическими платформами 12,13,14,15, ил?...

Сфинголипиды являются биологически активными метаболитами, известными своей ролью в метаболизме человека и заболеваниях 1,2. Они регулируют сложные клеточные процессы, такие как миграция клеток, выживание и гибель клеток, движение клеток, везикулярный трафик, клеточная инвазия и метастазирование, ангиогенез и производство цитокинов 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Дефекты в регуляции метаболизма сфинголипидов способствуют инициации и прогрессированию рака, определяют, насколько агрессивны раковые заболевания, и как рак реагирует и развивает устойчивость к терапии 3,10. Поэтому из-за этих широких воздействий на этиологию заболевания аналитические методы, которые могут точно установить специфические для заболевания изменения сфинголипидов, являются важными инструментами. Масс-спектрометрия (МС) является наиболее точным и надежным методом анализа изменений сфинголипидов.
Человеческие образцы, которые могут быть использованы для анализа сфинголипидных изменений, могут быть получены перспективно из хирургического набора или ретроспективно из тканевых биорепозиториев. Свежие ткани от операции выгодны, потому что они могут быть непосредственно проанализированы РС или другими аналитическими методами. Тем не менее, приобретение тканей в перспективе имеет административные, технические и логистические препятствия, и сбор достаточного количества образцов для достижения статистической мощности может быть сложной задачей. Получение тканей из биорепозиториев выгодно, потому что они могут быть приобретены ретроспективно, в большом количестве, а биорепозитории подтверждают гистологию и патологию, используют стандартные операционные процедуры для криогенного сохранения и хранения тканей и могут предоставлять клинико-патологические данные, которые могут быть использованы для корреляционного анализа. Однако для сохранения молекулярных и структурных особенностей биорепозитории могут криоконсервировать ткани, встраивая их в соединение оптимальной температуры резания (ОКТ), которое, как мы показали, мешает анализам нормализации данных и количественному определению сфинголипидов с помощью жидкостной хроматографии электрораспылительной ионизационной тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS/MS)11 . Также было показано, что поливиниловый спирт и полиэтиленгликоль, первичные компоненты в соединении OCT, приводят к подавлению ионов в других платформах анализаMS 12,13,14,15. Поэтому соединение OCT должно быть удалено из тканей перед сфинголипидомическим анализом РС.
В предыдущем отчете мы подтвердили протокол удаления соединения OCT из образцов человека для анализа LC-ESI-MS/MS11 и методологию, используемую для взвешивания тканей для нормализации данных11. Здесь мы подробно описываем этапы протокола удаления соединений sphingolipidomic OCT (sOCTrP) и показываем репрезентативные данные опухолей аденокарциномы легких человека и нормальных прилегающих невовлеченных тканей.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL polypropylene pipette tips</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to retrieve specimens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-116</td>
			<td>Used for tube and tissue weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Sciex Analyst 1.6.2</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software to analyze and integrate MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Scale that is accurate to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top dispenser</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-723071</td>
			<td>Used for dispensing solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2212</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#946;-glucosyl-sphing-4-eine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2511</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#223;-lactosyl-sphing-4-ene</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2512</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Sphingomyelin&#160; (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2312</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHLOROFORM OMNISOLV 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1054-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClickSeal Biocontainment Lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75007309</td>
			<td>To prevent biohazard aeresols during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conflikt</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>4101</td>
			<td>Decontaminant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTO-20A/20AC Column Oven</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine;&#160; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2000</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2144</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGU20A5R degasser</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes 13x100mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>13x100 mm screw top tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated water bath</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For overnight lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 150</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-167</td>
			<td>triturate tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-177</td>
			<td>for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>Laboratory grade tissue used to make wicks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS Grade 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0486-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexera LC-30 AD binary pump system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-502</td>
			<td>13x100 mm screw top tube caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>To retrieve specimens from tubes after washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4987000118</td>
			<td>To dispense LC-MS internal standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89239-020</td>
			<td>Autoinjector vial caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Thread Glass Vials with ID Patch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46610-724</td>
			<td>Autoinjector vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIL-30AC autoinjector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD2030P1220</td>
			<td>For drying solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53822-U</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-ESI-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model 2800</td>
			<td>for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For sOCTrP and resuspending dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729572</td>
			<td>13x100 glass culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Hipersolve Chromanorm LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis

Сфинголипиды являются клеточными компонентами, которые имеют хорошо установленную роль в метаболизме и болезнях человека. Масс-спектрометрия может быть использована для определения того, изменяются ли сфинголипиды при заболевании, и для изучения того, могут ли сфинголипиды быть клинически нацелены. Тем не менее, надлежащим образом подготовленные проспективные исследования, которые приобретают ткани непосредственно из хирургического набора, могут быть трудоемкими и технически, логистически и административно сложными. Напротив, ретроспективные исследования могут использовать криоконсервированные человеческие образцы, уже доступные, обычно в больших количествах, в тканевых биорепозиториях. Другие преимущества получения тканей из биорепозиториев включают доступ к информации, связанной с образцами тканей, включая гистологию, патологию и в некоторых случаях клинико-патологические переменные, все из которых могут быть использованы для изучения корреляций с данными липидомики. Однако технические ограничения, связанные с несовместимостью оптимальной температуры резания соединения (ОКТ), используемого в криоконсервации и масс-спектрометрии, являются техническим барьером для анализа липидов. Тем не менее, ранее мы показали, что OCT может быть легко удален из образцов биорепозиториев человека посредством циклов промывки и центрифугирования без изменения их содержания сфинголипидов. Мы также ранее установили, что сфинголипиды в тканях человека, криоконсервированные в ОКТ, стабильны до 16 лет. В этом отчете мы описываем этапы и рабочий процесс анализа сфинголипидов в образцах тканей человека, которые встроены в OCT, включая промывку тканей, взвешивание тканей для нормализации данных, извлечение липидов, подготовку образцов для анализа с помощью жидкостной хроматографии электрораспылительной ионизационной тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS / MS), интеграцию данных масс-спектрометрии, нормализацию данных и анализ данных.

В этом протоколе мы подробно описываем метод удаления ОКТ из крио-сохраненных тканей человека и взвешиваем ткани для анализа LC-ESI-MS/MS. Материалы, необходимые для этой процедуры, перечислены в Таблице материалов. На рисунке 1 показаны результаты типичного экспер?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Сфинголипиды являются биологически активными метаболитами с хорошо известной ролью в заболеваниях человека. Характеристика изменений в тканях с помощью масс-спектрометрии может выявить роли в этиологии заболевания или определить терапевтические мишени. Однако OCT-соединение, используемое для криоконсервации в биорепозиториях, мешает масс-спектрометрии. Описаны методы анализа сфинголипидов в тканях человека, встроенных в ОКТ с помощью LC-ESI-MS/MS.

Подготовка тканей человека, встроенных в оптимальное компаундирование температуры резания для масс-спектрометрического анализа

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

ОКТ является криоконсерватором, несовместимым с масс-спектрометрическим анализом. Используя этот протокол, исследователи могут удалять ОКТ из тканей и количественно определять сфинголипиды с помощью тандемной жидкостной хроматографической масс-спектрометрии. Приготовление фитилей для сушки тканей, промывка тканей и взвешивание тканей будут продемонстрированы Эйприл Бойд из Университета Содружества Вирджинии, а экстракция липидов будет продемонстрирована доктором Джереми Аллегудом, директором Virginia Commonwealth Metabolomics and Lipidomics Core.Для начала очистите хирургические ножницы, погрузив их в метанол на пять минут, а затем протрите их чистой тканью лабораторного класса. Используя перчатки без порошка, закрутите конец ткани лабораторного класса, чтобы создать тонко суженный фитиль длиной от 30 до 40 миллиметров. Затем с помощью метанола очистите ножницы, вырежьте фитиль на толстом конце и поместите его в чистую картонную коробку.Затем, используя очищенные ножницы метанола, отрежьте от четырех до пяти миллиметров от кончика одного миллилитра пипетки и поместите наконечник обратно в держатель наконечника. Чтобы смыть ОКТ из тканей, добавьте 10 миллилитров ледяной холодной сверхчистой деионизированной воды в каждую трубку, содержащую легочную ткань человека, и плотно закройте их. Дайте пробиркам инкубироваться в течение 10 минут.Энергично вращайте каждую трубку до тех пор, пока вся ткань, осажденная на стенках трубки или тканевая гранула, не будет полностью повторно суспендирована. Затем центрифугируйте трубки в предварительно охлажденную центрифугу с качающимся ведром при температуре от 4 000 до 5 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Как только центрифугирование будет завершено, снимите трубки на льду.Осторожно аспирируйте промывочный раствор, оставляя примерно 0,5 миллилитра супернатанта в трубке, затем повторите трубку. После удаления супернатанта из всех трубок промыть ткани еще дважды таким же образом. После трех промывок удаления OCT используйте подготовленный укороченный наконечник пипетки, чтобы добавить 500 микролитров ледяного PBS в трубку.Используя тот же наконечник, осторожно повторно суспендируйте гранулу и перенесите всю повторно суспендированную ткань в предварительно маркированную и предварительно взвешенную 1,5-миллилитровую центрифужную трубку. Держите трубку на льду до тех пор, пока не будут перенесены все образцы тканей. Гранулируйте ткани, центрифугируя трубки в предварительно охлажденной центрифуге, затем тщательно аспирируйте как можно больше PBS, не нарушая гранулу, и поместите трубки обратно на лед.Используя фитили для сушки тканей, приготовленные ранее, аккуратно удалите оставшийся моющий раствор, затем закройте трубку и поместите ее на лед. Чтобы взвесить трубки, поместите по одной трубке за раз в недавно откалиброванные смоляные и обнуленные аналитические весы и закройте дверцу камеры. Как только вес стабилизируется, запишите его в электронную таблицу.После взвешивания поместите трубку обратно на лед и добавьте 300 микролитров ледяного PBS. Используя укороченный наконечник пипетки, осторожно переложите всю ткань в два миллилитра ледяного холодного метанола в предварительно маркированную стеклянную трубку с винтовой крышкой. Перед извлечением липидов дайте тканям и масс-спектрометрии внутренние липидные стандарты уравновеситься до комнатной температуры в течение 20 минут, затем вихрь и погрузить внутренние стандартные растворы в ультразвуковую водяную баню до полного растворения липидных стандартов.Используя повторяющуюся пипетку, добавьте 250 пикомолей внутренних стандартов масс-спектрометрии в каждую трубку и слегка подведите итоги трубок. Чтобы облегчить гомогенизацию, отрегулируйте объем метанола до двух миллилитров, затем тритурируйте ткань с помощью гомогенизатора, перемещая наконечник гомогенизатора круговыми движениями, мягко прижатыми к стенке трубки. Когда сгустки больше не видны, повторите трубку.Погрузите трубку под углом 45 градусов в ультразвуковую водяную баню на 5-10 секунд. Затем под вытяжной капюшоном добавляют хлороформ и метанол в каждую трубку, чтобы достичь соотношения метанола к хлороформу к воде от двух к одному к 0,1. Плотно запечатайте трубки и оставьте их на столешнице до конца дня.Перед отъездом вечером поместите плотно закрытые трубки в водяную баню с температурой 48 градусов по Цельсию для ночной инкубации. На следующий день гранулируют любой растворитель и растворимый мусор центрифугированием. Затем в вытяжном шкафу тщательно декантируйте супернатант в предварительно маркированные 13 в 100-миллиметровые боросиликатные стеклянные пробирки, наклоненные под углом от 30 до 45 градусов, чтобы облегчить декантирование.После декантирования супернатанта из всех трубок используйте вакуумный концентратор при максимальном вакууме с начальной часовой стадией нагрева при 40 градусах Цельсия, чтобы испарить весь растворитель, затем добавьте 500 микролитров метанола в каждую трубку. Чтобы повторно суспендировать высушенные липидные экстракты, вращайте трубку в течение 5-10 секунд, затем погружайте трубку в ультразвуковую водяную баню под углом 45 градусов с вращением в течение двух минут. Повторно вихрь трубки в течение пяти секунд и повторно погружайтесь в ультразвуковую водяную баню еще на минуту.Удалите любой нерастворимый мусор путем центрифугирования, затем декантируйте супернатант в предварительно маркированный флакон автоинжектора, наклоненный под углом от 30 до 45 градусов, чтобы облегчить декантирование. Плотно закройте флаконы, прежде чем хранить их при температуре минус 80 градусов по Цельсию до анализа. Анализ жидкостной хроматографии с электрораспылением ионизации тандемной масс-спектрометрии после удаления ОКТ подтверждает, что различные виды церамидов и моногексозил-керамидов длиной цепи значительно повышены в опухолях аденокарциномы легких человека по сравнению с нормальными соседними невовлеченными тканями.Стандарты сфинголипидов элюируют последовательно в следующем порядке: d17:1 сфингозин, d17:1 сфингозин-1-фосфат, C12 лактозил-керамид, C12 моногексозил-керамид, C12 сфингомиелин и C12 керамид. Для каждого из этих видов сфинголипидов, используя настройки градиента и приборов в тексте, существует приблизительный положительный сдвиг времени удержания на 0,15 минуты на каждые два увеличения длины цепи углерода. Однако липиды более длинной цепи, такие как C24 и C26, могут иметь большие сдвиги времени удержания.Кроме того, двойная связь в жирной кислоте часто приводит к отрицательному сдвигу времени удержания на 0,15 минуты. Таким образом, церамид C18:1 будет иметь время удержания, аналогичное церамиду C16. Вместо того, чтобы полагаться почти исключительно на свежесобранные ткани, этот протокол расширяет тканевые источники, которые могут быть использованы для масс-спектрометрического анализа, включая те, которые криогенно хранятся в биорепозиториях.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Четырехцветная флуоресценция Иммуногистохимия субпопуляций Т-клеток в архивных формалиновых фиксированных, парафиновых встраиваемых образцах проксимальной клеточной карциномы человека

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

Определение оптимальной частоты ингибирования для злокачественных клеток с использованием полей для лечения опухолей (TTFields)

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

В сочетании с методами масс-спектрометрии для анализа тканей протеома человека Аденома гипофиза двумерного гель-электрофорез

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide обогащения, в сочетании с Label бесплатно количественного масс-спектрометрии для расследования Phosphoproteome рака простаты

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Упругое окрашивание на параффиновые слайды ткани рака желудка pT3N0M0

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Цифровой анализ иммуностоинга взаимодействующих белков в тканях легких человека

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Захват малые молекулы связь между тканей и клеток с использованием изображений масс-спектрометрия

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Извлечение aqueous Метаболитов из культовых клеток присоединения для метаболомического анализа капиллярной электрофорез-масс-спектрометрии

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Подготовка митохондрий из тканей рака яичников и контроль тканей яичников для количественного анализа протеомики

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Оценка гибели клеток с использованием бесклеточного супернатанта пробиотиков в трехмерных сфероидных культурах колоректальных раковых клеток

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...