Name: assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

نشكر ماري كريستين كارون على المشورة الفنية المتميزة. يتم دعم هذا العمل بتمويل من المعاهد الكندية للبحوث الصحية J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. يحمل كرسي أبحاث كندا من المستوى 1 في إصلاح الحمض النووي وعلاجات السرطان. J.O'S هو زميل طالب دكتوراه FRQS ، و S.Y.M هو زميل ما بعد الدكتوراه FRQS.

1. زراعة الخلايا والعلاجات وإعداد الغطاء
ملاحظة: يجب أن تتم جميع عمليات طلاء الخلايا وعمليات النقل والعلاجات، بصرف النظر عن التشعيع، تحت غطاء معقم لزراعة الخلايا.
<ol><li>اليوم 1<ol>
<li>في طبق مكون من 6 آبار ، ضع غطاء واحد في كل بئر لأكبر عدد ممكن من الظروف حسب الحاجة. لوحة ~ 150،000 خل?...

<ol>
	<li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response.">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li><li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells.">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes.">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li><li>Ronato, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+the+DNA+double-strand+break+resectosome+for+genome+protection.">Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection.</a> Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1-driven+poly-ADP-ribosylation+regulates+BRCA1+function+in+homologous+recombination-mediated+DNA+repair.">PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair.</a> Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).</li><li>Satoh, M. S., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+poly(ADP-ribose)+formation+in+DNA+repair.">Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair.</a> Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).</li><li>Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP-1+ensures+regulation+of+replication+fork+progression+by+homologous+recombination+on+damaged+DNA.">PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li><li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy.">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li><li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance:+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells.">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li><li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks.">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).</li><li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells.">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).</li><li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage.">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li><li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection.">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li><li>Huertas, P., Cruz-Garc&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+resection+tracks.">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li><li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection.">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li></ol>

تصف هذه الورقة طريقة تستخدم تلطيخ IF لقياس الاختلافات في استئصال الحمض النووي في السليلولو. المعيار الحالي لمراقبة تأثير على استئصال الحمض النووي هو من خلال تلطيخ RPA. ومع ذلك ، هذه طريقة غير مباشرة قد تتأثر بتكرار الحمض النووي. في السابق ، تم وصف تقنية أخرى لاستئصال الحمض النووي القائم ...

يعد تعديل عوامل إصلاح الحمض النووي طريقة دائمة التطور لعلاج السرطان ، خاصة في بيئات الأورام التي تعاني من نقص في إصلاح الحمض النووي. يعد تثبيط عوامل إصلاح محددة أحد الاستراتيجيات البارعة المستخدمة لتوعية الخلايا السرطانية بالعوامل الضارة بالحمض النووي. أدت عقود من الأبحاث إلى تحديد طفرات مختلفة من جينات إصلاح الحمض النووي كمؤشرات حيوية لخيارات الاستراتيجية العلاجية1. ونتيجة لذلك، أصبح مجال إصلاح الحمض النووي مركزا لتطوير الأدوية لضمان مجموعة واسعة من العلاجات، وتمكين مفهوم الطب الشخصي. 
يتم إصلاح DSBs من خلال مسارين رئيسيين: NHEJ و HR2. مسار NHEJ عرضة للخطأ ، حيث يربط بسرعة نهايتين من الحمض النووي مع القليل من المعالجة النهائية للحمض النووي أو لا يوجد على الإطلاق ويتضمن بروتين كيناز (DNA-PKcs) ، ومركب Ku70/80 ، و 53BP1 ، وبروتينات RIF1 3. في المقابل ، الموارد البشرية هي آلية مخلصة بدأتها BRCA14. خطوة أساسية في إصلاح الموارد البشرية هي عملية استئصال نهاية الحمض النووي ، وهي تدهور النهايات المكسورة مما يؤدي إلى الحمض النووي الأحادي (SS) مع نهايات 3'-OH. يسهل BRCA1 توظيف البروتينات النهائية التي تشكل MRN / RPA / BLM / DNA2 / EXO1 ، والتي تشارك في استئصال الحمض النووي من 5 إلى 3 أقدام5.
يتم إنجاز الاستئصال النهائي الأولي من خلال نشاط endonuclease لل MRE11 ، مما يسمح بمزيد من المعالجة بواسطة nucleases DNA2 و EXO1. يتم طلاء بقايا ssDNA المتولدة بسرعة بواسطة بروتين النسخ المتماثل A (RPA) لحمايتها من المعالجة الإضافية. بعد ذلك ، تشارك BRCA2 و PALB2 و BRCA1 في التوسط في إزاحة RPA وتجميع نواة RAD51 المطلوبة لآلية الإصلاح الموجهة بالتماثل. من الضروري وجود توازن دقيق بين استخدام NHEJ والموارد البشرية للحفاظ الأمثل على السلامة الجينومية. يعتمد اختيار المسار على مرحلة دورة الخلية. يتم استخدام الموارد البشرية بشكل تفضيلي خلال المراحل من S إلى G2 حيث يكون استئصال الحمض النووي على أعلى مستوى ، وتتوفر الكروماتيدات الشقيقة لضمان الإصلاح المناسب.
بوليميراز بولي (ADP-ribose) 1 (PARP-1) هو واحد من أوائل البروتينات التي تم تجنيدها في DSB. وهو ينظم كل من نشاط الاستئصال وتجميع المؤثرات النهائية المشاركة في NHEJ5,6. مطلوب PARP-1 أيضا لإصلاح كسر الحمض النووي أحادي الخيط أثناء النسخ المتماثل7,8. نظرا لدورها المهم في إصلاح الحمض النووي ، يتم استخدام مثبطات PARP (PARPi) كعلاجات للسرطان. في العديد من أنواع السرطان التي تعاني من نقص الموارد البشرية ، يؤدي علاج PARPi إلى استجابة قاتلة اصطناعية بسبب عجز الخلايا التي تعاني من نقص الموارد البشرية عن إصلاح الضرر المتراكم عبر مسار بديل9,10. يوجد حاليا أربعة PARPi معتمدين من إدارة الأغذية والعقاقير: أولاباريب ، روكاباريب ، نيريباريب ، وتالازوباريب (وتسمى أيضا BMN 673) ، والتي تستخدم لمختلف علاجات سرطان الثدي والمبيض11. ومع ذلك ، فإن مقاومة PARPi شائعة ، وينشأ أحد الأسباب المحتملة من خلال استعادة كفاءة الموارد البشرية 12. فقدان أو تثبيط PARP-1 في وجود خلل التشعيع ينظم آلية الاستئصال ، مما يؤدي إلى تراكم مساحات ssDNA أطول13. لذلك ، فإن إجراء دراسة متعمقة لاستئصال الحمض النووي في الجسم الحي أمر بالغ الأهمية لفهم أوضح لمسارات إصلاح الحمض النووي والتطوير اللاحق لاستراتيجيات جديدة لعلاج السرطان والتغلب على مقاومة PARPi.
كانت هناك عدة طرق مستخدمة للكشف عن أحداث استئصال الحمض النووي5. إحدى هذه الطرق هي التقنية الكلاسيكية القائمة على IF التي تسمح بالتلطيخ غير المباشر وتصور الحمض النووي المستأصل بعد DSB الناجم عن الإجهاد باستخدام جسم مضاد مضاد ل RPA. إن وضع العلامات على الحمض النووي الجيني باستخدام 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) والكشف عن ssDNA فقط هو قياس مباشر لأحداث استئصال الحمض النووي. إنه يتحايل على مراقبة RPA ، التي تشارك في عمليات خلوية متعددة مثل تكرار الحمض النووي. في الطريقة الموضحة هنا ، تسمح الخلايا المحتضنة ب BrdU لدورة خلية واحدة بدمج BrdU في خيط واحد من الحمض النووي الخلوي المكرر. بعد الاستئصال ، يتم إجراء تلطيخ IF في ظل ظروف تسمح باكتشاف BrdU فقط في شكل ssDNA ، باستخدام جسم مضاد مضاد ل BrdU. يمكن لهذا الجسم المضاد الوصول فقط إلى نيوكليوتيدات BrdU المكشوفة ولن يكتشف تلك المدمجة في الحمض النووي المزدوج العالق. باستخدام المجهر الفلوري ، يمكن تصور الحمض النووي المقطوع في شكل بؤر BrdU / ssDNA مثقوبة. يمكن استخدام الكثافة النووية لهذه البؤر كقراءة لتحديد كمية الاستئصال بعد تلف الحمض النووي. تصف هذه الورقة خطوة بخطوة عمليات هذه الطريقة ، والتي يمكن تطبيقها على معظم خطوط خلايا الثدييات. يجب أن تكون هذه الطريقة ذات فائدة واسعة كطريقة بسيطة لمراقبة استئصال نهاية الحمض النووي في السليلولو ، كدليل على المفهوم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PARP1 (F1-23)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PCNA (SY12-07)</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-67390</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha tubulin (DM1A)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7291</td>
			<td>1:100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BrdU</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN202</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop X-ray Irradiator</td>
			<td>Cell Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMN673</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-16106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine (BrdU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>V 3.19</td>
			<td>https://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10063542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12 541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td>63x immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>51030408</td>
			<td>37% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>MAG520.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SOD002.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Wisent Bio Products</td>
			<td>311-010-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>15710-S(EM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>P-36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siPARPi</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA control</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholcate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SUC507.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TRS001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trition X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging

تعد دراسة الاستجابة لتلف الحمض النووي (DDR) مجالا معقدا وأساسيا ، والذي أصبح أكثر أهمية فقط بسبب استخدام الأدوية التي تستهدف DDR لعلاج السرطان. هذه الأهداف هي البوليميراز البولي (ADP-ribose) (PARPs) ، والتي تبدأ أشكالا مختلفة من إصلاح الحمض النووي. إن تثبيط هذه الإنزيمات باستخدام مثبطات PARP (PARPi) يحقق الفتك الاصطناعي من خلال منح ضعف علاجي في الخلايا التي تعاني من نقص في إعادة التركيب المتماثل (HR) بسبب الطفرات في سرطان الثدي من النوع 1 (BRCA1) أو BRCA2 أو شريك وتوطين BRCA2 (PALB2). 
الخلايا المعالجة ب PARPi تتراكم فواصل الحمض النووي مزدوجة الخيط (DSBs). تتم معالجة هذه الفواصل بواسطة آلية استئصال نهاية الحمض النووي ، مما يؤدي إلى تكوين الحمض النووي الأحادي (SS) وإصلاح الحمض النووي اللاحق. في سياق BRCA1 الناقص ، يؤدي تنشيط استئصال الحمض النووي من خلال الطفرات في مثبطات استئصال الحمض النووي ، مثل 53BP1 و DYNLL1 ، إلى مقاومة PARPi. لذلك ، فإن القدرة على مراقبة استئصال الحمض النووي في السيلولو أمر بالغ الأهمية لفهم أوضح لمسارات إصلاح الحمض النووي وتطوير استراتيجيات جديدة للتغلب على مقاومة PARPi. تسمح التقنيات القائمة على التألق المناعي (IF) بمراقبة استئصال الحمض النووي العالمي بعد تلف الحمض النووي. تتطلب هذه الاستراتيجية وضع علامات الحمض النووي الجينومي طويل النبض باستخدام 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU). بعد تلف الحمض النووي واستئصال نهاية الحمض النووي ، يتم الكشف عن الحمض النووي الناتج الذي تقطعت به السبل على وجه التحديد بواسطة جسم مضاد مضاد ل BrdU في ظل ظروف أصلية. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا دراسة استئصال الحمض النووي باستخدام علامات دورة الخلية للتمييز بين المراحل المختلفة لدورة الخلية. تسمح الخلايا في مرحلة S / G2 بدراسة الاستئصال النهائي داخل HR ، في حين يمكن استخدام خلايا G1 لدراسة الانضمام النهائي غير المتجانس (NHEJ). يتم وصف بروتوكول مفصل لطريقة IF هذه إلى جانب التمييز في دورة الخلية في هذه الورقة.

في هذا البروتوكول ، تم استخدام الفحص القائم على بروموديوكسي يوريدين (BrdU) لقياس استجابة استئصال خلايا HeLa للضرر الناجم عن الإشعاع كميا. يتم تصور مسارات ssDNA المتولدة كبؤر متميزة بعد تلطيخ التألق المناعي (الشكل 1A). ثم تم تحديد البؤر المحددة كميا والتعبير عنها على أنها الكثافة ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

في البروتوكول الحالي ، نوضح كيفية تصور استئصال نهاية الحمض النووي المزدوج خلال مرحلة S / G2 من دورة الخلية باستخدام طريقة قائمة على التألق المناعي.

تقييم استئصال نهاية الحمض النووي المزدوج العالمي باستخدام وسم الحمض النووي BrdU إلى جانب تصوير تمييز دورة الخلية

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

يسمح هذا البروتوكول في السيلولو بتحديد كمية الحمض النووي واستئصال الحمض النووي بعد تلف الحمض النووي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي وضع علامة على دورة الخلية التي تقيد الخلايا إلى المرحلة S و G2 ، مما يضمن نتائج إشارة بروموديوكسي يوريدين من الحمض النووي والاستئصال. وسيشارك في هذا الإجراء جان إيف ماسون، الباحث الرئيسي، وسفيان المرساوي، باحث ما بعد الدكتوراه.من خلال العمل تحت غطاء استزراع معقم ، ضع غطاء واحدا في كل بئر من صفيحة من ستة آبار لأكبر عدد ممكن من الظروف اللازمة. لوحة ما يقرب من 150،000 خلايا HeLa لنقل أو العلاج من تعاطي المخدرات. في اليوم الثالث ، بعد الحضانة بين عشية وضحاها مع BrdU بتركيز نهائي من 10 ميكرومولار ، قم بتشعيع الألواح بجرعة إجمالية قدرها خمسة رمادية من تشعيع الأشعة السينية.بعد التشعيع ، أعد الألواح للحضانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مبللة بأكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة ثلاث ساعات. قبل الاستخراج ، قم بشفط الوسط واغسل الخلايا بعناية مرتين باستخدام PBS. بعد إزالة PBS ، أضف ملليلترين من المخزن المؤقت A قبل الاستخراج واحتضن الخلايا عند أربع درجات مئوية على الجليد لمدة 10 دقائق.بعد 10 دقائق ، قم بشفط المخزن المؤقت A ، وأضف ملليلتر من المخزن المؤقت لتجريد الهيكل الخلوي B ، وكرر الحضانة. ثم قم بشفط المخزن المؤقت B بعناية واغسل الخلايا باستخدام PBS. بعد شفط PBS ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة ملليلترين من 4٪ من بارافورمالدهيد تحت الغطاء الكيميائي.بعد إزالة البارفورمالديهايد ويغسل باستخدام PBS ، قم بتغطية الأغطية بالميثانول البارد بنسبة 100٪ للحضانة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة خمس دقائق واغسل الأغطية مرتين باستخدام PBS. من أجل التخلل ، احتضن الخلايا بملليلترين من PBS تحتوي على 0.5٪ Tritan X-100 في درجة حرارة الغرفة. بعد 15 دقيقة ، اغسل الغطاء ثلاث مرات بملليلتر من PBS.للتلطيخ المناعي ، أضف ملليلترين من المخزن المؤقت المانع إلى كل بئر. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي إلى كل غطاء. استخدم الملقط لتغطية الأغطية ببارافيلم مربع ووضع البارافيلم بعناية لعدم إنشاء فقاعات.ثم قم بتغطية الصفيحة بورق الألومنيوم واحتضن الجسم المضاد الأساسي بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية في غرفة رطبة. في اليوم التالي ، قم بإزالة مربعات parafilm واغسل الأغطية ثلاث مرات بملليلتر من PBS. بعد الغسيل ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي على كل غطاء وقم بتغطية الأغطية بمربع من البارافيلم كما هو موضح.احتضن الجسم المضاد الثانوي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة واحم اللوحة من الضوء باستخدام رقائق معدنية. ثم اغسل الأغطية ثلاث مرات بملليلتر من 1X PBS. للتلطيخ النووي ، أضف ملليلترين من محلول DAPI إلى كل غطاء واغسل الأغطية باستخدام PBS.أضف 10 إلى 20 ميكرولتر من وسط التركيب الخاص ب IF على شرائح المجهر. استخدم الإبرة أو الملقط الناعم لرفع الغطاء من أسفل البئر. قم بمسح السائل الزائد بعناية عن طريق النقر على حافة واحدة بلطف على منشفة ورقية وقم بتركيب الغطاء على شرائح المجهر.للحصول على الصور وتحليلها ، قم باستيراد هذه الملفات إلى CellProfiler وتحليلها باستخدام خط أنابيب عد البقع . تحديد الكائن الأساسي لتحديد البؤر باستخدام الإعدادات الموضحة في مخطوطة النص وقياس الكثافة. تظهر هنا صور تمثيلية لبؤر 5-bromo-2-prime-deoxyuridine وتكاثر مستضد الخلية النووي بعد التشعيع.تم تصور مسارات الحمض النووي التي تم إنشاؤها على أنها بؤر متميزة. ثم تم تحديد البؤر المحددة كميا والتعبير عنها على أنها الكثافة المتكاملة الكلية لتلطيخ بروموديوكسي يوريدين في النوى. أظهر التلطيخ المشترك تمايزا بين الاستئصال قصير المدى بسبب الانضمام النهائي غير المتجانس والاستئصال بعيد المدى لإعادة التركيب المتماثل باستخدام جسم مضاد مضاد ل PCNA لتحديد الخلايا التي تمر بمرحلة S.PCNA بارز في النواة ويصل إلى أقصى تعبير خلال المرحلة S من دورة الخلية مع تلطيخ مكثف للغاية. ثم يتم رسم النتيجة في القيم كمخطط مبعثر للتمييز بين النوى الإيجابية PCNA و PCNA السلبية. تتم إزالة النتائج السلبية PCNA من مجموعة البيانات للسماح بالتحليل القائم على كثافة BrdU بسبب إشارة BrdU المنخفضة بغض النظر عن الحالة.تحتوي النوى السالبة PCNA على كثافة متكاملة قاعدية لبؤر BrdU تبلغ 900 وحدة تعسفية وتصل هذه القيمة إلى 1،800 وحدة فلكية في النوى الإيجابية PCNA. في حالة التحكم في siRNA ، تبلغ الكثافة المتكاملة لبؤر BrdU لكل نواة حوالي 1،500 وحدة فلكية في النوى الإيجابية PCNA. بعد ضربة قاضية فعالة من PARP-1 باستخدام siRNA ، لوحظت زيادة كبيرة في كثافة بؤر BrdU إلى ما يقرب من 1،900 وحدة فلكية.يمكن أن توفر هذه التقنية رؤى رئيسية في المرحلة الأولى من إعادة التركيب المتماثل ، مما يساعد على تحديد ما إذا كان البروتين متورطا في الخطوة الأولى من مسار الإصلاح. يجب الحفاظ على وقت الحضانة للمخازن المؤقتة قبل الاستخراج بدقة. سيؤدي التعرض المفرط لهذه المخازن المؤقتة إلى انفصال الخلايا بشكل مفرط وزيادة إشارة الخلفية.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

قياس إيماس في الخلايا العصبية عن طريق وصفها وزير الخارجية

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

ووضع العلامات hESCs hMSCs مع أوكسيد الحديد النانوية لعدم الغازية في تعقب المجراة مع التصوير بالرنين المغناطيسي

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

وسم الخلايا الجذعية مع الأصباغ نيون للمنظمات غير الغازية مع الكشف عن التصوير الضوئي

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

تحليل مزدوج الجديلة إصلاح الحمض النووي (DSB) فاصل في خلايا الثدييات

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

الكمي من البروتينات عن طريق التخصيب الببتيد Immunoaffinity اقترن الطيف الكتلي

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

قياس حركية تقدم دورة الخلية مع وصفها الأيض والتدفق الخلوي

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

تحليل دورة الخلية الحية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة باستخدام الصوتية أقلم التركيز عداد الكريات وVybrant DyeCycle البنفسج الحمض النووي وصمة عار

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

التمييز وتوصيف السكان غير المتجانسة باستخدام تقنيات التصوير الكمي

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...