Name: preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis
Uploaded: 2021-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Tjänster och stöd för forskningsprojektet tillhandahölls av VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core och VCU Lipidomics and Metabolomics Core, som delvis stöds med finansiering från NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago Lima).

Avidentifierade mänskliga lungvävnader erhölls från Virginia Commonwealth University (VCU) Tissue and Data Acquisition and Analysis Core under ett internt granskningsnämnd (IRB) godkänt protokoll (#HM2471). Användningen av möss för forskning och skörd av mössvävnader godkändes av VCU institutional animal care and use committee (IACUC).
1. Beredning av material
OBS: Dessa steg bör utföras en dag före vävnadstvätten.
<ol><li>Förmärk och väg 1,5 ...

<ol>
	<li>Maceyka, M., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolites+in+inflammatory+disease.">Sphingolipid metabolites in inflammatory disease.</a> Nature. 510, 58-67 (2014).</li><li>Ogretmen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolism+in+cancer+signalling+and+therapy.">Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Hla, T., Dannenberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+signaling+in+metabolic+disorders.">Sphingolipid signaling in metabolic disorders.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).</li><li>Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+and+Sphingosine+Kinase+1+involvement+in+endocytic+membrane+Trafficking.">Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).</li><li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+is+required+for+BECN1-+and+ATG5-dependent+cell+death+induced+by+sphingosine+kinase+1+inhibition.">TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition.</a> Autophagy. , 1-50 (2018).</li><li>Young, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+Kinase+1+cooperates+with+autophagy+to+maintain+endocytic+membrane+trafficking.">Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking.</a> Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).</li><li>Young, M. M., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+as+regulators+of+autophagy+and+endocytic+trafficking.">Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking.</a> Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+endocytosis+and+sphingosine+kinase+1+recruitment.">Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment.</a> Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).</li><li>Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).</li><li>Rohrbach, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+sphingolipid+analysis+of+tissues+embedded+in+optimal+cutting+temperature+compound.">A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound.</a> Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).</li><li>Weston, L. A., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+LC-MS/MS+analysis+of+optimal+cutting+temperature+(OCT)+compound+removal+for+the+study+of+mammalian+proteomes.">Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes.</a> Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).</li><li>Holfeld, A., Vald&#233;s, A., Malmstr&#246;m, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+proteomic+workflow+for+mass+spectrometric+analysis+of+tissue+samples+preserved+by+different+methods.">Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).</li><li>Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteome+analysis+of+fresh+frozen+and+optimal+cutting+temperature+(OCT)+embedded+primary+non-small+cell+lung+carcinoma+by+LC-MS/MS.">Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS.</a> Methods. 81, 50-55 (2015).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+proteomics+using+chemical+immobilization+and+mass+spectrometry.">Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).</li></ol>

OCT är ett vanligt långsiktigt kryokonserveringsmedel som används i biorepositorier. OCT kan dock resultera i jonundertryckning när vävnader analyseras av olika masspektrometriplattformar12,13,14,15, eller resultera i signalförlust när prover analyseras av LC-ESI-MS/MS 11. OCT i kryokonserverade vävnader kan också störa vävnadsnormaliseringsmetoder som vägnin...

Sfingolipider är bioaktiva metaboliter kända för sina roller i mänsklig metabolism och sjukdom 1,2. De reglerar komplexa cellulära processer såsom cellmigration, cellöverlevnad och död, cellrörelse, vesikulär handel, cellulär invasion och metastasering, angiogenes och produktion av cytokiner 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defekter i regleringen av sfingolipidmetabolism bidrar till initiering och progression av cancer, bestämmer hur aggressiva cancerformer är och hur cancer svarar på och utvecklar resistens mot terapi 3,10. På grund av dessa breda effekter på sjukdomens etiologi är därför analysmetoder som exakt kan fastställa sjukdomsspecifika sfingolipidförändringar viktiga verktyg. Masspektrometri (MS) är den mest exakta och pålitliga metoden för att analysera sfingolipidförändringar.
Mänskliga prover som kan användas för analys av sfingolipidförändringar kan erhållas prospektivt från operationssviten eller retrospektivt från vävnadsbiorepositorier. Färska vävnader från kirurgi är fördelaktiga eftersom de kan analyseras direkt med MS eller andra analysmetoder. Att förvärva vävnader framåtriktat har dock administrativa, tekniska och logistiska hinder, och att samla in tillräckligt med prover för att nå statistisk kraft kan vara utmanande. Att erhålla vävnader från biorepositorier är fördelaktigt eftersom de kan förvärvas retrospektivt, i stort antal, och biorepositorier bekräftar histologi och patologi, använder standardrutiner för att kryogent bevara och lagra vävnader och kan tillhandahålla kliniskpatologiska data som kan användas för korrelationsanalyser. För att bevara molekylära och strukturella egenskaper kan biorepositorier dock kryokonservera vävnader genom att bädda in dem i optimal skärtemperatur (OCT) -förening, vilket vi har visat stör datanormaliseringsanalyser och kvantifieringen av sfingolipider genom vätskekromatografi elektrosprayjonisering tandemmasspektrometri (LC-ESI-MS / MS)11 . Det har också visats att polyvinylalkohol och polyetylenglykol, de primära komponenterna i OCT-förening, resulterar i jonundertryckning i andra MS-analysplattformar12,13,14,15. Därför måste ULT-föreningen avlägsnas från vävnader före sfingolipidomisk analys av MS.
I en tidigare rapport har vi validerat ett protokoll för avlägsnande av ULT-förening från humana prover för LC-ESI-MS/MS-analys 11 och den metod som används för att väga vävnader för datanormalisering11. Här beskriver vi stegen i sfingolipidomic OCT compound-removal protocol (sOCTrP) och visar representativa data från humana lungadenokarcinomtumörer och normala intilliggande oengagerade vävnader.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL polypropylene pipette tips</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to retrieve specimens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-116</td>
			<td>Used for tube and tissue weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Sciex Analyst 1.6.2</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software to analyze and integrate MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Scale that is accurate to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top dispenser</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-723071</td>
			<td>Used for dispensing solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2212</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#946;-glucosyl-sphing-4-eine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2511</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#223;-lactosyl-sphing-4-ene</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2512</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Sphingomyelin&#160; (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2312</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHLOROFORM OMNISOLV 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1054-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClickSeal Biocontainment Lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75007309</td>
			<td>To prevent biohazard aeresols during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conflikt</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>4101</td>
			<td>Decontaminant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTO-20A/20AC Column Oven</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine;&#160; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2000</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2144</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGU20A5R degasser</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes 13x100mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>13x100 mm screw top tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated water bath</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For overnight lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 150</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-167</td>
			<td>triturate tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-177</td>
			<td>for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>Laboratory grade tissue used to make wicks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS Grade 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0486-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexera LC-30 AD binary pump system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-502</td>
			<td>13x100 mm screw top tube caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>To retrieve specimens from tubes after washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4987000118</td>
			<td>To dispense LC-MS internal standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89239-020</td>
			<td>Autoinjector vial caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Thread Glass Vials with ID Patch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46610-724</td>
			<td>Autoinjector vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIL-30AC autoinjector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD2030P1220</td>
			<td>For drying solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53822-U</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-ESI-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model 2800</td>
			<td>for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For sOCTrP and resuspending dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729572</td>
			<td>13x100 glass culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Hipersolve Chromanorm LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis

Sfingolipider är cellulära komponenter som har väletablerade roller i mänsklig metabolism och sjukdom. Masspektrometri kan användas för att avgöra om sfingolipider förändras i en sjukdom och undersöka om sfingolipider kan riktas kliniskt. Korrekt drivna prospektiva studier som förvärvar vävnader direkt från operationssviten kan dock vara tidskrävande och tekniskt, logistiskt och administrativt utmanande. Däremot kan retrospektiva studier dra nytta av kryokonserverade mänskliga prover som redan finns tillgängliga, vanligtvis i stort antal, vid vävnadsbiorepositorier. Andra fördelar med att skaffa vävnader från biorepositorier inkluderar tillgång till information associerad med vävnadsproverna inklusive histologi, patologi och i vissa fall kliniskpatologiska variabler, som alla kan användas för att undersöka korrelationer med lipidomikdata. Tekniska begränsningar relaterade till inkompatibiliteten hos optimal skärtemperaturförening (OCT) som används i kryokonservering och masspektrometri är emellertid en teknisk barriär för analys av lipider. Vi har dock tidigare visat att OCT lätt kan avlägsnas från humana biorepositorprover genom cykler av tvättar och centrifugering utan att ändra deras sfingolipidinnehåll. Vi har också tidigare konstaterat att sfingolipider i mänskliga vävnader kryokonserverade i OCT är stabila i upp till 16 år. I den här rapporten beskriver vi stegen och arbetsflödet för att analysera sfingolipider i humana vävnadsprover som är inbäddade i OCT, inklusive tvättvävnader, vägning av vävnader för datanormalisering, extraktion av lipider, beredning av prover för analys med vätskekromatografi elektrosprayjonisering tandemmasspektrometri (LC-ESI-MS / MS), masspektrometridataintegration, datanormalisering och dataanalys.

I detta protokoll beskriver vi i detalj en metod för att avlägsna OCT från kryokonserverade mänskliga vävnader och väga vävnaderna för analys av LC-ESI-MS/MS. De material som krävs för denna procedur listas i materialförteckningen. I figur 1 visas resultat av ett typiskt experiment där 10 humana lungadenokarcinomtumörer och 10 normala intilliggande vävnader tvättades för att avlägsna OCT och analyserades av LC-ESI-MS / MS. Viktigt, som vi tidigare har visat<...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Sfingolipider är bioaktiva metaboliter med väletablerade roller i mänsklig sjukdom. Karakteristiska förändringar i vävnader med masspektrometri kan avslöja roller i sjukdomsetiologi eller identifiera terapeutiska mål. OCT-föreningen som används för kryokonservering i biorepositorier stör emellertid masspektrometri. Vi beskriver metoder för att analysera sfingolipider i mänskliga vävnader inbäddade i OCT med LC-ESI-MS / MS.

Beredning av mänskliga vävnader inbäddade i optimal skärtemperaturförening för masspektrometrianalys

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

OCT är ett kryokonserveringsmedel som är oförenligt med masspektrometrianalys. Med hjälp av detta protokoll kan forskare ta bort OCT från vävnader och kvantifiera sfingolipider med tandemvätskekromatografimasspektrometri. Beredningen av vävnadstorkande vekar, vävnadstvätt och vävnadsvägning kommer att demonstreras av April Boyd från Virginia Commonwealth University, och lipidextraktionen kommer att demonstreras av Dr.Jeremy Allegood, chef för Virginia Commonwealth Metabolomics and Lipidomics Core.Börja med att rengöra kirurgisk sax genom att nedsänka dem i metanol i fem minuter, följt av att torka dem med en ren vävnad av laboratoriekvalitet. Använd pulverfria handskar och snurra änden av en vävnad av laboratoriekvalitet för att skapa en finsmalnande 30 till 40 millimeter lång veke. Använd sedan den metanolrengjorda saxen, skär veken i den tjocka änden och lägg den i en ren kartong.Skär sedan fyra till fem millimeter från spetsen på en milliliters pipettspets med hjälp av den metanolrenade saxen och placera tillbaka spetsen i spetshållaren. För att tvätta bort OCT från vävnaderna, tillsätt 10 ml iskallt ultrarent avjoniserat vatten till varje rör som innehåller mänsklig lungvävnad och täck dem tätt. Låt rören inkubera i 10 minuter.Virvla kraftigt varje rör tills all vävnad som avsatts på rörets väggar eller vävnadspelleten är helt återupplivad. Centrifugera sedan rören i en förkyld svängande hinkcentrifug vid 4 000 till 5 000 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. När centrifugeringen är klar, lossa rören på is.Aspirera försiktigt tvättlösningen och lämna cirka 0,5 ml av supernatanten i röret och sätt sedan tillbaka röret. När du har tagit bort supernatanten från alla rör, tvätta vävnaderna två gånger till på samma sätt. Efter de tre OCT-borttagningstvättarna, använd den förberedda förkortade pipettspetsen för att tillsätta 500 mikroliter iskall PBS till röret.Använd samma spets, återsuspendera försiktigt pelleten och överför all återsuspenderad vävnad till ett förmärkt och förvägrat 1,5 ml centrifugrör. Håll röret på is tills alla vävnadsprover har överförts. Pellera vävnaderna genom att centrifugera rören i en förkyld centrifug, aspirera sedan försiktigt så mycket av PBS som möjligt utan att störa pelleten och placera tillbaka rören på is.Använd de vävnadstorkande vekarna som förberetts tidigare, ta försiktigt bort eventuell återstående tvättlösning, stäng sedan röret och placera det på is. För att väga rören, placera ett rör i taget i en nyligen kalibrerad tjärad och nollställd analysvåg och stäng kammardörren. När vikten har stabiliserats registrerar du den i ett elektroniskt kalkylblad.Efter vägning, placera röret tillbaka på is och tillsätt 300 mikroliter iskall PBS. Använd en förkortad pipettspets och överför försiktigt all vävnad till två milliliter iskall metanol i ett förmärkt skruvglasrör. Innan lipidextraktion, låt vävnaderna och masspektrometrins interna lipidstandarder balansera till rumstemperatur i 20 minuter, sedan virvla och fördjupa de interna standardlösningarna i ett ultraljudsvattenbad tills lipidstandarderna har lösts upp helt.Använd en upprepande pipett, tillsätt 250 picomoles av de interna masspektrometristandarderna till varje rör och sammanfatta rören lätt. För att underlätta homogenisering, justera volymen metanol till två milliliter och trituera sedan vävnaden med hjälp av en homogenisator genom att flytta homogenisatorspetsen i en cirkulär rörelse försiktigt pressad mot rörväggen. När klumpar inte längre är synliga, sätt tillbaka röret.Sänk ner röret i 45 graders vinkel i ett ultraljudsvattenbad i 5 till 10 sekunder. Tillsätt sedan kloroform och metanol under en draghuv till varje rör för att uppnå ett metanol till kloroform till vattenförhållande mellan två och en till 0,1. Försegla rören tätt och lämna dem på bänkskivan till slutet av dagen.Innan du lämnar den kvällen, placera de tätt täckta rören i ett 48 grader Celsius vattenbad för en inkubation över natten. Följande dag, pellet eventuellt lösningsmedel och lösligt skräp genom centrifugering. Sedan i en dragskåp, dekantera försiktigt supernatanten i förmärkta 13 till 100 millimeter borosilikatglasprovrör lutade i en 30 till 45 graders vinkel för att underlätta dekanteringen.Efter dekantering av supernatanten från alla rör, använd en vakuumkoncentrator vid maximalt vakuum med ett initialt uppvärmningssteg på en timme vid 40 grader Celsius för att avdunsta allt lösningsmedel och tillsätt sedan 500 mikroliter metanol till varje rör. För att återsuspendera de torkade lipidextrakten, virvla röret i 5 till 10 sekunder, sänk sedan ner röret i ett ultraljudsvattenbad i 45 graders vinkel med rotation i två minuter. Virvla röret i fem sekunder och fördjupa dig i ultraljudsvattenbadet i ytterligare en minut.Ta bort olösligt skräp genom centrifugering och dekantera sedan supernatanten i en förmärkt autoinjektorflaska lutad i 30 till 45 graders vinkel för att underlätta dekanteringen. Kappa injektionsflaskorna ordentligt innan de förvaras vid minus 80 grader Celsius tills analys. Vätskekromatografi elektrosprayjonisering tandem masspektrometrianalys efter OCT-borttagning bekräftar att olika kedjelängdsarter av ceramider och monohexosyl-ceramider är signifikant förhöjda i humana lungadenokarcinomtumörer jämfört med normala intilliggande oengagerade vävnader.Sfingolipidstandarder eluerar sekventiellt i följande ordning:d17:1 sfingosin, d17:1 sfingosin-1-fosfat, C12 laktosyl-ceramid, C12 monohexosyl-ceramid, C12 sfingomyelin och C12 ceramid. För var och en av dessa sfingolipidarter, med hjälp av gradient- och instrumenteringsinställningarna i texten, finns det en ungefärlig positiv 0,15 minuters förskjutning av retentionstiden för varje två kolökning i kedjelängd. Längre kedjelängdslipider som C24 och C26 kan dock ha större retentionstidsförskjutningar.Dessutom resulterar en dubbelbindning i fettsyran ofta i en negativ 0,15 minuters förskjutning av retentionstiden. Således kommer C18: 1-ceramid att ha en retentionstid som liknar C16-ceramid. I stället för att nästan uteslutande förlita sig på nyinsamlade vävnader, utvidgar detta protokoll de vävnadskällor som kan användas för masspektrometrianalys till att omfatta de kryogent lagrade på biorepositorier.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Fyra färgfluorescensimmunohistokemi av T-cell-subpopuleringar i Archival Formalin-fixade, paraffin-inbäddade humana orofaryngeala Squamous Cell Carcinomprover

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

Bestämning av Optimal Inhiberande Frekvens för cancerceller Använda Tumör Behandla Fields (TTFields)

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Tvådimensionell gelelektrofores tillsammans med masspektrometri metoder för en analys av mänskliga hypofysen adenom vävnad proteomet

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide anrikning tillsammans med etikett-fri kvantitativa masspektrometri att undersöka Phosphoproteome vid prostatacancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Elastisk färgning på paraffin-inbäddade diabilder av pT3N0M0 mag cancer vävnad

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Digital analys av immunofärgning av ZW10 interagerande protein i mänskliga lung vävnader

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Fånga småmolekylära kommunikation mellan vävnader och celler som använder Imaging masspektrometri

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Extraktion av vattenhaltiga metaboliter från odlade anhängare celler för Metabolomic analys av capillary Electrophoresis-masspektrometri

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Beredning av Mitokona från äggstocks cancer vävnader och kontrollera äggstocksvävnad för kvantitativ proteomik analys

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Utvärdera celldöd med hjälp av cellfri supernatant av probiotika i tredimensionella sfäroidkulturer av kolorektalcancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...