Name: assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

Wij danken Marie-Christine Caron voor haar uitstekende technische advies. Dit werk wordt ondersteund door financiering van de Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. bekleedt een Tier 1 Canada Research Chair in DNA Repair and Cancer Therapeutics. J.O'S is een FRQS PhD student fellow, en S.Y.M is een FRQS postdoctoraal fellow.

1. Celkweek, behandelingen en coverslippreparaat
OPMERKING: Alle celbeplating, transfecties en behandelingen, afgezien van bestraling, moeten plaatsvinden onder een steriele celkweekkap.
<ol><li>Dag 1<ol>
<li>Plaats in een plaat met 6 putten een enkele afdekplaat in elke put voor zoveel omstandigheden als nodig is. Plaat ~ 150.000 HeLa-cellen voor transfectie of medicamenteuze behandeling, naar wens. OPMERKING: Als transfecteert, wordt het aanbevolen om een omgekeerde transfectie uit te v...

<ol>
	<li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response.">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li><li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells.">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes.">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li><li>Ronato, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+the+DNA+double-strand+break+resectosome+for+genome+protection.">Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection.</a> Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1-driven+poly-ADP-ribosylation+regulates+BRCA1+function+in+homologous+recombination-mediated+DNA+repair.">PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair.</a> Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).</li><li>Satoh, M. S., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+poly(ADP-ribose)+formation+in+DNA+repair.">Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair.</a> Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).</li><li>Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP-1+ensures+regulation+of+replication+fork+progression+by+homologous+recombination+on+damaged+DNA.">PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li><li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy.">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li><li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance:+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells.">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li><li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks.">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).</li><li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells.">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).</li><li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage.">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li><li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection.">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li><li>Huertas, P., Cruz-Garc&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+resection+tracks.">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li><li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection.">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li></ol>

Dit artikel beschrijft een methode die gebruik maakt van IF-kleuring om variaties in DNA-resectie in cellulose te meten. De huidige standaard voor het observeren van een effect op DNA-resectie is door RPA-kleuring; dit is echter een indirecte methode die kan worden beïnvloed door DNA-replicatie. Eerder is een andere op BrdU-integratie gebaseerde DNA-resectie IF-techniek beschreven voor het classificeren van de resulterende intensiteiten in BrdU-positieve en BrdU-negatieve cellen. Met deze methode konden cellen ...

Modulatie van DNA-reparatiefactoren is een steeds evoluerende methode voor kankertherapie, met name in DNA DSB-reparatie-deficiënte tumoromgevingen. De remming van specifieke reparatiefactoren is een van de ingenieuze strategieën die worden gebruikt om kankercellen te sensibiliseren voor DNA-schadelijke stoffen. Tientallen jaren van onderzoek leidden tot de identificatie van verschillende mutaties van DNA-reparatiegenen als biomarkers voor therapeutische strategiekeuzes1. Bijgevolg is het DNA-reparatieveld een hub geworden voor de ontwikkeling van geneesmiddelen om een breed scala aan behandelingen te garanderen, waardoor het concept van gepersonaliseerde geneeskunde wordt versterkt. 
DSB's worden gerepareerd door twee hoofdroutes: NHEJ en HR2. De NHEJ-route is foutgevoelig, waardoor de twee DNA-uiteinden snel worden geligeerd met weinig tot geen DNA-eindverwerking en waarbij het eiwitkinase (DNA-PKcs), het Ku70/80-complex, 53BP1 en RIF1-eiwitten3 betrokken zijn. HR daarentegen is een getrouw mechanisme geïnitieerd door BRCA14. Een essentiële stap in HR-reparatie is het DNA-end resectieproces, dat is de afbraak van de gebroken uiteinden die leidt tot enkelstrengs (ss) DNA met 3'-OH-uiteinden. BRCA1 vergemakkelijkt de rekrutering van de downstream eiwitten die het resectosoom MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1 vormen, die betrokken zijn bij de 5' tot 3' DNA-resectie5.
De initiële eindresectie wordt bereikt door de endonuclease-activiteit van MRE11, waardoor verdere verwerking door de DNA2- en EXO1-nucleasen mogelijk is. De gegenereerde ssDNA-overhangen worden snel gecoat met Replicatie-eiwit A (RPA) om ze te beschermen tegen verdere verwerking. Vervolgens nemen BRCA2, PALB2 en BRCA1 deel aan de bemiddeling van de verplaatsing van RPA en de assemblage van het RAD51-nucleofilament dat nodig is voor homologiegericht reparatiemechanisme. Een fijne balans tussen het gebruik van NHEJ en HR is noodzakelijk voor het optimale behoud van de genomische integriteit. De routekeuze hangt af van de celcyclusfase. HR wordt bij voorkeur gebruikt tijdens de S tot G2-fasen waarin DNA-resectie op het hoogste niveau is en de zusterchromatiden beschikbaar zijn om een goede reparatie te garanderen.
Poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) is een van de vroegste eiwitten die voor de DSB worden gerekruteerd. Het regelt zowel de resectieactiviteit als de assemblage van stroomafwaartse effectoren die betrokken zijn bij de NHEJ5,6. PARP-1 is ook vereist voor DNA enkelstrengs breukherstel tijdens replicatie7,8. Vanwege de belangrijke rol in DNA-reparatie worden PARP-remmers (PARPi) gebruikt als kankertherapieën. Bij verschillende HR-deficiënte kankers leidt parpi-behandeling tot een synthetische letale respons als gevolg van het onvermogen van HR-deficiënte cellen om de geaccumuleerde schade te herstellen via een alternatieve route9,10. Er zijn momenteel vier door de FDA goedgekeurde PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib en Talazoparib (ook wel BMN 673 genoemd), die worden gebruikt voor verschillende borst- en eierstokkankerbehandelingen11. PARPi-resistentie komt echter vaak voor en één mogelijke oorzaak ontstaat door de herovering van HR-vaardigheid12. Verlies of remming van PARP-1 in aanwezigheid van bestraling ontregelt de resectosoommachinerie, wat leidt tot de accumulatie van langere ssDNA-traktaten13. Daarom is een diepgaande studie van DNA-resectie in vivo van cruciaal belang voor een beter begrip van de DNA-reparatieroutes en de daaropvolgende ontwikkeling van nieuwe strategieën om kanker te behandelen en PARPi-resistentie te overwinnen.
Er zijn verschillende methoden gebruikt om DNA-resectiegebeurtenissen te detecteren5. Een van die methoden is de klassieke IF-gebaseerde techniek die indirecte kleuring en visualisatie van het gereseceerde DNA na stress-geïnduceerde DSB mogelijk maakt met behulp van een anti-RPA-antilichaam. Het labelen van genomisch DNA met 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU) en het detecteren van alleen ssDNA is een directe meting van DNA-resectiegebeurtenissen. Het omzeilt de monitoring van RPA, die betrokken is bij meerdere cellulaire processen zoals DNA-replicatie. In de hier beschreven methode zorgen cellen geïncubeerd met BrdU voor een enkele celcyclus ervoor dat BrdU kan worden opgenomen in één streng van het replicerende cellulaire DNA. Na resectie wordt IF-kleuring uitgevoerd onder omstandigheden die BrdU-detectie alleen in de ssDNA-vorm mogelijk maken, met behulp van een anti-BrdU-antilichaam. Dit antilichaam heeft alleen toegang tot blootgestelde BrdU-nucleotiden en zal die niet detecteren die zijn geïntegreerd in dubbelstrengs DNA. Met behulp van fluorescentiemicroscopie kan het gereseceerde DNA worden gevisualiseerd in de vorm van punctate BrdU/ ssDNA-foci. De nucleaire intensiteit van deze foci kan worden gebruikt als een uitlezing om resectie na DNA-schade te kwantificeren. Dit artikel beschrijft stap voor stap de processen van deze methode, die kunnen worden toegepast op de meeste cellijnen van zoogdieren. Deze methode zou van breed nut moeten zijn als een eenvoudige manier om DNA-eindresectie in cellulo te monitoren, als een proof of concept.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PARP1 (F1-23)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PCNA (SY12-07)</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-67390</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha tubulin (DM1A)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7291</td>
			<td>1:100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BrdU</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN202</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop X-ray Irradiator</td>
			<td>Cell Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMN673</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-16106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine (BrdU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>V 3.19</td>
			<td>https://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10063542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12 541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td>63x immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>51030408</td>
			<td>37% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>MAG520.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SOD002.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Wisent Bio Products</td>
			<td>311-010-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>15710-S(EM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>P-36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siPARPi</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA control</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholcate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SUC507.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TRS001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trition X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging

De studie van de DNA-schaderespons (DDR) is een complex en essentieel veld, dat alleen maar belangrijker is geworden door het gebruik van DDR-gerichte geneesmiddelen voor de behandeling van kanker. Deze doelwitten zijn poly(ADP-ribose) polymerasen (PARP's), die verschillende vormen van DNA-reparatie initiëren. Het remmen van deze enzymen met behulp van PARP-remmers (PARPi) bereikt synthetische letaliteit door een therapeutische kwetsbaarheid te verlenen in homologe recombinatie (HR) -deficiënte cellen als gevolg van mutaties in borstkanker type 1 (BRCA1), BRCA2 of partner en localizer van BRCA2 (PALB2). 
Cellen behandeld met PARPi accumuleren DNA dubbelstrengs breuken (DSB's). Deze breuken worden verwerkt door de DNA-eindresectiemachinerie, wat leidt tot de vorming van enkelstrengs (ss) DNA en daaropvolgende DNA-reparatie. In een BRCA1-deficiënte context veroorzaakt het nieuw leven inblazen van DNA-resectie door mutaties in DNA-resectieremmers, zoals 53BP1 en DYNLL1, PARPi-resistentie. Daarom is het kunnen monitoren van DNA-resectie in cellulo van cruciaal belang voor een beter begrip van de DNA-reparatieroutes en de ontwikkeling van nieuwe strategieën om PARPi-resistentie te overwinnen. Immunofluorescentie (IF)-gebaseerde technieken maken het mogelijk om wereldwijde DNA-resectie na DNA-schade te monitoren. Deze strategie vereist lange-puls genomische DNA-etikettering met 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU). Na DNA-schade en DNA-eindresectie wordt het resulterende enkelstrengs DNA specifiek gedetecteerd door een anti-BrdU-antilichaam onder inheemse omstandigheden. Bovendien kan DNA-resectie ook worden bestudeerd met behulp van celcyclusmarkers om onderscheid te maken tussen verschillende fasen van de celcyclus. Cellen in de S/G2-fase maken de studie van eindresectie binnen HR mogelijk, terwijl G1-cellen kunnen worden gebruikt om niet-homologe eindverbindingen (NHEJ) te bestuderen. Een gedetailleerd protocol voor deze IF-methode gekoppeld aan celcyclusdiscriminatie wordt in dit artikel beschreven.

In dit protocol werd de op bromodeoxyuridine (BrdU) gebaseerde test gebruikt om de resectierespons van HeLa-cellen op door bestraling veroorzaakte schade kwantitatief te meten. De gegenereerde ssDNA-sporen worden gevisualiseerd als afzonderlijke foci na immunofluorescentiekleuring (figuur 1A). De geïdentificeerde foci werden vervolgens gekwantificeerd en uitgedrukt als de totale geïntegreerde intensiteit van de BrdU-kleuring in de kernen (figuur 1B, aa...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

In dit protocol laten we zien hoe dna dubbelstrengs eindresectie tijdens de S/G2-fase van de celcyclus kan worden gevisualiseerd met behulp van een op immunofluorescentie gebaseerde methode.

Beoordeling van wereldwijde DNA double-strand eindresectie met behulp van BrdU-DNA-labeling in combinatie met cell cycle discrimination imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Dit protocol maakt cellulokwantificering van DNA en resectie na DNA-schade mogelijk. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de celcyclusmarkering die de cellen beperkt tot de S- en G2-fase, waardoor het bromodeoxyuridinesignaal het resultaat is van DNA en resectie. Jean-Yves Masson, een hoofdonderzoeker, en Sofiane Y.Mersaoui, een postdoctoraal onderzoeker, demonstreren de procedure.Werk onder een steriele kweekkap en plaats een enkele dekplaat in elke put van een plaat met zes putten voor zoveel omstandigheden als nodig is. Plaat ongeveer 150.000 HeLa cellen voor transfectie of medicamenteuze behandeling. Bestraal op dag drie, na de nachtelijke incubatie met BrdU in een eindconcentratie van 10 micromolair, de platen met een totale dosis van vijf grijze röntgenbestraling.Breng na bestraling de platen terug voor incubatie bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofoxide bevochtigde incubator gedurende drie uur. Voor pre-extractie, aspirateer het medium en was de cellen voorzichtig twee keer met PBS. Voeg na het verwijderen van PBS twee milliliter pre-extractiebuffer A toe en incubeer de cellen bij vier graden Celsius op ijs gedurende 10 minuten.Na 10 minuten, aspiraatbuffer A, voeg twee milliliter cytoskelet stripping buffer B toe en herhaal de incubatie. Aspirateer vervolgens voorzichtig buffer B en was de cellen met PBS. Na het aanzuigen van PBS fixeert u de cellen door twee milliliter van 4% paraformaldehyde onder de chemische kap toe te voegen.Na verwijdering van het paraformaldehyde en wasbeurten met PBS, bedek de coverslips met 100% koude methanol voor incubatie bij min 20 graden Celsius gedurende vijf minuten en was de coverslips twee keer met PBS. Voor permeabilisatie, incubateer de cellen met twee milliliter PBS bevatten 0,5% Tritan X-100 bij kamertemperatuur. Was de dekens na 15 minuten drie keer met twee milliliter PBS.Voeg voor immunostaining twee milliliter blokkerende buffer toe aan elke put. Voeg na een uur incubatie 100 microliter primaire antilichaamoplossing toe aan elke coverslip. Gebruik een pincet om de coverslips te bedekken met vierkante parafilm en plaats de parafilm zorgvuldig om geen bubbels te creëren.Bedek vervolgens de plaat met aluminiumfolie en incubeer het primaire antilichaam 's nachts bij vier graden Celsius in een bevochtigde kamer. Verwijder de volgende dag de parafilmvierkanten en was de dekplaten drie keer met twee milliliter PBS. Voeg na het wassen 100 microliter secundaire antilichaamoplossing toe aan elke coverslip en bedek de coverslips met een vierkant parafilm zoals gedemonstreerd.Incubeer het secundaire antilichaam bij kamertemperatuur gedurende één uur en bescherm de plaat tegen licht met behulp van folie. Was vervolgens de coverslips drie keer met twee milliliter 1X PBS. Voeg voor nucleaire kleuring twee milliliter DAPI-oplossing toe aan elke coverslip en was de coverslips met PBS.Voeg 10 tot 20 microliter IF-specifiek montagemedium toe aan microscoopglaasjes. Gebruik de naald of het fijne pincet om de deklip van de bodem van de put te tillen. Dep overtollige vloeistof voorzichtig af door zachtjes op een keukenpapier te tikken en monteer de coverslips op microscoopglaasjes.Voor beeldacquisitie en -analyse importeert u deze bestanden in CellProfiler en analyseert u ze met behulp van de spikkeltelpijplijn. Identificeer het primaire object om de foci te identificeren met behulp van de instellingen die worden beschreven in het tekstmanuscript en meet de intensiteit. Representatieve beelden van 5-broom-2-prime-deoxyuridine foci vorming en prolifererende cel nucleaire antigeen kleuring na bestraling worden hier getoond.De gegenereerde enkelstrengs DNA-sporen werden gevisualiseerd als afzonderlijke foci. De geïdentificeerde foci werden vervolgens gekwantificeerd en uitgedrukt als de totale geïntegreerde intensiteit van de bromodeoxyuridinekleuring in de kernen. Co-kleuring toonde differentiatie tussen de korteafstandsresectie als gevolg van niet-homologe eindverbinding en de langeafstandsresectie van homologe recombinatie met behulp van een anti-PCNA-antilichaam om cellen te identificeren die door de S-fase gaan.PCNA is prominent aanwezig in de kern en bereikt maximale expressie tijdens de S-fase van de celcyclus met een vrij intense kleuring. Het resultaat in waarden wordt vervolgens uitgezet als een scatterplot om onderscheid te maken tussen PCNA-positieve en PCNA-negatieve kernen. De PCNA-negatieve resultaten worden uit de dataset verwijderd om brdU-intensiteitsgebaseerde analyse mogelijk te maken vanwege het lage BrdU-signaal, ongeacht de aandoening.De PCNA-negatieve kernen herbergen een basaal geïntegreerde intensiteit van BrdU-foci van 900 willekeurige eenheden en deze waarde bereikt 1.800 AE in PCNA-positieve kernen. In de siRNA-controleconditie is de geïntegreerde intensiteit van BrdU-foci per kern ongeveer 1.500 AE in de PCNA-positieve kernen. Na een efficiënte knockdown van PARP-1 met behulp van een siRNA, werd een significante toename van de intensiteit van de BrdU-foci tot ongeveer 1.900 AE waargenomen.Deze techniek kan belangrijke inzichten bieden in de eerste fase van homologe recombinatie, waardoor wordt bepaald of een eiwit betrokken is bij de eerste stap van het reparatietraject. De incubatietijd voor de pre-extractiebuffers moet strikt worden aangehouden. Overmatige blootstelling aan deze buffers zal resulteren in overmatige celloslating en een verhoogd achtergrondsignaal.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Het meten van exocytose in Neuronen FM-ontvanger voor Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Etikettering hESC &#39;s en hMSCs met ijzeroxide nanodeeltjes voor niet-invasieve in vivo Tracking met MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Labeling stamcellen met fluorescente kleurstoffen voor niet-invasieve detectie met optische beeldvorming

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Analyse van DNA dubbelstrengs breuken (DSB) Reparatie in zoogdiercellen

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Het meten van voortgang van de celcyclus Kinetics met metabolische labeling en Flow cytometrie

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live-Cell Cycle Analysis van<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels met de Attune Acoustic Focusing Cytometer en Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Discriminatie en karakterisering van heterocellulaire populaties met behulp van kwantitatieve beeldvormingstechnieken

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...