Name: preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis
Uploaded: 2021-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Araştırma projesinin hizmetleri ve desteği, kısmen NIH-NCI Kanser Merkezi Destek Hibe P30CA016059'un finansmanıyla desteklenen VCU Massey Kanser Merkezi Doku ve Veri Toplama ve Analiz Çekirdeği ve VCU Lipidomik ve Metabolomik Çekirdeği tarafından sağlanmıştır. Bu çalışma Ulusal Sağlık Hibeleri Enstitüleri R21CA232234 (Santiago Lima) tarafından desteklenmiştir.

Tanımlanmamış insan akciğer dokuları, Virginia Commonwealth Üniversitesi (VCU) Doku ve Veri Toplama ve Analiz Çekirdeğinden, dahili bir inceleme kurulu (IRB) onaylı protokol (#HM2471) kapsamında elde edilmiştir. Farelerin araştırma ve fare dokularının toplanması için kullanılması, VCU kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Malzemelerin hazırlanması
NOT: Bu adımlar doku yıkamadan bir gün önce y...

<ol>
	<li>Maceyka, M., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolites+in+inflammatory+disease.">Sphingolipid metabolites in inflammatory disease.</a> Nature. 510, 58-67 (2014).</li><li>Ogretmen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+metabolism+in+cancer+signalling+and+therapy.">Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Hla, T., Dannenberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipid+signaling+in+metabolic+disorders.">Sphingolipid signaling in metabolic disorders.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).</li><li>Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+and+Sphingosine+Kinase+1+involvement+in+endocytic+membrane+Trafficking.">Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).</li><li>Lima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+is+required+for+BECN1-+and+ATG5-dependent+cell+death+induced+by+sphingosine+kinase+1+inhibition.">TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition.</a> Autophagy. , 1-50 (2018).</li><li>Young, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine+Kinase+1+cooperates+with+autophagy+to+maintain+endocytic+membrane+trafficking.">Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking.</a> Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).</li><li>Young, M. M., Wang, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+as+regulators+of+autophagy+and+endocytic+trafficking.">Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking.</a> Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+endocytosis+and+sphingosine+kinase+1+recruitment.">Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment.</a> Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).</li><li>Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).</li><li>Rohrbach, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+sphingolipid+analysis+of+tissues+embedded+in+optimal+cutting+temperature+compound.">A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound.</a> Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).</li><li>Weston, L. A., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+LC-MS/MS+analysis+of+optimal+cutting+temperature+(OCT)+compound+removal+for+the+study+of+mammalian+proteomes.">Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes.</a> Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).</li><li>Holfeld, A., Vald&#233;s, A., Malmstr&#246;m, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+proteomic+workflow+for+mass+spectrometric+analysis+of+tissue+samples+preserved+by+different+methods.">Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).</li><li>Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteome+analysis+of+fresh+frozen+and+optimal+cutting+temperature+(OCT)+embedded+primary+non-small+cell+lung+carcinoma+by+LC-MS/MS.">Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS.</a> Methods. 81, 50-55 (2015).</li><li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+proteomics+using+chemical+immobilization+and+mass+spectrometry.">Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).</li></ol>

OKT, biyodepolarda kullanılan yaygın bir uzun süreli kriyo-koruma ajanıdır. Bununla birlikte, dokular çeşitli kütle spektrometresi platformları12,13,14,15 tarafından analiz edildiğinde OCT, iyon baskılanmasına neden olabilir veya numuneler LC-ESI-MS / MS11 tarafından analiz edildiğinde sinyal kaybına neden olabilir. Kriyokorunmuş dokulardaki OCT, Bradfor...

Sfengolipidler, insan metabolizması ve hastalığındaki rolleri ile bilinen biyoaktif metabolitlerdir 1,2. Hücre göçü, hücre sağkalımı ve ölümü, hücre hareketi, veziküler kaçakçılık, hücresel invazyon ve metastaz, anjiyogenez ve sitokinlerin üretimi gibi karmaşık hücresel süreçleri düzenlerler 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Sfengolipid metabolizmasının düzenlenmesindeki kusurlar, kanserlerin başlamasına ve ilerlemesine katkıda bulunur, kanserlerin ne kadar agresif olduğunu ve kanserlerin tedaviye nasıl tepki verdiğini ve direnç geliştirdiğini belirler 3,10. Bu nedenle, hastalığın etiyolojisi üzerindeki bu geniş etkileri nedeniyle, hastalığa özgü sfengolipid değişikliklerini kesin olarak belirleyebilen analitik yöntemler önemli araçlardır. Kütle spektrometresi (MS), sfengolipid değişikliklerini analiz etmek için en doğru ve güvenilir yöntemdir.
Sfengolipid değişikliklerinin analizi için kullanılabilecek insan örnekleri, cerrahi süitten prospektif olarak veya doku biyodepolarından retrospektif olarak elde edilebilir. Ameliyattan elde edilen taze dokular avantajlıdır çünkü MS veya diğer analitik yöntemlerle doğrudan analiz edilebilirler. Bununla birlikte, dokuların prospektif olarak elde edilmesinin idari, teknik ve lojistik engelleri vardır ve istatistiksel güce ulaşmak için yeterli örnek toplamak zor olabilir. Dokuların biyodepolardan elde edilmesi avantajlıdır, çünkü retrospektif olarak, çok sayıda edinilebilirler ve biyodepolar histoloji ve patolojiyi doğrular, dokuları kriyojenik olarak korumak ve depolamak için standart çalışma prosedürleri kullanır ve korelasyon analizleri için kullanılabilecek klinikopatolojik veriler sağlayabilir. Bununla birlikte, moleküler ve yapısal özellikleri korumak için, biyodepolar dokuları optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömerek kriyoprotektiflik edebilir, ki bu da veri normalleştirme tahlillerine ve sıvı kromatografisi elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometrisi (LC-ESI-MS / MS) 11 ile sfengolipidlerin nicelleştirilmesine müdahale ettiğini gösterdik. . OCT bileşiğindeki birincil bileşenler olan polivinil alkol ve polietilen glikolün, diğer MS analiz platformlarında iyon baskılanmasına neden olduğu da gösterilmiştir12,13,14,15. Bu nedenle, OCT bileşiği MS tarafından sfengolipidomik analizden önce dokulardan uzaklaştırılmalıdır.
Önceki bir raporda, LC-ESI-MS/MS analizi11 için OCT bileşiğinin insan örneklerinden çıkarılmasına yönelik bir protokolü ve veri normalizasyonu için dokuları tartmak için kullanılan metodolojiyi11 olarak doğrulamıştık. Burada, sfengolipidomik OCT bileşiği çıkarma protokolünün (sOCTrP) adımlarını detaylandırıyoruz ve insan akciğer adenokarsinom tümörlerinden ve normal bitişik tutulmamış dokulardan temsili veriler gösteriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL polypropylene pipette tips</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to retrieve specimens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89091-116</td>
			<td>Used for tube and tissue weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB Sciex Analyst 1.6.2</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software to analyze and integrate MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11550</td>
			<td>For LC mobile phases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Scale that is accurate to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle top dispenser</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>LH-723071</td>
			<td>Used for dispensing solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2212</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#946;-glucosyl-sphing-4-eine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2511</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-&#223;-lactosyl-sphing-4-ene</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2512</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12-Sphingomyelin&#160; (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2312</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHLOROFORM OMNISOLV 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1054-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClickSeal Biocontainment Lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75007309</td>
			<td>To prevent biohazard aeresols during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conflikt</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>4101</td>
			<td>Decontaminant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTO-20A/20AC Column Oven</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine;&#160; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2000</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>LM2144</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGU20A5R degasser</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes 13x100mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>13x100 mm screw top tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated water bath</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For overnight lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer 150</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-167</td>
			<td>triturate tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-177</td>
			<td>for homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>Laboratory grade tissue used to make wicks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol LC-MS Grade 4L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-MX0486-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexera LC-30 AD binary pump system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-502</td>
			<td>13x100 mm screw top tube caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>To retrieve specimens from tubes after washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4987000118</td>
			<td>To dispense LC-MS internal standards</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89239-020</td>
			<td>Autoinjector vial caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Thread Glass Vials with ID Patch</td>
			<td>VWR</td>
			<td>46610-724</td>
			<td>Autoinjector vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIL-30AC autoinjector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD2030P1220</td>
			<td>For drying solvents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53822-U</td>
			<td>For LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>NA</td>
			<td>For LC-ESI-MS/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic water bath</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model 2800</td>
			<td>for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For sOCTrP and resuspending dried lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47729572</td>
			<td>13x100 glass culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Hipersolve Chromanorm LC-MS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of human tissues embedded in optimal cutting temperature compound for mass spectrometry analysis

Sfengolipidler, insan metabolizmasında ve hastalığında iyi bilinen rollere sahip hücresel bileşenlerdir. Kütle spektrometrisi, sfingolipidlerin bir hastalıkta değişip değişmediğini belirlemek ve sfingolipidlerin klinik olarak hedeflenip hedeflenemeyeceğini araştırmak için kullanılabilir. Bununla birlikte, dokuları doğrudan cerrahi süitten alan uygun şekilde güçlendirilmiş prospektif çalışmalar zaman alıcı ve teknik, lojistik ve idari olarak zor olabilir. Buna karşılık, retrospektif çalışmalar, doku biyodepolarında genellikle çok sayıda bulunan kriyokorunmuş insan örneklerinden yararlanabilir. Dokuları biyodepolardan temin etmenin diğer avantajları, histoloji, patoloji ve bazı durumlarda klinikopatolojik değişkenler de dahil olmak üzere doku örnekleriyle ilişkili bilgilere erişimi içerir ve bunların hepsi lipidomik verilerle korelasyonları incelemek için kullanılabilir. Bununla birlikte, kriyoprezervasyonda ve kütle spektrometrisinde kullanılan optimal kesme sıcaklığı bileşiğinin (OCT) uyumsuzluğu ile ilgili teknik sınırlamalar, lipitlerin analizi için teknik bir engeldir. Bununla birlikte, OCT'nin, sfengolipid içeriğini değiştirmeden yıkama ve santrifüjleme döngüleri yoluyla insan biyodepo örneklerinden kolayca çıkarılabileceğini daha önce göstermiştik. Ayrıca, OKT'de kriyokorunmuş insan dokularındaki sfingolipidlerin 16 yıla kadar stabil olduğunu daha önce tespit etmiştik. Bu raporda, OCT'ye gömülü insan dokusu örneklerinde sfingolipidleri analiz etmek için kullanılan adımları ve iş akışını, yıkama dokuları, veri normalizasyonu için dokuların tartılması, lipitlerin ekstraksiyonu, sıvı kromatografisi elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometrisi (LC-ESI-MS / MS), kütle spektrometrisi veri entegrasyonu, veri normalizasyonu ve veri analizi ile analiz için numunelerin hazırlanması dahil olmak üzere özetlemekteyiz.

Bu protokolde, OKT'yi kriyo-korunmuş insan dokularından çıkarmak ve LC-ESI-MS / MS ile analiz edilmek üzere dokuları tartmak için bir yöntemi ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu prosedür için gerekli malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Şekil 1'de gösterilenler, 10 insan akciğer adenokarsinom tümörünün ve 10 normal bitişik dokunun OKT'yi çıkarmak için yıkandığı ve LC-ESI-MS / MS tarafından analiz edildiği tipik bir deneyin sonuçlarıd...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Sfengolipidler, insan hastalıklarında iyi bilinen rollere sahip biyoaktif metabolitlerdir. Kütle spektrometresi ile dokulardaki değişikliklerin karakterize edilmesi, hastalık etiyolojisindeki rolleri ortaya çıkarabilir veya terapötik hedefleri tanımlayabilir. Bununla birlikte, biyodepolarda kriyoprezervasyon için kullanılan OCT bileşiği, kütle spektrometrisine müdahale eder. OCT'ye gömülü insan dokularındaki sfingolipidleri LC-ESI-MS / MS ile analiz etme yöntemlerini özetliyoruz.

Kütle Spektrometrisi Analizi için Optimum Kesme Sıcaklığı Bileşiğine Gömülü İnsan Dokularının Hazırlanması

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

OCT, kütle spektrometrisi analizi ile uyumlu olmayan bir kriyo-koruma ajanıdır. Bu protokolü kullanarak, araştırmacılar OCT'yi dokulardan çıkarabilir ve tandem sıvı kromatografisi kütle spektrometresi ile sfengolipidleri ölçebilirler. Doku kurutma fitillerinin hazırlanması, doku yıkama ve doku tartımı Virginia Commonwealth Üniversitesi'nden April Boyd tarafından gösterilecek ve lipit ekstraksiyonu Virginia Commonwealth Metabolomik ve Lipidomik Çekirdeği direktörü Dr. Jeremy Allegood tarafından gösterilecektir.Başlamak için, cerrahi makası beş dakika boyunca metanole batırarak temizleyin, ardından temiz bir laboratuvar sınıfı doku ile silin. Pudrasız eldivenler kullanarak, ince konik 30 ila 40 milimetre uzunluğunda bir fitil oluşturmak için laboratuvar sınıfı bir dokunun ucunu döndürün. Daha sonra metanolü kullanarak makas temizlenir, fitili kalın ucundan kesin ve temiz bir karton kutuya yerleştirin.Daha sonra, metanol temizlenmiş makası kullanarak, bir mililitrelik pipet ucunun ucundan dört ila beş milimetre kesin, ucu tekrar uç tutucuya yerleştirin. OCT'yi dokulardan temizlemek için, insan akciğer dokusunu içeren her tüpe 10 mililitre buz gibi soğuk ultra saf deiyonize su ekleyin ve sıkıca kapatın. Tüplerin 10 dakika boyunca inkübe olmasına izin verin.Tüpün duvarlarında biriken tüm doku veya doku peleti tamamen yeniden askıya alınana kadar her tüpü kuvvetlice vorteksleyin. Daha sonra tüpleri önceden soğutulmuş sallanan bir kova santrifüjünde dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 4.000 ila 5.000 kez G'de santrifüj yapın. Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, tüplerin kapağını buz üzerinde açın.Yıkama çözeltisini dikkatlice aspire edin, tüpün içinde yaklaşık 0,5 mililitre süpernatant bırakın, ardından tüpü yeniden doldurun. Süpernatantı tüm tüplerden çıkardıktan sonra, dokuları aynı şekilde iki kez daha yıkayın. Üç OCT çıkarma yıkamasından sonra, tüpe 500 mikrolitre buz gibi soğuk PBS eklemek için hazırlanan kısaltılmış pipet ucunu kullanın.Aynı ucu kullanarak, peleti nazikçe yeniden askıya alın ve yeniden askıya alınan tüm dokuyu önceden etiketlenmiş ve önceden tartılmış 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüm doku örnekleri transfer edilene kadar tüpü buz üzerinde tutun. Tüpleri önceden soğutulmuş bir santrifüjde santrifüj yaparak dokuları pelet edin, daha sonra peleti rahatsız etmeden PBS'nin mümkün olduğunca çoğunu dikkatlice aspire edin ve tüpleri tekrar buzun üzerine yerleştirin.Daha önce hazırlanan doku kurutma fitillerini kullanarak, kalan yıkama solüsyonunu nazikçe çıkarın, ardından tüpü kapatın ve buzun üzerine yerleştirin. Tüpleri tartmak için, yakın zamanda kalibre edilmiş katranlı ve sıfırlanmış analitik teraziye her seferinde bir tüp yerleştirin ve hazne kapağını kapatın. Ağırlık stabilize edildikten sonra, elektronik bir elektronik tabloya kaydedin.Tarttıktan sonra, tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin ve 300 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ekleyin. Kısaltılmış bir pipet ucu kullanarak, tüm dokuyu önceden etiketlenmiş vidalı bir cam tüp içinde iki mililitre buz gibi soğuk metanole dikkatlice aktarın. Lipid ekstraksiyonundan önce, dokuların ve kütle spektrometrisi iç lipit standartlarının 20 dakika boyunca oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin, daha sonra vorteks yapın ve lipit standartları tamamen çözülene kadar iç standart çözeltileri ultrasonik bir su banyosuna daldırın.Tekrarlanan bir pipet kullanarak, her tüpe dahili kütle spektrometresi standartlarında 250 pikomol ekleyin ve tüpleri hafifçe özetleyin. Homojenizasyonu kolaylaştırmak için, metanolün hacmini iki mililitreye ayarlayın, ardından homojenizatör ucunu tüp duvarına hafifçe bastırılmış dairesel bir hareketle hareket ettirerek bir homojenizatör kullanarak dokuyu tritürleştirin. Kümeler artık görünmediğinde, tüpü yeniden özetleyin.Tüpü 45 derecelik bir açıyla ultrasonik bir su banyosunda 5 ila 10 saniye bekletin. Daha sonra bir duman başlığı altında, iki ila bir ila 0.1 arasında bir metanol ila kloroform su oranı elde etmek için her tüpe kloroform ve metanol ekleyin. Tüpleri sıkıca kapatın ve günün sonuna kadar tezgahın üzerinde bırakın.O akşam ayrılmadan önce, sıkıca kapatılmış tüpleri bir gece inkübasyonu için 48 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Ertesi gün, santrifüjleme ile herhangi bir çözücü ve çözünür döküntüyü pelet edin. Daha sonra bir duman davlumbazında, süpernatantı dikkatlice 13 ila 100 milimetre borosilikat cam test tüplerine boşaltın ve dekantasyonu kolaylaştırmak için 30 ila 45 derecelik bir açıyla eğilin.Süpernatantı tüm tüplerden boşalttıktan sonra, tüm çözücüyü buharlaştırmak için 40 santigrat derecede ilk bir saatlik ısıtma adımıyla maksimum vakumda bir vakum yoğunlaştırıcı kullanın, ardından her tüpe 500 mikrolitre metanol ekleyin. Kurutulmuş lipit ekstraktlarını yeniden askıya almak için, tüpü 5 ila 10 saniye boyunca vorteksleyin, ardından tüpü iki dakika boyunca rotasyonla 45 derecelik bir açıyla ultrasonik bir su banyosuna batırın. Tüpü beş saniye boyunca yeniden vorteksleyin ve bir dakika daha ultrasonik su banyosuna tekrar daldırın.Çözünmeyen kalıntıları santrifüjleme ile temizleyin, ardından süpernatantı dekantasyonu kolaylaştırmak için 30 ila 45 derecelik bir açıyla eğilmiş önceden etiketlenmiş bir otomatik enjektör şişesine boşaltın. Şişeleri analize kadar eksi 80 santigrat derecede saklamadan önce sıkıca kapatın. OCT çıkarılmasını takiben sıvı kromatografisi elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometrisi analizi, insan akciğer adenokarsinom tümörlerinde normal bitişik tutulmamış dokulara kıyasla çeşitli zincir boyu seramidler ve monohekzosil-seramidlerin türlerinin önemli ölçüde yükseldiğini doğrulamaktadır.Sfengolipid standartları aşağıdaki sırayla sırayla ortaya çıkar: d17: 1 sfengosin, d17: 1 sfengosin-1-fosfat, C12 laktosil-seramid, C12 monoheksosil-seramid, C12 sfingomiyelin ve C12 seramid. Bu sfengolipid türlerinin her biri için, metindeki gradyan ve enstrümantasyon ayarlarını kullanarak, zincir uzunluğundaki her iki karbon artışı için tutma süresinde yaklaşık pozitif 0.15 dakikalık bir kayma vardır. Bununla birlikte, C24 ve C26 gibi daha uzun zincir uzunluğundaki lipitler daha büyük tutma süresi kaymalarına sahip olabilir.Ayrıca, yağ asidindeki bir çift bağ genellikle tutma süresinde negatif 0.15 dakikalık bir kaymaya neden olur. Böylece, C18: 1 seramid, C16 seramidine benzer bir tutma süresine sahip olacaktır. Neredeyse sadece taze toplanmış dokulara güvenmek yerine, bu protokol kütle spektrometrisi analizi için kullanılabilecek doku kaynaklarını, biyodepolarda kriyojenik olarak depolananları içerecek şekilde genişletir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Arşiv Formalin Sabitlenmiş, Parafin Gömülü İnsan Orofaringeal Skuamöz Hücreli Karsinoma Örneklerinde T-hücresi Subpopülasyonlarının Dört Renkli Floresan İmmunohistokimyası

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

Fields Tedavisi Tümör kullanma Kanserli Hücreleri için optimum inhibitör Frekans (TTFields) Belirlenmesi

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

İnsan hipofiz adenom doku Proteom analizi için kütle spektrometresi yöntemleri ile birleştiğinde iki boyutlu Jel Elektroforez

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Prostat kanserinde Phosphoproteome araştırmak için etiket içermeyen nicel kütle spektrometresi ile birleştiğinde Phosphopeptide zenginleştirme

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

Parafin üzerinde elastik boyama-pT3N0M0 gastrik kanser dokusu gömülü slaytlar

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Insan akciğer dokularında ZW10 etkileşim protein Immünoster dijital Analizi

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Doku ve kütle spektrometresi Imaging kullanarak hücreleri arasında küçük molekül iletişim yakalama

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Kılcal Elektroforez-kütle spektrometresi tarafından metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Yumurtalık Kanseri Dokularından Mitokondri Hazırlanması ve Kantitatif Proteomik Analizi Için Yumurtalık Dokularının Kontrolü

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Kolorektal Kanser Hücrelerinin Üç Boyutlu Küresel Kültürlerinde Probiyotiklerin Hücresiz Süpernatantı Kullanılarak Hücre Ölümünün Değerlendirilmesi

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...