Name: assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

Wir danken Marie-Christine Caron für die hervorragende technische Beratung. Diese Arbeit wird durch Mittel der Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879) unterstützt. J.-Y.M. hat einen Tier 1 Canada Research Chair in DNA Repair and Cancer Therapeutics inne. J.O'S ist ein FRQS PhD Student Fellow und S.Y.M ist ein FRQS Postdoctoral Fellow.

1. Zellkultur, Behandlungen und Deckglasvorbereitung
HINWEIS: Alle Zellplattierungen, Transfektionen und Behandlungen, mit Ausnahme der Bestrahlung, sollten unter einer sterilen Zellkulturhaube stattfinden.
<ol><li>Tag 1<ol>
<li>Legen Sie in eine 6-Well-Platte einen einzelnen Deckglas in jeden Brunnen für so viele Bedingungen wie nötig. Platte ~ 150.000 HeLa-Zellen für die Transfektion oder medikamentöse Behandlung, je nach Wunsch. HINWEIS: Bei der Transfektion wird empfohlen, zum Zei...

<ol>
	<li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response.">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li><li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells.">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li><li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks.">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).</li><li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells.">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).</li><li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage.">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li><li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection.">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li><li>Huertas, P., Cruz-Garc&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+resection+tracks.">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li><li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection.">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li></ol>

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, die die IF-Färbung nutzt, um Variationen in der DNA-Resektion in Cellulo zu messen. Der aktuelle Standard für die Beobachtung eines Effekts auf die DNA-Resektion ist die RPA-Färbung; Dies ist jedoch eine indirekte Methode, die durch DNA-Replikation beeinflusst werden kann. Zuvor wurde eine weitere BrdU-Inkorporations-basierte DNA-Resektions-IF-Technik zur Klassifizierung der resultierenden Intensitäten in BrdU-positiven und BrdU-negativen Zellen beschrieben. Diese Meth...

Die Modulation von DNA-Reparaturfaktoren ist eine sich ständig weiterentwickelnde Methode für die Krebstherapie, insbesondere in DNA-DSB-Reparatur-defizienten Tumorumgebungen. Die Hemmung spezifischer Reparaturfaktoren ist eine der genialen Strategien, um Krebszellen für DNA-schädigende Wirkstoffe zu sensibilisieren. Jahrzehntelange Forschung führte zur Identifizierung verschiedener Mutationen von DNA-Reparaturgenen als Biomarker für therapeutische Strategieentscheidungen1. Infolgedessen ist das DNA-Reparaturfeld zu einem Zentrum für die Arzneimittelentwicklung geworden, um eine breite Palette von Behandlungen zu gewährleisten und das Konzept der personalisierten Medizin zu stärken. 
DSBs werden durch zwei Hauptwege repariert: NHEJ und HR2. Der NHEJ-Signalweg ist fehleranfällig, indem er die beiden DNA-Enden mit wenig bis gar keiner DNA-Endverarbeitung schnell ligariert und die Proteinkinase (DNA-PKcs), den Ku70/80-Komplex, 53BP1 und RIF1-Proteine3 umfasst. Im Gegensatz dazu ist HR ein treuer Mechanismus, der von BRCA14 initiiert wurde. Ein wesentlicher Schritt bei der HR-Reparatur ist der DNA-Endresektionsprozess, bei dem es sich um den Abbau der gebrochenen Enden handelt, der zu einzelsträngiger (ss) DNA mit 3'-OH-Enden führt. BRCA1 erleichtert die Rekrutierung der nachgeschalteten Proteine, die das Resektosom MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1 bilden, die an der 5' bis 3' DNA-Resektion beteiligt sind5.
Die anfängliche Endresektion wird durch die Endonukleaseaktivität von MRE11 erreicht, was eine weitere Verarbeitung durch die DNA2- und EXO1-Nukleasen ermöglicht. Die erzeugten ssDNA-Überhänge werden schnell mit Replikationsprotein A (RPA) beschichtet, um sie vor einer weiteren Verarbeitung zu schützen. Anschließend setzen BRCA2, PALB2 und BRCA1 ein, um die Verschiebung von RPA und die Montage des RAD51-Nukleofilaments zu vermitteln, das für den homologiegesteuerten Reparaturmechanismus erforderlich ist. Eine feine Balance zwischen der Verwendung von NHEJ und HR ist für die optimale Aufrechterhaltung der genomischen Integrität notwendig. Die Wahl des Weges hängt von der Zellzyklusphase ab. HR wird bevorzugt während der S- bis G2-Phasen verwendet, in denen die DNA-Resektion auf höchstem Niveau ist und die Schwesterchromatiden zur Verfügung stehen, um eine ordnungsgemäße Reparatur zu gewährleisten.
Poly (ADP-ribose) Polymerase 1 (PARP-1) ist eines der frühesten Proteine, die für das DSB rekrutiert wurden. Es regelt sowohl die Resektionsaktivität als auch die Montage von nachgeschalteten Effektoren, die am NHEJ5,6 beteiligt sind. PARP-1 wird auch für die Reparatur von DNA-Einzelsträngelbrüchen während der Replikation benötigt7,8. Aufgrund seiner wichtigen Rolle bei der DNA-Reparatur werden PARP-Inhibitoren (PARPi) als Krebstherapien eingesetzt. Bei mehreren HR-defizienten Krebsarten führt die PARPi-Behandlung zu einer synthetischen tödlichen Reaktion aufgrund der Unfähigkeit von HR-defizienten Zellen, den akkumulierten Schaden über einen alternativen Weg zu reparieren9,10. Derzeit gibt es vier von der FDA zugelassene PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib und Talazoparib (auch BMN 673 genannt), die für verschiedene Brust- und Eierstockkrebsbehandlungen eingesetzt werden11. PARPi-Resistenzen sind jedoch häufig, und eine mögliche Ursache entsteht durch den Erneuterwerb von HR-Kenntnissen12. Der Verlust oder die Hemmung von PARP-1 in Gegenwart von Bestrahlung dysreguliert die Resektosom-Maschinerie, was zur Anhäufung längerer ssDNA-Trakte führt13. Daher ist eine eingehende Untersuchung der DNA-Resektion in vivo entscheidend für ein klareres Verständnis der DNA-Reparaturwege und die anschließende Entwicklung neuer Strategien zur Behandlung von Krebs und zur Überwindung der PARPi-Resistenz.
Es wurden mehrere Methoden verwendet, um DNA-Resektionsereignisse nachzuweisen5. Eine solche Methode ist die klassische IF-basierte Technik, die eine indirekte Färbung und Visualisierung der resezierten DNA nach stressinduziertem DSB unter Verwendung eines Anti-RPA-Antikörpers ermöglicht. Die Markierung genomischer DNA mit 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU) und der Nachweis von nur ssDNA ist eine direkte Messung von DNA-Resektionsereignissen. Es umgeht die Überwachung von RPA, die an mehreren zellulären Prozessen wie der DNA-Replikation beteiligt ist. Bei der hier beschriebenen Methode ermöglichen zellen, die mit BrdU für einen einzelnen Zellzyklus inkubiert wurden, dass BrdU in einen Strang der replizierenden zellulären DNA eingebaut wird. Nach der Resektion wird die IF-Färbung unter Bedingungen durchgeführt, die einen BrdU-Nachweis nur in der ssDNA-Form unter Verwendung eines Anti-BrdU-Antikörpers ermöglichen. Dieser Antikörper kann nur auf exponierte BrdU-Nukleotide zugreifen und erkennt keine in doppelsträngige DNA integrierten Nukleotide. Mittels Fluoreszenzmikroskopie kann die resezierte DNA in Form von punktförmigen BrdU/ssDNA-Herden sichtbar gemacht werden. Die Kernintensität dieser Herde kann als Auslesung verwendet werden, um die Resektion nach DNA-Schäden zu quantifizieren. Diese Arbeit beschreibt Schritt für Schritt die Prozesse dieser Methode, die auf die meisten Säugetierzelllinien angewendet werden kann. Diese Methode sollte als einfache Möglichkeit zur Überwachung der DNA-Endresektion in Cellulo als Proof of Concept von großem Nutzen sein.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PARP1 (F1-23)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PCNA (SY12-07)</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-67390</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha tubulin (DM1A)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7291</td>
			<td>1:100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BrdU</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN202</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop X-ray Irradiator</td>
			<td>Cell Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMN673</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-16106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine (BrdU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>V 3.19</td>
			<td>https://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10063542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12 541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td>63x immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>51030408</td>
			<td>37% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>MAG520.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SOD002.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Wisent Bio Products</td>
			<td>311-010-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>15710-S(EM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>P-36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siPARPi</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA control</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholcate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SUC507.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TRS001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trition X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging

Die Untersuchung der DNA-Schadensantwort (DDR) ist ein komplexes und essentielles Feld, das durch den Einsatz von DDR-targeting-Medikamenten zur Krebsbehandlung nur noch wichtiger geworden ist. Diese Ziele sind Poly(ADP-Ribose)-Polymerasen (PARPs), die verschiedene Formen der DNA-Reparatur initiieren. Die Hemmung dieser Enzyme mit PARP-Inhibitoren (PARPi) erreicht eine synthetische Letalität, indem eine therapeutische Verwundbarkeit in homologen Rekombinations- (HR)-defizienten Zellen aufgrund von Mutationen bei Brustkrebs Typ 1 (BRCA1), BRCA2 oder Partner und Lokalisierer von BRCA2 (PALB2) verliehen wird. 
Zellen, die mit PARPi behandelt werden, akkumulieren DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs). Diese Brüche werden von der DNA-Endresektionsmaschinerie verarbeitet, was zur Bildung von einzelsträngiger (ss) DNA und anschließender DNA-Reparatur führt. In einem BRCA1-defizienten Kontext verursacht die Wiederbelebung der DNA-Resektion durch Mutationen in DNA-Resektionsinhibitoren wie 53BP1 und DYNLL1 eine PARPi-Resistenz. Daher ist die Möglichkeit, die DNA-Resektion in Cellulo zu überwachen, entscheidend für ein klareres Verständnis der DNA-Reparaturwege und die Entwicklung neuer Strategien zur Überwindung der PARPi-Resistenz. Immunfluoreszenz (IF)-basierte Techniken ermöglichen die Überwachung der globalen DNA-Resektion nach DNA-Schäden. Diese Strategie erfordert eine langpulsige genomische DNA-Markierung mit 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU). Nach DNA-Schäden und DNA-Endresektion wird die resultierende einzelsträngige DNA von einem Anti-BrdU-Antikörper unter nativen Bedingungen spezifisch nachgewiesen. Darüber hinaus kann die DNA-Resektion auch mit Hilfe von Zellzyklusmarkern untersucht werden, um zwischen verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu unterscheiden. Zellen in der S /G2-Phase ermöglichen die Untersuchung der Endresektion innerhalb der HR, während G1-Zellen zur Untersuchung des nicht-homologen Endzusammenfügens (NHEJ) verwendet werden können. Ein detailliertes Protokoll für diese IF-Methode, gekoppelt an die Zellzyklusunterscheidung, wird in diesem Artikel beschrieben.

In diesem Protokoll wurde der Bromodeoxyuridin (BrdU)-basierte Assay verwendet, um die Resektionsreaktion von HeLa-Zellen auf bestrahlungsinduzierte Schäden quantitativ zu messen. Die erzeugten ssDNA-Spuren werden nach der Immunfluoreszenzfärbung als unterschiedliche Herde visualisiert (Abbildung 1A). Die identifizierten Herde wurden dann quantifiziert und als integrierte Gesamtintensität der BrdU-Färbung in den Kernen ausgedrückt (Abbildung 1B, Erg...

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Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

Im vorliegenden Protokoll demonstrieren wir, wie die DNA-Doppelstrang-Endsektion während der S/G2-Phase des Zellzyklus mit einer immunfluoreszenzbasierten Methode visualisiert werden kann.

Bewertung der globalen DNA-Doppelstrang-Endsektion mittels BrdU-DNA-Markierung in Verbindung mit Cell Cycle Discrimination Imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Cellulo-Quantifizierung von DNA und die Resektion nach DNA-Schäden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Zellzyklusmarkierung, die die Zellen auf die S- und G2-Phase beschränkt und sicherstellt, dass das Bromodeoxyuridin-Signal aus DNA und Resektion resultiert. Das Verfahren wird von Jean-Yves Masson, einem leitenden Forscher, und Sofiane Y.Mersaoui, einem Postdoktoranden, demonstriert.Arbeiten Sie unter einer sterilen Kulturhaube und legen Sie einen einzelnen Deckglas in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte für so viele Bedingungen wie nötig. Platte etwa 150.000 HeLa-Zellen zur Transfektion oder medikamentösen Behandlung. Am dritten Tag, nach der nächtlichen Inkubation mit BrdU in einer Endkonzentration von 10 Mikromol, bestrahlen Sie die Platten mit einer Gesamtdosis von fünf Grau der Röntgenbestrahlung.Nach der Bestrahlung geben Sie die Platten zur Inkubation bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlenoxid befeuchteten Inkubator für drei Stunden zurück. Zur Vorextraktion das Medium absaugen und die Zellen zweimal vorsichtig mit PBS waschen. Nachdem Sie PBS entfernt haben, fügen Sie zwei Milliliter Vorextraktionspuffer A hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für 10 Minuten auf Eis.Nach 10 Minuten Puffer A aspirieren, zwei Milliliter Zytoskelett-Stripping-Puffer B hinzufügen und die Inkubation wiederholen. Dann vorsichtig Puffer B absaugen und die Zellen mit PBS waschen. Nach dem Absaugen von PBS fixieren Sie die Zellen, indem Sie zwei Milliliter von 4% Paraformaldehyd unter die chemische Haube geben.Nach dem Entfernen des Paraformaldehyds und dem Waschen mit PBS die Deckgläser mit 100% kaltem Methanol für die Inkubation bei minus 20 Grad Celsius für fünf Minuten abdecken und die Deckgläser zweimal mit PBS waschen. Zur Permeabilisierung inkubieren Sie die Zellen mit zwei Millilitern PBS, die 0,5% Tritan X-100 bei Raumtemperatur enthalten. Nach 15 Minuten waschen Sie die Deckgläser dreimal mit zwei Millilitern PBS.Für die Immunfärbung fügen Sie jedem Bohrloch zwei Milliliter Blockierungspuffer hinzu. Nach einer Stunde Inkubation 100 Mikroliter primäre Antikörperlösung zu jedem Deckglas geben. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Deckgläser mit quadratischem Parafilm abzudecken, und positionieren Sie den Parafilm sorgfältig, um keine Blasen zu erzeugen.Dann die Platte mit Aluminiumfolie abdecken und den primären Antikörper über Nacht bei vier Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer inkubieren. Entfernen Sie am nächsten Tag die Parafilmquadrate und waschen Sie die Deckgläser dreimal mit zwei Millilitern PBS. Nach dem Waschen werden 100 Mikroliter sekundäre Antikörperlösung auf jeden Deckglas gegeben und die Deckgläser wie gezeigt mit einem Quadrat Parafilm bedeckt.Inkubieren Sie den Sekundärantikörper bei Raumtemperatur für eine Stunde und schützen Sie die Platte mit Folie vor Licht. Anschließend waschen Sie die Deckgläser dreimal mit zwei Millilitern 1X PBS. Für die Kernfärbung fügen Sie zwei Milliliter DAPI-Lösung zu jedem Deckglas hinzu und waschen Sie die Deckgläser mit PBS.Fügen Sie 10 bis 20 Mikroliter ZF-spezifisches Montagemedium auf Objektträger hinzu. Verwenden Sie die Nadel oder eine feine Pinzette, um den Deckglas vom Boden des Brunnens zu heben. Tupfen Sie überschüssige Flüssigkeit vorsichtig ab, indem Sie eine Kante vorsichtig auf ein Papiertuch klopfen und die Deckgläser auf Objektträger montieren.Importieren Sie diese Dateien zur Bilderfassung und -analyse in CellProfiler und analysieren Sie sie mithilfe der Speckle-Zählpipeline. Identifizieren Sie das primäre Objekt, um die Herde anhand der im Textmanuskript beschriebenen Einstellungen zu identifizieren und die Intensität zu messen. Repräsentative Bilder der Bildung von 5-Brom-2-prime-Desoxyuridin-Herden und der proliferierenden Zellkernantigenfärbung nach Bestrahlung sind hier gezeigt.Die erzeugten einzelsträngigen DNA-Spuren wurden als unterschiedliche Herde visualisiert. Die identifizierten Herde wurden dann quantifiziert und als integrierte Gesamtintensität der Bromodeoxyuridin-Färbung in den Kernen exprimiert. Die Co-Färbung zeigte eine Differenzierung zwischen der Kurzstreckenresektion aufgrund einer nicht-homologen Endverbindung und der Langstreckenresektion der homologen Rekombination unter Verwendung eines Anti-PCNA-Antikörpers zur Identifizierung von Zellen, die die S-Phase durchlaufen.PCNA ist im Zellkern prominent und erreicht die maximale Expression während der S-Phase des Zellzyklus mit einer ziemlich intensiven Färbung. Das Ergebnis in Werten wird dann als Streudiagramm dargestellt, um zwischen PCNA-positiven und PCNA-negativen Kernen zu unterscheiden. Die PCNA-negativen Ergebnisse werden aus dem Datensatz entfernt, um eine brdU-intensitätsbasierte Analyse aufgrund des niedrigen BRDU-Signals unabhängig von der Bedingung zu ermöglichen.Die PCNA-negativen Kerne beherbergen eine basal integrierte Intensität von BrdU-Herden von 900 beliebigen Einheiten und dieser Wert erreicht 1.800 AE in PCNA-positiven Kernen. Unter der siRNA-Kontrollbedingung beträgt die integrierte Intensität der BrdU-Herde pro Zellkern etwa 1.500 AE in den PCNA-positiven Kernen. Nach einem effizienten Knockdown von PARP-1 unter Verwendung einer siRNA wurde ein signifikanter Anstieg der Intensität der BrdU-Herde auf etwa 1.900 AE beobachtet.Diese Technik kann wichtige Einblicke in die erste Stufe der homologen Rekombination liefern und so helfen zu erkennen, ob ein Protein am ersten Schritt des Reparaturweges beteiligt ist. Die Inkubationszeit für die Vorextraktionspuffer muss strikt eingehalten werden. Eine übermäßige Exposition gegenüber diesen Puffern führt zu einer übermäßigen Zellablösung und einem erhöhten Hintergrundsignal.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Mess-Exocytose in Neuronen mit FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Forschung

Biologie

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Labeling hESCs und hMSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel für Non-Invasive in vivo-Tracking mit MR-Bildgebung

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis von<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe mit dem Attune Acoustic Fokussierung Cytometer und Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Diskriminierung und Charakterisierung von Heterocellular Populationen mit quantitativen Imaging-Techniken

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...