Name: assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

אנו מודים למארי-כריסטין קארון על העצה הטכנית יוצאת הדופן. עבודה זו נתמכת על ידי מימון של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. מחזיקה ב-Tier 1 Canada Research Chair בתיקון דנ"א וטיפול בסרטן. J.O'S הוא עמית דוקטורט FRQS, ו S.Y.M הוא עמית פוסט דוקטורט FRQS.

1. תרבית תאים, טיפולים והכנת כיסויים
הערה: כל ציפוי התאים, הטרנספקטים והטיפולים, מלבד הקרנה, צריכים להתקיים תחת מכסה מנוע סטרילי של תרבית תאים.
<ol><li>יום 1<ol>
<li>בצלחת של 6 בארות, מניחים כיסוי יחיד בכל באר לכמה שיותר תנאים לפי הצורך. צלחת ~ 150,000 תאי HeLa עבור transfection או טיפול תרופתי, לפ...

<ol>
	<li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response.">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li><li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells.">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes.">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li><li>Ronato, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+the+DNA+double-strand+break+resectosome+for+genome+protection.">Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection.</a> Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1-driven+poly-ADP-ribosylation+regulates+BRCA1+function+in+homologous+recombination-mediated+DNA+repair.">PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair.</a> Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).</li><li>Satoh, M. S., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+poly(ADP-ribose)+formation+in+DNA+repair.">Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair.</a> Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).</li><li>Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP-1+ensures+regulation+of+replication+fork+progression+by+homologous+recombination+on+damaged+DNA.">PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li><li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy.">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li><li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance:+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells.">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li><li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks.">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).</li><li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells.">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).</li><li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage.">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li><li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection.">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li><li>Huertas, P., Cruz-Garc&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+resection+tracks.">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li><li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection.">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li></ol>

מאמר זה מתאר שיטה העושה שימוש בהכתמת IF כדי למדוד וריאציות בכריתת DNA בצלולו. התקן הנוכחי להתבוננות בהשפעה על כריתת DNA הוא באמצעות כתמי RPA; עם זאת, זוהי שיטה עקיפה שעשויה להיות מושפעת משכפול DNA. בעבר תוארה טכניקת IF נוספת המבוססת על התאגדות BrdU לסיווג העוצמות המתקבלות בתאי BrdU-positive ו- BrdU-negative. ...

אפנון של גורמי תיקון DNA היא שיטה המתפתחת ללא הרף לטיפול בסרטן, במיוחד בסביבות גידול לקוי תיקון DSB DNA. עיכוב גורמי תיקון ספציפיים הוא אחת האסטרטגיות הגאוניות המשמשות לרגישות תאים סרטניים לסוכנים מזיקים לדנ"א. עשרות שנים של מחקר הובילו לזיהוי מוטציות שונות של גנים לתיקון DNA כסמנים ביולוגיים לבחירות אסטרטגיה טיפולית1. כתוצאה מכך, תחום תיקון הדנ"א הפך למרכז לפיתוח תרופות כדי להבטיח מגוון רחב של טיפולים, להעצים את מושג הרפואה המותאמת אישית. 
DSBs מתוקנים על ידי שני מסלולים עיקריים: NHEJ ו- HR2. מסלול ה- NHEJ נוטה לשגיאות, קושר במהירות את שני קצות הדנ"א עם עיבוד קצה של דנ"א מועט עד אפסי וכולל את קינאז החלבון (DNA-PKcs), קומפלקס Ku70/80, 53BP1 וחלבוני RIF13. לעומת זאת, משאבי אנוש הוא מנגנון נאמן ביוזמת BRCA14. צעד חיוני בתיקון משאבי אנוש הוא תהליך כריתת קצה ה- DNA, שהוא השפלה של הקצוות השבורים המובילים לדנ"א חד-גדילי (ss) עם קצות 3'-OH. BRCA1 מאפשר את גיוס החלבונים במורד הזרם היוצרים את ה- MRN / RPA / BLM / DNA2 / EXO1, המעורבים בכריתת ה- DNA 5 ' עד 3 '. 
כריתת הקצה הראשונית מתבצעת באמצעות פעילות אנדונוקלאז של MRE11, המאפשר עיבוד נוסף על ידי נוקלאזים DNA2 ו- EXO1. ה- ssDNA overhangs שנוצר מצופים במהירות על ידי חלבון שכפול A (RPA) כדי להגן עליהם מפני עיבוד נוסף. לאחר מכן, BRCA2, PALB2 ו- BRCA1 עוסקים כדי לתווך את העקירה של RPA ואת ההרכבה של גרעין RAD51 הנדרש עבור מנגנון תיקון מונחה הומולוגיה. איזון עדין בין השימוש ב- NHEJ למשאבי אנוש נחוץ לשמירה מיטבית על שלמות גנומית. בחירת המסלול תלויה בשלב מחזור התא. משאבי אנוש משמשים באופן מועדף במהלך שלבי S עד G2 שבהם כריתת DNA היא ברמה הגבוהה ביותר, ואת הכרומטידים האחות זמינים כדי להבטיח תיקון נאות.
פולי (ADP-ריבוז) פולימראז 1 (PARP-1) הוא אחד החלבונים המוקדמים ביותר שגויסו ל- DSB. זה מסדיר הן את פעילות הכריתה ואת ההרכבה של מפעילי במורד הזרם המעורבים NHEJ5,6. PARP-1 נדרש גם עבור DNA חד גדיל תיקון הפסקה תקוע במהלך שכפול7,8. בשל תפקידו החשוב בתיקון DNA, מעכבי PARP (PARPi) משמשים כטיפולים בסרטן. במספר סוגי סרטן לקויי משאבי אנוש, טיפול PARPi מוביל לתגובה קטלנית סינתטית בשל חוסר היכולת של תאים לקויי משאבי אנוש לתקן את הנזק המצטבר באמצעות מסלול חלופי9,10. ישנם כיום ארבעה PARPi שאושרו על ידי ה-FDA: Olaparib, Rucaparib, Niriparib, ו Talazoparib (המכונה גם BMN 673), אשר משמשים לטיפולים שונים בסרטן השד והשחלות11. עם זאת, התנגדות PARPi היא נפוצה, וסיבה פוטנציאלית אחת מתעוררת באמצעות השגת מיומנות משאבי אנוש12. אובדן או עיכוב של PARP-1 בנוכחות dysregulates הקרנה dysregulates המכונות resectosome, המוביל הצטברות של עלונים ssDNA ארוכים יותר13. לכן, מחקר מעמיק של כריתת DNA ב vivo הוא קריטי להבנה ברורה יותר של מסלולי תיקון ה- DNA ופיתוח לאחר מכן של אסטרטגיות חדשות לטיפול בסרטן ולהתגבר על התנגדות PARPi.
היו מספר שיטות שהופעלו כדי לזהות אירועי כריתת דנ"א5. שיטה אחת כזו היא הטכניקה הקלאסית המבוססת על IF המאפשרת כתמים עקיפים והדמיה של ה- DNA החתוך לאחר DSB המושרה בלחץ באמצעות נוגדן אנטי RPA. תיוג דנ"א גנומי עם 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) וגילוי רק ssDNA היא מדידה ישירה של אירועי כריתת DNA. זה עוקף את הניטור של RPA, אשר מעורב בתהליכים תאיים מרובים כגון שכפול DNA. בשיטה המתוארת כאן, תאים המדגרים עם BrdU למחזור תא יחיד מאפשרים ל- BrdU להיות משולב בגדיל אחד של ה- DNA התאי המשכפל. לאחר כריתה, אם כתמים מבוצעים בתנאים המאפשרים שבו גילוי BrdU רק בצורת ssDNA, עם שימוש בנוגדן נגד BrdU. נוגדן זה יכול לגשת רק לנוקלאוטידים חשופים של BrdU ולא יזהה את אלה המשולבים בדנ"א דו-גדילי. באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ניתן לדמיין את ה- DNA החתוך בצורה של מוקדי BrdU / ssDNA לנקב. העוצמה הגרעינית של מוקדים אלה יכולה לשמש כקריאה לכימות כריתה בעקבות נזק לדנ"א. מאמר זה מתאר צעד אחר צעד את התהליכים של שיטה זו, אשר ניתן להחיל על רוב קווי התאים של היונקים. שיטה זו צריכה להיות של תועלת רחבה כדרך פשוטה של ניטור כריתת קצה DNA בצלולו, כהוכחה של מושג.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PARP1 (F1-23)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PCNA (SY12-07)</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-67390</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha tubulin (DM1A)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7291</td>
			<td>1:100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BrdU</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN202</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop X-ray Irradiator</td>
			<td>Cell Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMN673</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-16106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine (BrdU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>V 3.19</td>
			<td>https://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10063542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12 541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td>63x immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>51030408</td>
			<td>37% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>MAG520.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SOD002.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Wisent Bio Products</td>
			<td>311-010-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>15710-S(EM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>P-36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siPARPi</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA control</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholcate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SUC507.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TRS001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trition X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging

המחקר של תגובת נזק ה- DNA (DDR) הוא תחום מורכב וחיוני, אשר רק הפך חשוב יותר בשל השימוש בתרופות ממוקדות DDR לטיפול בסרטן. מטרות אלה הן פולי (ADP-ריבוז) פולימראזים (PARPs), אשר יוזמים צורות שונות של תיקון DNA. עיכוב אנזימים אלה באמצעות מעכבי PARP (PARPi) משיג קטלניות סינתטית על ידי מתן פגיעות טיפולית בתאים רקומבינציה הומולוגית (HR) לקוי עקב מוטציות בסוג סרטן השד 1 (BRCA1), BRCA2, או שותף ולוקליזר של BRCA2 (PALB2). 
תאים שטופלו ב- PARPi צוברים הפסקות דנ"א כפולות גדילים (DSB). הפסקות אלה מעובדות על ידי מכונות כריתת קצה ה- DNA, מה שמוביל להיווצרות DNA חד-גדילי (ss) ותיקון DNA לאחר מכן. בהקשר של מחסור ב-BRCA1, כריתת דנ"א מחודשת באמצעות מוטציות במעכבי כריתת דנ"א, כגון 53BP1 ו-DYNLL1, גורמת להתנגדות PARPi. לכן, היכולת לפקח על כריתת DNA בצלולו היא קריטית להבנה ברורה יותר של מסלולי תיקון ה- DNA ופיתוח אסטרטגיות חדשות כדי להתגבר על התנגדות PARPi. טכניקות מבוססות אימונופלואורסצנטיות (IF) מאפשרות ניטור של כריתת דנ"א גלובלית לאחר נזק לדנ"א. אסטרטגיה זו דורשת תיוג דנ"א גנומי בעל דופק ארוך עם 5-ברומו-2′-deoxyuridine (BrdU). בעקבות נזק לדנ"א וחיתוך קצה דנ"א, הדנ"א החד-גדילי שנוצר מזוהה במיוחד על ידי נוגדן אנטי-BrdU בתנאים מקומיים. יתר על כן, כריתת DNA ניתן גם ללמוד באמצעות סמני מחזור התא כדי להבדיל בין שלבים שונים של מחזור התא. תאים בשלב S/G2 מאפשרים את חקר כריתת הקצה בתוך משאבי אנוש, בעוד שתאי G1 יכולים לשמש לחקר צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ). פרוטוקול מפורט עבור שיטת IF זו בשילוב עם אפליית מחזור תאים מתואר במאמר זה.

בפרוטוקול זה, הבדיקה המבוססת על bromodeoxyuridine (BrdU) שימשה למדידת תגובת כריתה של תאי HeLa לנזק שנגרם על ידי הקרנה. רצועות ה-ssDNA שנוצרו מוצגות באופן חזותי כמוקדיים נפרדים לאחר כתמי אימונופלואורסצנטיות (איור 1A). המוקדים המזוהים כימתו אז ובאו לידי ביטוי כעוצמה המשולבת הכוללת של כתמי BrdU...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים כיצד לדמיין כריתת קצה דו-גדילית של דנ"א במהלך שלב S/G2 של מחזור התא באמצעות שיטה מבוססת אימונופלואורסצנטיות.

הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

פרוטוקול זה מאפשר כימות צלולו של DNA ו כריתה בעקבות נזק DNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא סימון מחזור התא המגביל את התאים לשלב S ו- G2, ומבטיח את תוצאות אות bromodeoxyuridine מ- DNA ו לכריתה. מי שידגימו את ההליך יהיו ז'אן-איב מאסון, חוקר ראשי, וסופיאן י.מרסאווי, חוקרת פוסט-דוקטורט.בעבודה תחת מכסה מנוע תרבות סטרילי, מניחים כיסוי יחיד בכל באר של צלחת שש באר עבור התנאים הרבים הדרושים. צלחת כ 150, 000 תאי HeLa עבור transfection או טיפול תרופתי. ביום השלישי, לאחר הדגירה הלילית עם BrdU בריכוז סופי של 10 מיקרומולר, להקרין את הצלחות עם מנה כוללת של חמישה אפורים של הקרנת רנטגן.לאחר ההקרנה, להחזיר את הצלחות לדגירה ב 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה 5% תחמוצת פחמן במשך שלוש שעות. עבור טרום החילוץ, לשאוף את המדיום בזהירות לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. לאחר הסרת PBS, מוסיפים שני מיליליטרים של מאגר טרום מיצוי A ודגור על התאים בארבע מעלות צלזיוס על קרח במשך 10 דקות.לאחר 10 דקות, שאפו את המאגר A, הוסיפו שני מיליליטרים של חיץ הפשטת ציטוסקלטון B, וחזרו על הדגירה. ואז בזהירות לשאוף חיץ B ולשטוף את התאים עם PBS. לאחר שאיפה PBS, לתקן את התאים על ידי הוספת שני מיליליטר של 4% של paraformaldehyde מתחת למכסה המנוע הכימי.לאחר הסרת paraformaldehyde ושוטף עם PBS, לכסות את כיסוי עם 100% מתנול קר עבור דגירה במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות לשטוף את כיסוי פעמיים עם PBS. עבור חדירות, דגירה התאים עם שני מיליליטרים של PBS המכיל 0.5% טריטן X-100 בטמפרטורת החדר. לאחר 15 דקות, לשטוף את כיסוי שלוש פעמים עם שני מיליליטרים של PBS.עבור חיסון, להוסיף שני מיליליטרים של חוצץ חסימה לכל באר. לאחר שעה אחת של דגירה, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל כיסוי. השתמש פינצטה כדי לכסות את כיסוי עם parafilm מרובע בזהירות למקם את parafilm כדי לא ליצור בועות.לאחר מכן לכסות את הצלחת בנייר אלומיניום ולדגור את הנוגדן העיקרי לילה בארבע מעלות צלזיוס בתא לח. ביום שלמחרת, להסיר את ריבועי parafilm ולשטוף את כיסוי שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS. לאחר הכביסה, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים משנית על כל כיסוי לכסות ולכסות את כיסויים עם ריבוע של parafilm כפי שהוכח.לדגור על הנוגדן המשני בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת ולהגן על הצלחת מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום. ואז לשטוף את כיסוי שלוש פעמים עם שני מיליליטר של 1X PBS. להכתמה גרעינית, הוסיפו שני מיליליטר של תמיסת DAPI לכל כיסוי ושטפו את כיסויי הכיסוי עם PBS.הוסף 10 עד 20 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה ספציפי ל- IF בשקופיות מיקרוסקופ. השתמש במחט או פינצטה עדינה כדי להרים את כיסוי החלק התחתון של הבאר. יש להכתים בזהירות נוזלים עודפים על-ידי הקשה על קצה אחד בעדינות על מגבת נייר ולהרכיב את כיסויי הכיסוי על שקופיות מיקרוסקופ.לרכישה וניתוח של תמונות, יבא קבצים אלה לתוך CellProfiler וניתח אותם באמצעות צינור ספירת כתמים. זהה את האובייקט הראשי כדי לזהות את המוקדים באמצעות ההגדרות המתוארות בכתב היד של הטקסט ומדוד את העוצמה. תמונות מייצגות של 5-bromo-2-prime-deoxyuridine מיקוד היווצרות והתפשטות תאים גרעיניים אנטיגן כתמים לאחר הקרנה מוצגים כאן.עקבות הדנ"א החד-גדיליות שנוצרו נתפסו כמוקדי זיהוי ברורים. המוקדים המזוהים היו אז כימות ובא לידי ביטוי כמו העוצמה המשולבת הכוללת של כתמי bromodeoxyuridine בגרעינים. כתמים משותפים הראו הבחנה בין כריתה לטווח קצר עקב צירוף קצה לא הומולוגי לבין כריתה ארוכת טווח של רקומבינציה הומולוגית באמצעות נוגדן אנטי PCNA כדי לזהות תאים העוברים את שלב ה- S.PCNA בולט בגרעין ומגיע לביטוי מקסימלי במהלך שלב ה- S של מחזור התא עם כתמים עזים למדי. התוצאה בערכים משורטטת לאחר מכן כ- scatterplot כדי להפלות בין גרעינים שליליים PCNA חיובי PCNA ו- PCNA. התוצאות השליליות של PCNA מוסרות מערכת הנתונים כדי לאפשר ניתוח מבוסס עוצמה של BrdU בגלל אות BrdU נמוך ללא קשר למצב.הגרעינים השליליים PCNA מכילים עוצמה משולבת בסיסית של מוקדי BrdU של 900 יחידות שרירותיות וערך זה מגיע ל -1, 800 AU בגרעינים חיוביים של PCNA. במצב בקרת siRNA, העוצמה המשולבת של מוקדי BrdU לכל גרעין היא כ 1, 500 AU בגרעין חיובי PCNA. לאחר נוקאאוט יעיל של PARP-1 באמצעות siRNA, עלייה משמעותית בעוצמת מוקדי BrdU לכ 1, 900 AU נצפתה.טכניקה זו יכולה לספק תובנות מרכזיות על השלב הראשון של רקומבינציה הומולוגית, ובכך לסייע בזיהוי אם חלבון מעורב בשלב הראשון של מסלול התיקון. זמן הדגירה עבור מאגרי טרום החילוץ חייב להישמר בקפדנות. חשיפה יתר למאגרים אלה תגרום לניתוק תאים מוגזם ולאות רקע מוגבר.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

מדידת Exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

תיוג hESCs ו hMSCs עם ברזל אוקסיד חלקיקים עבור פולשני של מעקב vivo עם MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

ניתוח מחזור תא חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות באמצעות התמקדות Cytometer אקוסטית לכוונן וה-DNA ויולט Vybrant DyeCycle כתם

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

אפליה ואפיון אוכלוסיות הטרוסקלריות באמצעות טכניקות הדמיה כמותית

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...