Name: assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00
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हम उत्कृष्ट तकनीकी सलाह के लिए मैरी-क्रिस्टीन कैरन को धन्यवाद देते हैं। यह काम कनाडाई स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान जेवाई.M (CIHR FDN-388879) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित है। J.-Y.M डीएनए मरम्मत और कैंसर चिकित्सीय में एक टियर 1 कनाडा अनुसंधान कुर्सी रखती है। J.O'S एक FRQS पीएचडी छात्र साथी है, और S.Y.M एक FRQS पोस्टडॉक्टोरल फेलो है।

1. सेल संस्कृति, उपचार, और coverslip तैयारी
नोट: सभी सेल चढ़ाना, transfections, और उपचार, विकिरण से अलग, एक बाँझ सेल संस्कृति हुड के तहत जगह ले जाना चाहिए.
<ol><li>दिन 1<ol>
<li>एक 6-अच्छी तरह से प्लेट में, आवश्यकतानुसार कई स?...

<ol>
	<li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response.">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li><li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells.">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes.">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li><li>Ronato, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+the+DNA+double-strand+break+resectosome+for+genome+protection.">Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection.</a> Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1-driven+poly-ADP-ribosylation+regulates+BRCA1+function+in+homologous+recombination-mediated+DNA+repair.">PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair.</a> Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).</li><li>Satoh, M. S., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+poly(ADP-ribose)+formation+in+DNA+repair.">Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair.</a> Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).</li><li>Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP-1+ensures+regulation+of+replication+fork+progression+by+homologous+recombination+on+damaged+DNA.">PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li><li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy.">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li><li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance:+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells.">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li><li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks.">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).</li><li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells.">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).</li><li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage.">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li><li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection.">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li><li>Huertas, P., Cruz-Garc&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+resection+tracks.">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li><li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection.">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li></ol>

यह पेपर एक ऐसी विधि का वर्णन करता है जो सेल्युलो में डीएनए लकीर में भिन्नताओं को मापने के लिए आईएफ स्टेनिंग का उपयोग करता है। डीएनए लकीर पर प्रभाव को देखने के लिए वर्तमान मानक आरपीए धुंधला के माध्यम ...

डीएनए मरम्मत कारकों का मॉडुलन कैंसर थेरेपी के लिए एक कभी-विकसित विधि है, विशेष रूप से डीएनए डीएसबी मरम्मत-कमी वाले ट्यूमर वातावरण में। विशिष्ट मरम्मत कारकों का निषेध डीएनए-हानिकारक एजेंटों के लिए कैंसर कोशिकाओं को संवेदनशील बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली सरल रणनीतियों में से एक है। अनुसंधान के दशकों ने चिकित्सीय रणनीति विकल्पों के लिए बायोमार्कर के रूप में डीएनए मरम्मत जीन के विभिन्न उत्परिवर्तनों की पहचान की। नतीजतन, डीएनए मरम्मत क्षेत्र व्यक्तिगत चिकित्सा अवधारणा को सशक्त बनाने के लिए उपचार की एक विस्तृत श्रृंखला सुनिश्चित करने के लिए दवा के विकास के लिए एक केंद्र बन गया है। 
डीएसबी की मरम्मत दो मुख्य मार्गों द्वारा की जाती है: एनएचईजे और एचआर 2। एनएचईजे मार्ग त्रुटि-प्रवण है, तेजी से दो डीएनए सिरों को बिना किसी डीएनए अंत-प्रसंस्करण के साथ लिगेटिंग करता है और इसमें प्रोटीन किनेज (डीएनए-पीकेसी), Ku70/80 कॉम्प्लेक्स, 53BP1 और RIF1 प्रोटीन 3 शामिल होते हैं। इसके विपरीत, एचआर बीआरसीए 14 द्वारा शुरू किया गया एक वफादार तंत्र है। एचआर मरम्मत में एक आवश्यक कदम डीएनए-एंड लकीर प्रक्रिया है, जो टूटे हुए सिरों की गिरावट है जो 3'-OH सिरों के साथ एकल-फंसे (एसएस) डीएनए के लिए अग्रणी है। BRCA1 डाउनस्ट्रीम प्रोटीन की भर्ती की सुविधा प्रदान करता है जो resectosome MRN / RPA / BLM / DNA2 / EXO1 बनाते हैं, जो 5 'से 3' डीएनए लकीर 5 में शामिल होते हैं। 
प्रारंभिक अंत-लकीर को MRE11 की एंडोन्यूक्लिएज गतिविधि के माध्यम से पूरा किया जाता है, जिससे DNA2 और EXO1 न्यूक्लिएज द्वारा आगे के प्रसंस्करण की अनुमति मिलती है। उत्पन्न ssDNA overhangs जल्दी से प्रतिकृति प्रोटीन ए (आरपीए) द्वारा लेपित कर रहे हैं उन्हें आगे प्रसंस्करण से बचाने के लिए. इसके बाद, BRCA2, PALB2, और BRCA1 आरपीए के विस्थापन और होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत तंत्र के लिए आवश्यक RAD51 न्यूक्लियोफिलामेंट की असेंबली की मध्यस्थता करने के लिए संलग्न हैं। जीनोमिक अखंडता के इष्टतम रखरखाव के लिए एनएचईजे और एचआर के उपयोग के बीच एक ठीक संतुलन आवश्यक है। मार्ग विकल्प सेल चक्र चरण पर निर्भर करता है। एचआर का उपयोग एस से जी 2 चरणों के दौरान प्राथमिकता से किया जाता है जिसमें डीएनए लकीर उच्चतम स्तर पर होती है, और उचित मरम्मत सुनिश्चित करने के लिए बहन क्रोमैटिड उपलब्ध होते हैं।
पॉली (ADP-ribose) पोलीमरेज़ 1 (PARP-1) DSB में भर्ती किए गए शुरुआती प्रोटीनों में से एक है। यह लकीर गतिविधि और NHEJ5,6 में शामिल डाउनस्ट्रीम प्रभावकों की असेंबली दोनों को नियंत्रित करता है। PARP-1 भी प्रतिकृति 7,8 के दौरान डीएनए एकल फंसे हुए ब्रेक मरम्मत के लिए आवश्यक है। डीएनए मरम्मत में इसकी महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, PARP अवरोधकों (PARPi) का उपयोग कैंसर उपचार के रूप में किया जाता है। कई एचआर-कमी वाले कैंसर में, PARPi उपचार एक वैकल्पिक मार्ग 9,10 के माध्यम से संचित क्षति की मरम्मत के लिए एचआर-कमी वाली कोशिकाओं की अक्षमता के कारण एक सिंथेटिक घातक प्रतिक्रिया की ओर जाता है। वर्तमान में चार एफडीए द्वारा अनुमोदित PARPi हैं: Olaparib, Rucaparib, Niriparib, और Talazoparib (जिसे BMN 673 भी कहा जाता है), जिनका उपयोग विभिन्न स्तन और डिम्बग्रंथि के कैंसर के उपचार के लिए किया जाता है। हालांकि, PARPi प्रतिरोध आम है, और एक संभावित कारण मानव संसाधन प्रवीणता 12 की पुन: अधिग्रहण के माध्यम से उत्पन्न होता है। विकिरण की उपस्थिति में PARP-1 का नुकसान या निषेध resectosome मशीनरी को डिस्रेगुलेट करता है, जिससे लंबे समय तक ssDNA tracts13 का संचय होता है। इसलिए, विवो में डीएनए लकीर का एक गहन अध्ययन डीएनए मरम्मत मार्गों की स्पष्ट समझ और कैंसर के इलाज के लिए नई रणनीतियों के बाद के विकास और PARPi प्रतिरोध को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है।
डीएनए लकीर की घटनाओं का पता लगाने के लिए कई तरीकों को नियोजित किया गया है5। ऐसी ही एक विधि शास्त्रीय आईएफ-आधारित तकनीक है जो एंटी-आरपीए एंटीबॉडी का उपयोग करके तनाव-प्रेरित डीएसबी के बाद अप्रत्यक्ष धुंधला और उच्छेदित डीएनए के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अनुमति देती है। 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) के साथ जीनोमिक डीएनए लेबलिंग और केवल ssDNA का पता लगाना डीएनए लकीर की घटनाओं का एक सीधा माप है। यह आरपीए की निगरानी को दरकिनार करता है, जो डीएनए प्रतिकृति जैसे कई सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल है। यहां वर्णित विधि में, एक एकल सेल चक्र के लिए बीआरडीयू के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाएं बीआरडीयू को प्रतिकृति सेलुलर डीएनए के एक स्ट्रैंड में शामिल करने की अनुमति देती हैं। लकीर के बाद, IF धुंधला उन परिस्थितियों के तहत किया जाता है जिनमें BrdU का पता लगाने की अनुमति केवल ssDNA रूप में होती है, जिसमें एंटी-BrdU एंटीबॉडी के उपयोग के साथ। यह एंटीबॉडी केवल उजागर बीआरडीयू न्यूक्लियोटाइड्स तक पहुंच सकती है और डबल-फंसे डीएनए में एकीकृत लोगों का पता नहीं लगाएगी। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए, उच्छेदित डीएनए को पंक्टेट बीआरडीयू / एसएसडीएनए फोकी के रूप में देखा जा सकता है। डीएनए क्षति के बाद लकीर को मापने के लिए इन फोकी की परमाणु तीव्रता का उपयोग रीडआउट के रूप में किया जा सकता है। यह पेपर इस विधि की प्रक्रियाओं को चरण-दर-चरण वर्णन करता है, जिसे अधिकांश स्तनधारी सेल लाइनों पर लागू किया जा सकता है। यह विधि अवधारणा के प्रमाण के रूप में सेल्युलो में डीएनए अंत लकीर की निगरानी के एक सरल तरीके के रूप में व्यापक उपयोगिता की होनी चाहिए।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PARP1 (F1-23)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PCNA (SY12-07)</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-67390</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha tubulin (DM1A)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7291</td>
			<td>1:100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BrdU</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN202</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop X-ray Irradiator</td>
			<td>Cell Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMN673</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-16106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine (BrdU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>V 3.19</td>
			<td>https://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10063542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12 541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td>63x immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>51030408</td>
			<td>37% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>MAG520.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SOD002.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Wisent Bio Products</td>
			<td>311-010-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>15710-S(EM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>P-36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siPARPi</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA control</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholcate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SUC507.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TRS001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trition X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging

डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) का अध्ययन एक जटिल और आवश्यक क्षेत्र है, जो केवल कैंसर के उपचार के लिए डीडीआर-लक्ष्यीकरण दवाओं के उपयोग के कारण अधिक महत्वपूर्ण हो गया है। ये लक्ष्य पॉली (एडीपी-राइबोस) पोलीमरेज़ (पीएआरपी) हैं, जो डीएनए मरम्मत के विभिन्न रूपों को शुरू करते हैं। PARP inhibitors (PARPi) का उपयोग करके इन एंजाइमों को बाधित करना सजातीय पुनर्संयोजन (एचआर) में एक चिकित्सीय भेद्यता प्रदान करके सिंथेटिक घातकता प्राप्त करता है - स्तन कैंसर टाइप 1 (BRCA1), BRCA2, या BRCA2 (PALB2) के साथी और स्थानीयकरण में उत्परिवर्तन के कारण कोशिकाओं की कमी। 
PARPi के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाएं डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (DSBs) जमा करती हैं। इन ब्रेकों को डीएनए एंड लकीर मशीनरी द्वारा संसाधित किया जाता है, जिससे एकल-फंसे हुए (एसएस) डीएनए और बाद में डीएनए मरम्मत का गठन होता है। एक BRCA1-कमी वाले संदर्भ में, डीएनए लकीर अवरोधकों में उत्परिवर्तन के माध्यम से डीएनए लकीर को पुनर्जीवित करना, जैसे कि 53BP1 और DYNLL1, PARPi प्रतिरोध का कारण बनता है। इसलिए, सेल्युलो में डीएनए लकीर की निगरानी करने में सक्षम होने के नाते डीएनए मरम्मत मार्गों की स्पष्ट समझ और PARPi प्रतिरोध को दूर करने के लिए नई रणनीतियों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। Immunofluorescence (IF) -आधारित तकनीकें डीएनए क्षति के बाद वैश्विक डीएनए लकीर की निगरानी के लिए अनुमति देती हैं। इस रणनीति के लिए 5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सीयूरिडिन (बीआरडीयू) के साथ लंबी नाड़ी जीनोमिक डीएनए लेबलिंग की आवश्यकता होती है। डीएनए क्षति और डीएनए अंत लकीर के बाद, परिणामी एकल-फंसे हुए डीएनए को विशेष रूप से देशी परिस्थितियों में एंटी-बीआरडीयू एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जाता है। इसके अलावा, कोशिका चक्र के विभिन्न चरणों के बीच अंतर करने के लिए सेल चक्र मार्करों का उपयोग करके डीएनए लकीर का भी अध्ययन किया जा सकता है। एस / जी 2 चरण में कोशिकाएं एचआर के भीतर अंत लकीर के अध्ययन की अनुमति देती हैं, जबकि जी 1 कोशिकाओं का उपयोग गैर-होमोलोगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे) का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इस IF विधि के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल सेल चक्र भेदभाव के लिए युग्मित इस पेपर में वर्णित है।

इस प्रोटोकॉल में, bromodeoxyuridine (BrdU) -आधारित परख मात्रात्मक विकिरण प्रेरित क्षति के लिए HeLa कोशिकाओं की लकीर प्रतिक्रिया को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था। उत्पन्न ssDNA पटरियों immunofluorescence धुंधला (चित्रा 1A</stron...

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Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम प्रदर्शित करते हैं कि एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस-आधारित विधि का उपयोग करके सेल चक्र के एस / जी 2 चरण के दौरान डीएनए डबल-स्ट्रैंड एंड लकीर की कल्पना कैसे करें।

सेल चक्र भेदभाव इमेजिंग के साथ युग्मित BrdU-डीएनए लेबलिंग का उपयोग कर वैश्विक डीएनए डबल स्ट्रैंड एंड लकीर का आकलन

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

यह प्रोटोकॉल डीएनए क्षति के बाद डीएनए और लकीर के सेल्युलो परिमाणीकरण में अनुमति देता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ सेल चक्र अंकन है जो कोशिकाओं को एस और जी 2 चरण तक सीमित करता है, डीएनए और लकीर से ब्रोमोडेओक्सीयूरिडिन सिग्नल परिणामों को सुनिश्चित करता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन जीन-Yves Masson, एक प्रमुख अन्वेषक, और Sofiane Y.Mersaoui, एक पोस्ट डॉक्टरेट शोधकर्ता होगा।एक बाँझ संस्कृति हुड के तहत काम करते हुए, छह-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक एकल कवरस्लिप रखें क्योंकि कई शर्तों की आवश्यकता होती है। प्लेट लगभग 150, 000 हेला कोशिकाओं के अभिकर्मक या दवा उपचार के लिए। तीसरे दिन, 10 माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता पर बीआरडीयू के साथ रात भर के इनक्यूबेशन के बाद, एक्स-रे विकिरण के पांच ग्रे की कुल खुराक के साथ प्लेटों को विकिरणित करें।विकिरण के बाद, तीन घंटे के लिए 5% कार्बन ऑक्साइड ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के लिए प्लेटों को वापस करें। पूर्व-निष्कर्षण के लिए, माध्यम को एस्पिरेट करें और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार सावधानीपूर्वक धोएं। पीबीएस को हटाने के बाद, पूर्व-निष्कर्षण बफर ए के दो मिलीलीटर जोड़ें और 10 मिनट के लिए बर्फ पर चार डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।10 मिनट के बाद, एस्पिरेट बफर ए, साइटोस्केलेटन स्ट्रिपिंग बफर बी के दो मिलीलीटर जोड़ें, और इनक्यूबेशन को दोहराएं। फिर ध्यान से aspirate बफर बी और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने. पीबीएस को एस्पिरेट करने के बाद, रासायनिक हुड के तहत पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 4% के दो मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें।पैराफॉर्मेल्डिहाइड को हटाने और पीबीएस के साथ धोने के बाद, पांच मिनट के लिए माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के लिए 100% ठंडे मेथनॉल के साथ कवरलिप्स को कवर करें और पीबीएस के साथ दो बार कवरस्लिप को धोएं। Permeabilization के लिए, कमरे के तापमान पर 0.5% Tritan X-100 युक्त PBS के दो milliliters के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। 15 मिनट के बाद, कवरलिप्स को पीबीएस के दो मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं।इम्युनोस्टेनिंग के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से बफर को अवरुद्ध करने के दो मिलीलीटर जोड़ें। इनक्यूबेशन के एक घंटे के बाद, प्रत्येक कवरस्लिप में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। वर्ग पैराफिल्म के साथ coverslips को कवर करने के लिए चिमटी का उपयोग करें और ध्यान से बुलबुले नहीं बनाने के लिए parafilm स्थिति.फिर प्लेट को एल्यूमीनियम पन्नी में कवर करें और प्राथमिक एंटीबॉडी को एक ह्यूमिडिफाइड चैंबर में चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, पैराफिल्म वर्गों को हटा दें और पीबीएस के दो मिलीलीटर के साथ कवरलिप्स को तीन बार धोएं। धोने के बाद, प्रत्येक कवरस्लिप पर द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और पैराफिल्म के एक वर्ग के साथ कवरलिप्स को कवर करें जैसा कि प्रदर्शित किया गया है।एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर द्वितीयक एंटीबॉडी को इनक्यूबेट करें और पन्नी का उपयोग करके प्लेट को प्रकाश से बचाएं। फिर 1X PBS के दो मिलीलीटर के साथ कवरलिप्स को तीन बार धोएं। परमाणु धुंधला करने के लिए, प्रत्येक कवरस्लिप में डीएपीआई समाधान के दो मिलीलीटर जोड़ें और पीबीएस के साथ कवरलिप्स को धोएं।माइक्रोस्कोप स्लाइड पर IF-विशिष्ट बढ़ते माध्यम के 10 से 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। कुएं के नीचे से कवरस्लिप उठाने के लिए सुई या ठीक चिमटी का उपयोग करें। ध्यान से एक कागज तौलिया पर धीरे से एक किनारे दोहन द्वारा अतिरिक्त तरल बंद धब्बा और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर coverslips माउंट.छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए, इन फ़ाइलों को CellProfiler में आयात करें और धब्बेदार गिनती पाइपलाइन का उपयोग करके उनका विश्लेषण करें। पाठ पांडुलिपि में वर्णित सेटिंग्स का उपयोग करके फोकी की पहचान करने और तीव्रता को मापने के लिए प्राथमिक ऑब्जेक्ट की पहचान करें। 5-bromo-2-prime-deoxyuridine foci गठन और विकिरण के बाद सेल परमाणु एंटीजन धुंधला proliferating की प्रतिनिधि छवियों को यहां दिखाया गया है।उत्पन्न एकल-फंसे डीएनए पटरियों को अलग-अलग फोकी के रूप में देखा गया था। तब पहचाने गए फोकी को परिमाणित किया गया था और नाभिक में ब्रोमोडेऑक्सीयूरिडीन स्टेनिंग की कुल एकीकृत तीव्रता के रूप में व्यक्त किया गया था। सह-धुंधला ने गैर-होमोलोगस एंड जॉइनिंग के कारण छोटी दूरी की लकीर के बीच भेदभाव दिखाया और एस चरण के माध्यम से जाने वाली कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एंटी-पीसीएनए एंटीबॉडी का उपयोग करके होमोलॉगस पुनर्संयोजन की लंबी दूरी की लकीर।PCNA नाभिक में प्रमुख है और काफी तीव्र धुंधला के साथ सेल चक्र के एस चरण के दौरान अधिकतम अभिव्यक्ति तक पहुंचता है। मूल्यों में परिणाम तो PCNA सकारात्मक और PCNA नकारात्मक नाभिक के बीच भेदभाव करने के लिए एक स्कैटरप्लॉट के रूप में प्लॉट किए जाते हैं। PCNA नकारात्मक परिणामों को डेटासेट से हटा दिया जाता है ताकि BrdU तीव्रता-आधारित विश्लेषण के लिए अनुमति दी जा सके क्योंकि स्थिति की परवाह किए बिना कम BrdU सिग्नल की परवाह किए बिना।PCNA नकारात्मक नाभिक 900 मनमाने ढंग से इकाइयों के BrdU foci की एक बेसल एकीकृत तीव्रता बंदरगाह और यह मान PCNA सकारात्मक नाभिक में 1, 800 AU तक पहुँचता है। siRNA नियंत्रण की स्थिति में, प्रति नाभिक BrdU foci की एकीकृत तीव्रता PCNA सकारात्मक नाभिक में लगभग 1, 500 AU है। एक siRNA का उपयोग करके PARP-1 के एक कुशल नॉकडाउन के बाद, लगभग 1, 900 AU के लिए BrdU foci की तीव्रता में एक महत्वपूर्ण वृद्धि देखी गई थी।यह तकनीक होमोलोगस पुनर्संयोजन के पहले चरण में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, इस प्रकार यह पहचानने में मदद करती है कि क्या एक प्रोटीन मरम्मत मार्ग के पहले चरण में शामिल है। पूर्व निष्कर्षण buffers के लिए इनक्यूबेशन समय सख्ती से रखा जाना चाहिए। इन buffers के लिए अधिक जोखिम अत्यधिक सेल टुकड़ी और पृष्ठभूमि संकेत में वृद्धि होगी में परिणाम होगा.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

एफएम लेबल का प्रयोग न्यूरॉन्स में exocytosis माप

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

आयरन ऑक्साइड के साथ hESCs और hMSCs लेबल vivo में ट्रैकिंग में गैर इनवेसिव के लिए एमआर इमेजिंग नैनोकणों के साथ

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

गैर इनवेसिव पता लगाने के लिए प्रतिदीप्त रंगों के साथ ऑप्टिकल इमेजिंग के साथ स्टेम सेल लेबल

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए डबल कतरा तोड़ मरम्मत (DSB) के विश्लेषण

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित पेप्टाइड Immunoaffinity संवर्धन का उपयोग प्रोटीन की मात्रा का ठहराव

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

मेटाबोलिक लेबल और फ्लो के साथ कोशिका चक्र प्रगति कैनेटीक्स मापने

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

का लाइव सेल चक्र विश्लेषण<em&gt; ड्रोसोफिला</emAttune ध्वनिक केंद्रित cytometer और Vybrant DyeCycle वायलेट डीएनए दाग का उपयोग कर&gt; टिश्यूज

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Ratiometric bimolecular संकेतकों का उपयोग जीवित कोशिकाओं में एकल इंजीनियर शाही सेना टेप के वास्तविक समय इमेजिंग

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

क्वांटिटेटिकल इमेजिंग तकनीकों का प्रयोग करके हिटरोकेल्लुलर जनसंख्या के भेदभाव और लक्षण वर्णन

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...