Name: assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

Vi takker Marie-Christine Caron for fremragende teknisk rådgivning. Dette arbejde støttes af finansiering fra Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. har en Tier 1 Canada Research Chair i DNA Repair and Cancer Therapeutics. J.O'S er en FRQS ph.d.-studerende stipendiat, og S.Y.M er en FRQS postdoc.

1. Cellekultur, behandlinger og forberedelse af coverslip
BEMÆRK: Al cellebelægning, transfektioner og behandlinger, bortset fra bestråling, skal finde sted under en steril cellekulturhætte.
<ol><li>Dag 1<ol>
<li>I en 6-brønds plade skal du placere et enkelt dækslip i hver brønd under så mange forhold som nødvendigt. Plade ~ 150.000 HeLa-celler til transfektion eller lægemiddelbehandling efter ønske. BEMÆRK: Ved transfektering anbefales det at foretage en omvendt transfektion ...

<ol>
	<li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response.">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li><li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells.">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes.">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li><li>Ronato, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+the+DNA+double-strand+break+resectosome+for+genome+protection.">Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection.</a> Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1-driven+poly-ADP-ribosylation+regulates+BRCA1+function+in+homologous+recombination-mediated+DNA+repair.">PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair.</a> Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).</li><li>Satoh, M. S., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+poly(ADP-ribose)+formation+in+DNA+repair.">Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair.</a> Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).</li><li>Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP-1+ensures+regulation+of+replication+fork+progression+by+homologous+recombination+on+damaged+DNA.">PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li><li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy.">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li><li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance:+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells.">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li><li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks.">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).</li><li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells.">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).</li><li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage.">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li><li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection.">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li><li>Huertas, P., Cruz-Garc&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+resection+tracks.">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li><li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection.">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li></ol>

Dette papir beskriver en metode, der gør brug af IF-farvning til at måle variationer i DNA-resektion i cellulo. Den nuværende standard for observation af en effekt på DNA-resektion er gennem RPA-farvning; Dette er imidlertid en indirekte metode, der kan påvirkes af DNA-replikation. Tidligere er en anden BrdU-inkorporeringsbaseret DNA-resektion IF-teknik blevet beskrevet til klassificering af de resulterende intensiteter i BrdU-positive og BrdU-negative celler. Denne metode gjorde det muligt for celler, der ...

Modulering af DNA-reparationsfaktorer er en stadigt udviklende metode til kræftbehandling, især i DNA DSB-reparationsmangelfulde tumormiljøer. Hæmningen af specifikke reparationsfaktorer er en af de geniale strategier, der bruges til at sensibilisere kræftceller til DNA-skadelige stoffer. Årtiers forskning førte til identifikation af forskellige mutationer af DNA-reparationsgener som biomarkører for terapeutiske strategivalg1. Derfor er DNA-reparationsfeltet blevet et knudepunkt for lægemiddeludvikling for at sikre en bred vifte af behandlinger, der styrker konceptet med personlig medicin. 
DSB'er repareres af to hovedveje: NHEJ og HR2. NHEJ-vejen er fejlbehæftet og ligerer hurtigt de to DNA-ender med ringe eller ingen DNA-slutbehandling og involverer proteinkinase (DNA-PKcs), Ku70/80-komplekset, 53BP1 og RIF1-proteiner3. I modsætning hertil er HR en trofast mekanisme initieret af BRCA14. Et vigtigt skridt i HR-reparation er DNA-end-resektionsprocessen, som er nedbrydningen af de ødelagte ender, der fører til enkeltstrenget (ss) DNA med 3'-OH-ender. BRCA1 letter rekrutteringen af de downstream-proteiner, der danner resektosomet MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, som er involveret i 5' til 3' DNA-resektionen5.
Den indledende slutresektion opnås gennem endonukleaseaktiviteten af MRE11, hvilket muliggør yderligere behandling af DNA2- og EXO1-nukleaserne. De genererede ssDNA-udhæng er hurtigt belagt med replikationsprotein A (RPA) for at beskytte dem mod yderligere behandling. Derefter engagerer BRCA2, PALB2 og BRCA1 sig i at formidle forskydningen af RPA og samlingen af RAD51-nukleofilamentet, der kræves til homologistyret reparationsmekanisme. En fin balance mellem brugen af NHEJ og HR er nødvendig for optimal opretholdelse af genomisk integritet. Valget af vej afhænger af cellecyklusfasen. HR anvendes fortrinsvis i S til G2-faserne, hvor DNA-resektion er på højeste niveau, og søsterkromatider er tilgængelige for at sikre korrekt reparation.
Poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) er et af de tidligste proteiner, der rekrutteres til DSB. Det regulerer både resektionsaktivitet og samling af downstream-effektorer, der er involveret i NHEJ5,6. PARP-1 er også påkrævet til DNA-enkeltstrenget brudreparation under replikation7,8. På grund af sin vigtige rolle i DNA-reparation anvendes PARP-hæmmere (PARPi) som kræftbehandlinger. I flere HR-mangelfulde kræftformer fører PARPi-behandling til et syntetisk dødeligt respons på grund af HR-mangelfulde cellers manglende evne til at reparere den akkumulerede skade via en alternativ vej9,10. Der er i øjeblikket fire FDA-godkendte PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib og Talazoparib (også kaldet BMN 673), som bruges til forskellige bryst- og æggestokkræftbehandlinger11. PARPi-resistens er imidlertid almindelig, og en potentiel årsag opstår gennem generhvervelsen af HR-færdigheder12. Tab eller hæmning af PARP-1 i nærvær af bestrålingsdysregulerer resektosommaskineriet, hvilket fører til akkumulering af længere ssDNA-kanaler13. Derfor er en tilgrundsgående undersøgelse af DNA-resektion in vivo afgørende for en klarere forståelse af DNA-reparationsvejene og den efterfølgende udvikling af nye strategier til behandling af kræft og til at overvinde PARPi-resistens.
Der har været anvendt flere metoder til at detektere DNA-resektionshændelser5. En sådan metode er den klassiske IF-baserede teknik, der muliggør indirekte farvning og visualisering af det resekteret DNA efter stressinduceret DSB ved anvendelse af et anti-RPA-antistof. Mærkning af genomisk DNA med 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU) og påvisning af kun ssDNA er en direkte måling af DNA-resektionshændelser. Det omgår overvågningen af RPA, som er involveret i flere cellulære processer såsom DNA-replikation. I den metode, der er beskrevet her, tillader celler inkuberet med BrdU for en enkelt cellecyklus, at BrdU inkorporeres i en streng af det replikerende cellulære DNA. Efter resektion udføres IF-farvning under forhold, der tillader brdU-detektion kun i ssDNA-form ved anvendelse af et anti-BrdU-antistof. Dette antistof kan kun få adgang til eksponerede BrdU-nukleotider og vil ikke detektere dem, der er integreret i dobbeltstrenget DNA. Ved hjælp af fluorescensmikroskopi kan det resekterede DNA visualiseres i form af punktere BrdU / ssDNA-foci. Den nukleare intensitet af disse foci kan bruges som en aflæsning til at kvantificere resektion efter DNA-skade. Dette papir beskriver trin for trin processerne i denne metode, som kan anvendes på de fleste pattedyrs cellelinjer. Denne metode bør være af bred nytte som en enkel måde at overvåge DNA-enderesektion i cellulo, som et bevis på konceptet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PARP1 (F1-23)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PCNA (SY12-07)</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-67390</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha tubulin (DM1A)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7291</td>
			<td>1:100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BrdU</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN202</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop X-ray Irradiator</td>
			<td>Cell Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMN673</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-16106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine (BrdU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>V 3.19</td>
			<td>https://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10063542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12 541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td>63x immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>51030408</td>
			<td>37% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>MAG520.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SOD002.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Wisent Bio Products</td>
			<td>311-010-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>15710-S(EM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>P-36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siPARPi</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA control</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholcate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SUC507.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TRS001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trition X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging

Undersøgelsen af DNA-skaderesponsen (DDR) er et komplekst og essentielt felt, som kun er blevet vigtigere på grund af brugen af DDR-målrettede lægemidler til kræftbehandling. Disse mål er poly(ADP-ribose) polymeraser (PARP'er), som initierer forskellige former for DNA-reparation. Hæmning af disse enzymer ved hjælp af PARP-hæmmere (PARPi) opnår syntetisk dødelighed ved at give en terapeutisk sårbarhed i homologe rekombinationsceller (HR)-mangelfulde celler på grund af mutationer i brystkræft type 1 (BRCA1), BRCA2 eller partner og lokalisator af BRCA2 (PALB2). 
Celler behandlet med PARPi akkumulerer DNA-dobbeltstrengsbrud (DSB'er). Disse brud behandles af DNA-enderesektionsmaskineriet, hvilket fører til dannelsen af enkeltstrenget (ss) DNA og efterfølgende DNA-reparation. I en BRCA1-mangelfuld sammenhæng forårsager genoplivning af DNA-resektion gennem mutationer i DNA-resektionshæmmere, såsom 53BP1 og DYNLL1, PARPi-resistens. Derfor er det afgørende at kunne overvåge DNA-resektion i cellulo for en klarere forståelse af DNA-reparationsvejene og udviklingen af nye strategier til at overvinde PARPi-resistens. Immunofluorescens (IF)-baserede teknikker muliggør overvågning af global DNA-resektion efter DNA-skade. Denne strategi kræver genomisk DNA-mærkning med lang puls med 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU). Efter DNA-skade og DNA-enderesektion påvises det resulterende enkeltstrengede DNA specifikt af et anti-BrdU-antistof under indfødte forhold. Desuden kan DNA-resektion også undersøges ved hjælp af cellecyklusmarkører for at skelne mellem forskellige faser af cellecyklussen. Celler i S/G2-fasen tillader undersøgelse af enderesektion inden for HR, mens G1-celler kan bruges til at studere ikke-homolog slutslutning (NHEJ). En detaljeret protokol for denne IF-metode koblet til cellecyklusdiskrimination er beskrevet i dette papir.

I denne protokol blev det bromodeoxyuridin (BrdU)-baserede assay anvendt til kvantitativt at måle HeLa-cellernes resektionsrespons på bestrålingsinduceret skade. De genererede ssDNA-spor visualiseres som forskellige foci efter immunofluorescensfarvning (figur 1A). De identificerede foci blev derefter kvantificeret og udtrykt som den samlede integrerede intensitet af BrdU-farvningen i kernerne (figur 1B, supplerende figur S1, supplerende figur S2</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

I den nuværende protokol demonstrerer vi, hvordan man visualiserer DNA-dobbeltstrenget enderesektion under S / G2-fasen af cellecyklussen ved hjælp af en immunofluorescensbaseret metode.

Vurdering af global DNA-dobbeltstrenget endresektion ved hjælp af BrdU-DNA-mærkning kombineret med billeddannelse af cellecyklusdiskrimination

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Denne protokol giver mulighed for i cellulo kvantificering af DNA og resektion efter DNA-skade. Denne tekniks største fordel er cellecyklusmærkningen, der begrænser cellerne til S- og G2-fase, hvilket sikrer, at bromodeoxyuridinsignalet skyldes DNA og resektion. Demonstration af proceduren vil være Jean-Yves Masson, en hovedforsker, og Sofiane Y.Mersaoui, en postdoktoral forsker.Når du arbejder under en steril kulturhætte, skal du placere et enkelt dækslip i hver brønd på en seks-brønds plade til så mange forhold, der er nødvendige. Plade ca. 150.000 HeLa-celler til transfektion eller lægemiddelbehandling. På dag tre, efter natten inkubation med BrdU i en endelig koncentration på 10 mikromolære, bestråles pladerne med en samlet dosis på fem grå røntgenbestråling.Efter bestråling returneres pladerne til inkubation ved 37 grader Celsius i en 5% carbonoxidbefugtet inkubator i tre timer. Til forekstraktion aspirerer mediet og vaskes cellerne forsigtigt to gange med PBS. Efter fjernelse af PBS tilsættes to milliliter pre-ekstraktionsbuffer A og inkuberer cellerne ved fire grader Celsius på is i 10 minutter.Efter 10 minutter aspiratbuffer A, tilsæt to milliliter cytoskelet stripping buffer B, og gentag inkubationen. Derefter aspirerer buffer B forsigtigt og vask cellerne med PBS. Efter opspiring af PBS skal cellerne fastgøres ved at tilsætte to milliliter 4% paraformaldehyd under den kemiske hætte.Efter fjernelse af paraformaldehydet og vask med PBS skal du dække dækslipsene med 100% kold methanol til inkubation ved minus 20 grader Celsius i fem minutter og vaske dækslipsene to gange med PBS. Til permeabilisering inkuberes cellerne med to milliliter PBS indeholdende 0,5% Tritan X-100 ved stuetemperatur. Efter 15 minutter vaskes dækslipsene tre gange med to ml PBS.Til immunstaining tilsættes to milliliter blokerende buffer til hver brønd. Efter en times inkubation tilsættes 100 mikroliter primær antistofopløsning til hvert dækslip. Brug pincet til at dække dæksedlerne med firkantet parafilm og placer forsigtigt parafilmen for ikke at skabe bobler.Dæk derefter pladen i aluminiumsfolie og inkuber det primære antistof natten over ved fire grader Celsius i et befugtet kammer. Den følgende dag skal du fjerne parafilmfirkanterne og vaske dæksedlerne tre gange med to milliliter PBS. Efter vasken tilsættes 100 mikroliter sekundær antistofopløsning på hvert dækslips og dækkes dæksedlerne med en firkant af parafilm som påvist.Inkuber det sekundære antistof ved stuetemperatur i en time og beskyt pladen mod lys ved hjælp af folie. Vask derefter dækslerne tre gange med to milliliter 1X PBS. Til nuklear farvning tilsættes to milliliter DAPI-opløsning til hvert dækslips og vaskes dækslipsene med PBS.Tilføj 10 til 20 mikroliter IF-specifikt monteringsmedium på mikroskopdias. Brug nålen eller den fine pincet til at løfte dækslen fra bunden af brønden. Tør forsigtigt overskydende væske af ved at banke forsigtigt på den ene kant på et papirhåndklæde og montere dæksedlerne på mikroskopdias.Til billedindsamling og analyse skal du importere disse filer til CellProfiler og analysere dem ved hjælp af pipelinen til optælling af pletter. Identificer det primære objekt for at identificere foci ved hjælp af de indstillinger, der er beskrevet i tekstmanuskriptet, og mål intensiteten. Repræsentative billeder af 5-brom-2-prime-deoxyuridin foci dannelse og prolifererende celle nuklear antigen farvning efter bestråling er vist her.De genererede enkeltstrengede DNA-spor blev visualiseret som forskellige foci. De identificerede foci blev derefter kvantificeret og udtrykt som den samlede integrerede intensitet af bromodeoxyuridinfarvningen i kernerne. Co-farvning viste differentiering mellem den korte rækkevidde resektion på grund af ikke-homolog ende sammenføjning og den langtrækkende resektion af homolog rekombination ved hjælp af et anti-PCNA-antistof til at identificere celler, der går gennem S-fasen.PCNA er fremtrædende i kernen og når maksimal ekspression under S-fasen af cellecyklussen med en ganske intens farvning. Resultatet i værdier plotes derefter som et scatterplot for at diskriminere mellem PCNA-positive og PCNA-negative kerner. De PCNA-negative resultater fjernes fra datasættet for at muliggøre BrdU-intensitetsbaseret analyse på grund af det lave BrdU-signal uanset tilstanden.De PCNA-negative kerner har en basal integreret intensitet af BrdU-foci på 900 vilkårlige enheder, og denne værdi når 1.800 AU i PCNA-positive kerner. I siRNA-kontroltilstanden er den integrerede intensitet af BrdU-foci pr. Kerne ca. 1.500 AU i de PCNA-positive kerner. Efter en effektiv knockdown af PARP-1 under anvendelse af et siRNA blev der observeret en signifikant stigning i intensiteten af BrdU-foci til ca. 1.900 AU.Denne teknik kan give vigtig indsigt i den første fase af homolog rekombination og dermed hjælpe med at identificere, om et protein er involveret i det første trin i reparationsvejen. Inkubationstiden for pre-extraction bufferne skal holdes strengt. Overeksponering for disse buffere vil resultere i overdreven celleløsning og øget baggrundssignal.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Måling cellecyklusprogression Kinetics med metabolisk mærkning og Flowcytometri

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Levende cellecyklusanalyse af<em&gt; Drosophila</em&gt; Væv bruger Attune Acoustic Fokusering Cytometer og Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time Imaging af Single Engineered RNA-transkripter i levende celler Brug Ratiometrisk bimolekylær Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Diskrimination og karakterisering af heterocellulære populationer ved anvendelse af kvantitative billedteknikker

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...