Name: assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00
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Nous remercions Marie-Christine Caron pour ses conseils techniques exceptionnels. Ce travail est soutenu par le financement des Instituts de recherche en santé du Canada J.Y.M (IRSC FDN-388879). J.-Y.M. est titulaire d’une chaire de recherche canadienne de niveau 1 en réparation de l’ADN et en thérapeutique du cancer. J.O’S est un boursier au doctorat frQS, et S.Y.M est un boursier postdoctoral FRQS.

1. Culture cellulaire, traitements et préparation du couvercle
REMARQUE: Tous les placages cellulaires, les transfections et les traitements, à l’exception de l’irradiation, doivent avoir lieu sous une hotte de culture cellulaire stérile.
<ol><li>Jour 1<ol>
<li>Dans une plaque à 6 puits, placez un seul couvercle dans chaque puits pour autant de conditions que nécessaire. Plaque ~ 150 000 cellules HeLa pour la transfection ou le traitement médicamenteux, selon les souhaits. REMAR...

<ol>
	<li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response.">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li><li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells.">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li><li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy.">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li><li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance:+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells.">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li><li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks.">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).</li><li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells.">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).</li><li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage.">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li><li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection.">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li><li>Huertas, P., Cruz-Garc&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+resection+tracks.">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li><li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection.">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li></ol>

Cet article décrit une méthode qui utilise la coloration IF pour mesurer les variations de la résection de l’ADN dans le cellulo. La norme actuelle pour observer un effet sur la résection de l’ADN est la coloration RPA; cependant, il s’agit d’une méthode indirecte qui peut être influencée par la réplication de l’ADN. Auparavant, une autre technique DE RÉSECTION DE L’ADN basée sur l’incorporation de BrdU a été décrite pour classer les intensités résultantes dans les cellules BrdU posi...

La modulation des facteurs de réparation de l’ADN est une méthode en constante évolution pour le traitement du cancer, en particulier dans les environnements tumoraux déficients en réparation de l’ADN DSB. L’inhibition de facteurs de réparation spécifiques est l’une des stratégies ingénieuses utilisées pour sensibiliser les cellules cancéreuses aux agents endommageant l’ADN. Des décennies de recherche ont conduit à l’identification de diverses mutations de gènes de réparation de l’ADN en tant que biomarqueurs pour les choix de stratégie thérapeutique1. Par conséquent, le domaine de la réparation de l’ADN est devenu une plaque tournante pour le développement de médicaments afin d’assurer une large gamme de traitements, renforçant ainsi le concept de médecine personnalisée. 
Les DSB sont réparés par deux voies principales : NHEJ et HR2. La voie NHEJ est sujette aux erreurs, ligaturant rapidement les deux extrémités de l’ADN avec peu ou pas de traitement final de l’ADN et impliquant la protéine kinase (DNA-PKcs), le complexe Ku70/80, 53BP1 et les protéines RIF13. En revanche, les RH sont un mécanisme fidèle initié par BRCA14. Une étape essentielle de la réparation HR est le processus de résection de l’extrémité de l’ADN, qui est la dégradation des extrémités cassées conduisant à l’ADN simple brin (ss) avec des extrémités 3'-OH. BRCA1 facilite le recrutement des protéines en aval qui forment le résectosome MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, qui sont impliquées dans la résection de l’ADN 5' à 3'5.
La résection finale initiale est réalisée grâce à l’activité endonucléase de MRE11, ce qui permet un traitement ultérieur par les nucléases DNA2 et EXO1. Les porte-à-faux d’ADNSS générés sont rapidement recouverts par la protéine de réplication A (RPA) pour les protéger d’un traitement ultérieur. Par la suite, BRCA2, PALB2 et BRCA1 s’engagent à arbitrer le déplacement de la RPA et l’assemblage du nucléofilament RAD51 requis pour le mécanisme de réparation dirigé par homologie. Un équilibre délicat entre l’utilisation de NHEJ et HR est nécessaire pour le maintien optimal de l’intégrité génomique. Le choix de la voie dépend de la phase du cycle cellulaire. HR est utilisé de préférence pendant les phases S à G2 où la résection de l’ADN est au plus haut niveau, et les chromatides sœurs sont disponibles pour assurer une réparation appropriée.
La poly (ADP-ribose) polymérase 1 (PARP-1) est l’une des premières protéines recrutées dans le DSB. Il régule à la fois l’activité de résection et l’assemblage des effecteurs en aval impliqués dans le NHEJ5,6. PARP-1 est également nécessaire pour la réparation de la rupture simple brin de l’ADN pendant la réplication7,8. En raison de son rôle important dans la réparation de l’ADN, les inhibiteurs de PARP (PARPi) sont utilisés comme thérapies contre le cancer. Dans plusieurs cancers déficients en HR, le traitement par ParPi conduit à une réponse létale synthétique en raison de l’incapacité des cellules déficientes en HR à réparer les dommages accumulés par une voie alternative9,10. Il existe actuellement quatre PARPi approuvés par la FDA : Olaparib, Rucaparib, Niriparib et Talazoparib (également appelé BMN 673), qui sont utilisés pour divers traitements du cancer du sein et de l’ovaire11. Cependant, la résistance par parpi est courante, et une cause potentielle découle de la réacquisition de la compétence RH12. La perte ou l’inhibition de PARP-1 en présence d’irradiation dérégule la machinerie des résectosomes, conduisant à l’accumulation de tractus d’ADNSs plus longs13. Par conséquent, une étude approfondie de la résection de l’ADN in vivo est essentielle pour une meilleure compréhension des voies de réparation de l’ADN et le développement ultérieur de nouvelles stratégies pour traiter le cancer et surmonter la résistance parPi.
Plusieurs méthodes ont été utilisées pour détecter les événements de résection de l’ADN5. L’une de ces méthodes est la technique classique basée sur la FI permettant la coloration indirecte et la visualisation de l’ADN réséqué après DSB induit par le stress en utilisant un anticorps anti-RPA. Le marquage de l’ADN génomique avec de la 5-bromo-2′-désoxyuridine (BrdU) et la détection de l’ADNSS est une mesure directe des événements de résection de l’ADN. Il contourne la surveillance de la RPA, qui est impliquée dans de multiples processus cellulaires tels que la réplication de l’ADN. Dans la méthode décrite ici, les cellules incubées avec BrdU pour un seul cycle cellulaire permettent à BrdU d’être incorporé dans un brin de l’ADN cellulaire répliquant. Après résection, la coloration IF est réalisée dans des conditions permettant la détection de BrdU uniquement sous forme d’ADNSS, avec l’utilisation d’un anticorps anti-BrdU. Cet anticorps ne peut accéder qu’aux nucléotides BrdU exposés et ne détectera pas ceux intégrés dans l’ADN double brin. En utilisant la microscopie à fluorescence, l’ADN réséqué peut être visualisé sous la forme de foyers BrdU/ssDNA ponctués. L’intensité nucléaire de ces foyers peut être utilisée comme lecture pour quantifier la résection après des dommages à l’ADN. Cet article décrit étape par étape les processus de cette méthode, qui peut être appliquée à la plupart des lignées cellulaires de mammifères. Cette méthode devrait être d’une grande utilité en tant que moyen simple de surveiller la résection finale de l’ADN dans le cellulo, en tant que preuve de concept.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PARP1 (F1-23)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PCNA (SY12-07)</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-67390</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha tubulin (DM1A)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7291</td>
			<td>1:100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BrdU</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN202</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop X-ray Irradiator</td>
			<td>Cell Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMN673</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-16106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine (BrdU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>V 3.19</td>
			<td>https://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10063542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12 541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td>63x immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>51030408</td>
			<td>37% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>MAG520.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SOD002.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Wisent Bio Products</td>
			<td>311-010-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>15710-S(EM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>P-36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siPARPi</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA control</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholcate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SUC507.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TRS001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trition X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging

L’étude de la réponse aux dommages à l’ADN (DDR) est un domaine complexe et essentiel, qui n’a fait que devenir plus important en raison de l’utilisation de médicaments ciblant le DDR pour le traitement du cancer. Ces cibles sont les poly(ADP-ribose) polymérases (PARP), qui initient diverses formes de réparation de l’ADN. L’inhibition de ces enzymes à l’aide d’inhibiteurs de PARP (PARPi) permet d’obtenir une létalité synthétique en conférant une vulnérabilité thérapeutique dans les cellules déficientes en recombinaison homologue (HR) en raison de mutations dans le cancer du sein de type 1 (BRCA1), BRCA2, ou partenaire et localisateur de BRCA2 (PALB2). 
Les cellules traitées avec PARPi accumulent des cassures double brin d’ADN (DSB). Ces cassures sont traitées par la machinerie de résection de l’extrémité de l’ADN, ce qui conduit à la formation d’ADN simple brin (ss) et à la réparation ultérieure de l’ADN. Dans un contexte déficient en BRCA1, la revitalisation de la résection de l’ADN par des mutations dans les inhibiteurs de la résection de l’ADN, tels que 53BP1 et DYNLL1, provoque une résistance AU PARPi. Par conséquent, être capable de surveiller la résection de l’ADN dans le cellulo est essentiel pour une compréhension plus claire des voies de réparation de l’ADN et le développement de nouvelles stratégies pour surmonter la résistance PARPi. Les techniques basées sur l’immunofluorescence (FI) permettent de surveiller la résection globale de l’ADN après des dommages à l’ADN. Cette stratégie nécessite un marquage génomique de l’ADN à longue impulsion avec de la 5-bromo-2′-désoxyuridine (BrdU). Après des dommages à l’ADN et une résection finale de l’ADN, l’ADN simple brin résultant est spécifiquement détecté par un anticorps anti-BrdU dans des conditions natives. De plus, la résection de l’ADN peut également être étudiée à l’aide de marqueurs du cycle cellulaire pour différencier les différentes phases du cycle cellulaire. Les cellules de la phase S/G2 permettent l’étude de la résection finale au sein de hr, tandis que les cellules G1 peuvent être utilisées pour étudier l’assemblage final non homologue (NHEJ). Un protocole détaillé pour cette méthode IF couplée à la discrimination du cycle cellulaire est décrit dans ce document.

Dans ce protocole, le test à base de bromodéoxyuridine (BrdU) a été utilisé pour mesurer quantitativement la réponse de résection des cellules HeLa aux dommages induits par l’irradiation. Les traces d’ADNSs générées sont visualisées comme des foyers distincts après coloration par immunofluorescence (Figure 1A). Les foyers identifiés ont ensuite été quantifiés et exprimés comme l’intensité totale intégrée de la coloration BrdU dans les noyaux (Fi...

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Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

Dans le présent protocole, nous montrons comment visualiser la résection de l’extrémité double brin de l’ADN pendant la phase S/G2 du cycle cellulaire à l’aide d’une méthode basée sur l’immunofluorescence.

Évaluation de la résection finale globale de l’ADN double brin à l’aide du marquage BrdU-ADN couplé à l’imagerie de discrimination du cycle cellulaire

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Ce protocole permet la quantification cellulo de l’ADN et la résection suite à des dommages à l’ADN. Le principal avantage de cette technique est le marquage du cycle cellulaire qui limite les cellules à la phase S et G2, garantissant que le signal de bromodéoxyuridine résulte de l’ADN et de la résection. Jean-Yves Masson, chercheur principal, et Sofiane Y.Mersaoui, chercheur postdoctoral, feront la démonstration de la procédure.En travaillant sous une hotte stérile, placez un seul couvercle dans chaque puits d’une plaque de six puits pour autant de conditions que nécessaire. Plaquez environ 150 000 cellules HeLa pour la transfection ou le traitement médicamenteux. Le troisième jour, après l’incubation de nuit avec BrdU à une concentration finale de 10 micromolaires, irradier les plaques avec une dose totale de cinq gris d’irradiation aux rayons X.Après l’irradiation, retourner les plaques pour l’incubation à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% d’oxyde de carbone pendant trois heures. Pour la pré-extraction, aspirer le milieu et laver soigneusement les cellules deux fois avec du PBS. Après avoir retiré le PBS, ajoutez deux millilitres de tampon de pré-extraction A et incubez les cellules à quatre degrés Celsius sur de la glace pendant 10 minutes.Après 10 minutes, aspirez le tampon A, ajoutez deux millilitres de tampon de décapage du cytosquelette B et répétez l’incubation. Ensuite, aspirez soigneusement le tampon B et lavez les cellules avec du PBS. Après avoir aspiré le PBS, fixez les cellules en ajoutant deux millilitres de 4% de paraformaldéhyde sous le capot chimique.Après avoir retiré le paraformaldéhyde et les lavages avec du PBS, couvrir les couvercles avec du méthanol 100% froid pour une incubation à moins 20 degrés Celsius pendant cinq minutes et laver les couvercles deux fois avec du PBS. Pour la perméabilisation, incuber les cellules avec deux millilitres de PBS contenant 0,5% de Tritan X-100 à température ambiante. Après 15 minutes, laver les couvercles trois fois avec deux millilitres de PBS.Pour l’immunocoloration, ajoutez deux millilitres de tampon bloquant à chaque puits. Après une heure d’incubation, ajouter 100 microlitres de solution d’anticorps primaires à chaque couvercle. Utilisez une pince à épiler pour recouvrir les couvercles de parafilm carré et positionnez soigneusement le parafilm pour ne pas créer de bulles.Ensuite, recouvrez la plaque de papier d’aluminium et incubez l’anticorps primaire pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans une chambre humidifiée. Le lendemain, retirez les carrés de parafilm et lavez les couvercles trois fois avec deux millilitres de PBS. Après le lavage, ajouter 100 microlitres de solution d’anticorps secondaires sur chaque couvercle et recouvrir les couvercles d’un carré de parafilm comme démontré.Incuber l’anticorps secondaire à température ambiante pendant une heure et protéger la plaque de la lumière à l’aide d’une feuille. Ensuite, lavez les couvercles trois fois avec deux millilitres de PBS 1X. Pour la coloration nucléaire, ajoutez deux millilitres de solution de DAPI à chaque couvercle et lavez les couvercles avec du PBS.Ajoutez 10 à 20 microlitres de support de montage spécifique à la FI sur les lames de microscope. Utilisez l’aiguille ou une pince à épiler fine pour soulever le couvercle du fond du puits. Épongez soigneusement l’excès de liquide en tapotant doucement un bord sur une serviette en papier et montez les couvercles sur des lames de microscope.Pour l’acquisition et l’analyse d’images, importez ces fichiers dans CellProfiler et analysez-les à l’aide du pipeline de comptage de mouchetures. Identifiez l’objet principal pour identifier les foyers à l’aide des paramètres décrits dans le manuscrit textuel et mesurez l’intensité. Des images représentatives de la formation de foyers de 5-bromo-2-prime-désoxyuridine et de la coloration proliférante de l’antigène nucléaire cellulaire après irradiation sont présentées ici.Les pistes d’ADN monocaténaire générées ont été visualisées comme des foyers distincts. Les foyers identifiés ont ensuite été quantifiés et exprimés comme l’intensité totale intégrée de la coloration à la bromodésoxyuridine dans les noyaux. La cocoloration a montré une différenciation entre la résection à courte portée due à la jonction d’extrémité non homologue et la résection à longue distance de la recombinaison homologue à l’aide d’un anticorps anti-PCNA pour identifier les cellules passant par la phase S.Le PCNA est proéminent dans le noyau et atteint une expression maximale pendant la phase S du cycle cellulaire avec une coloration assez intense. Les valeurs du résultat sont ensuite tracées sous forme de nuage de points pour faire la distinction entre les noyaux PCNA positif et PCNA négatif. Les résultats négatifs du PCNA sont retirés de l’ensemble de données pour permettre une analyse basée sur l’intensité BrdU en raison du faible signal BrdU quelle que soit la condition.Les noyaux négatifs PCNA abritent une intensité basale intégrée de foyers BrdU de 900 unités arbitraires et cette valeur atteint 1 800 UA dans les noyaux positifs PCNA. Dans la condition de contrôle du siRNA, l’intensité intégrée des foyers BrdU par noyau est d’environ 1 500 UA dans les noyaux positifs pcNA. Après une élimination efficace de PARP-1 à l’aide d’un siRNA, une augmentation significative de l’intensité des foyers BrdU à environ 1 900 UA a été observée.Cette technique peut fournir des informations clés sur la première étape de la recombinaison homologue, aidant ainsi à identifier si une protéine est impliquée dans la première étape de la voie de réparation. Le temps d’incubation des tampons de pré-extraction doit être strictement respecté. La surexposition à ces tampons entraînera un détachement excessif des cellules et une augmentation du signal de fond.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Mesure exocytose dans les neurones en utilisant un étiquetage FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Recherche

Biologie

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Étiquetage CSEh et hMSCs d&#39;oxyde de fer nanoparticules pour les non-invasives dans le suivi in ​​vivo avec IRM

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Étiquetage des cellules souches avec des colorants fluorescents pour les non-invasive de détection avec l&#39;imagerie optique

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

L&#39;analyse de l&#39;ADN double-brin Break (ORD) de réparation dans les cellules de mammifères

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

La quantification des protéines à l&#39;aide d&#39;enrichissement d&#39;immunoaffinité peptide couplé à la spectrométrie de masse

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Mesure cinétique cellulaire avec la progression du cycle marquage métabolique et cytométrie de flux

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

De cellules vivantes analyse du cycle de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tissus en utilisant le Attune acoustique Cytometer Concentrer et Vybrant DyeCycle ADN Violet Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imagerie en temps réel de l&#39;unité d&#39;ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Discrimination et caractérisation des populations hétéro-cellulaires à l&#39;aide de techniques d&#39;imagerie quantitative

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...